異喹啉類生物堿與鳥嘌呤-鳥嘌呤-腺嘌呤型三鏈DNA相互作用的質譜與光譜學研究

關鍵詞鳥嘌呤-鳥嘌呤-腺嘌呤型三鏈DNA；生物堿；質譜法；紫外可見光譜；熒光光譜；圓二色光譜

三鏈DNA分子是由第三條寡聚脫氧核苷酸（Triplex-formingoligonucleotides，TFOs）的堿基通過Hoogsteen氫鍵配對的方式結合在雙螺旋DNA結構的大溝區而成，在體內和體外均可形成[1]。三鏈DNA可以抑制DNA轉錄和復制，產生位點專屬的突變，通過斷裂DNA誘導同源重組[2-3]，在納米尺度的材料工程、治療學、基因診斷學和其它一些領域中具有很大的應用潛力[4-5]。基于第三條鏈的起源，三鏈DNA可以分為分子間三鏈DNA、分子內三鏈DNA和G-三鏈DNA等[1，6]。根據三鏈DNA的組成和取向，分子間三鏈DNA可以分為3類：胸腺嘧啶-胞嘧啶（Thymidine-cytocine，TC）型三鏈DNA、鳥嘌呤-胸腺嘧啶（Guanine-thymidine，GT）型三鏈DNA和鳥嘌呤-腺嘧啶（Guanine-adenine，GA）型三鏈DNA[1]。

研究者已對三鏈DNA作為基因療法進行了很多研究，但由于三鏈結構的熱穩定性和TFOs的細胞攝取率均較差，研究進展緩慢。如何提高三鏈DNA在生理條件下的穩定性一直是三鏈DNA領域的研究熱點。常規研究策略有兩種：（1）對TFOs進行化學修飾，包括堿基修飾、磷酸骨架修飾和糖配體修飾；（2）利用小分子與三鏈DNA形成非共價復合物[7-8]。

生物堿是中草藥中重要的有效成分，具有抗乳腺癌、抗結腸癌和抗非小細胞肺癌等多種抗腫瘤生物活性[9]。近年來，異喹啉生物堿在腫瘤治療方面的應用潛力備受關注。異喹啉生物堿通過觸發細胞死亡、降低促生存蛋白表達、誘導ROS產生和抑制促生存細胞信號通路等方式展示其抗腫瘤效果；同時，異喹啉生物堿還具有良好的抗炎和鎮痛效果[10]。DNA和RNA一直被認為是發揮抗癌作用的靶標。異喹啉類生物堿與三鏈DNA主要通過插入結合模式相互作用，例如，小檗堿和甲氧檗具有誘導和穩定DNA三聯體結構的能力，能夠抑制端粒酶和拓撲異構酶活性，因此可成為潛在的抗癌藥物[11-12]。目前，研究DNA-小分子配體相互作用的方法包括電噴霧電離質譜法（ESI-MS）、紫外-可見（UV-vis）光譜法、熒光光譜法和圓二色（CD）光譜法等[13-14]。一級全掃描質譜不僅能夠快速確定配體是否與DNA結合，還可直接得到絡合物的化學計量比，可用于評價配體與DNA結合的親和力和選擇性[15]。通常，紫外可見吸收光譜中的減色效應表明小分子與DNA以經典插入模式結合[16]，而增色效應表明小分子通過靜電吸引與DNA結合[17]。配體本身的熒光或熒光探針試劑與DNA結合后的熒光可用于研究小分子與三鏈DNA的相互作用[18-19]。常用的熒光探針溴化乙錠（EB）是一種典型的DNA插入劑，幾乎不具有穩定三鏈DNA的作用[20]，可用于研究小分子與三鏈DNA是否具有插入結合作用。CD光譜法在DNA領域廣泛應用，小分子配體與DNA作用后，會使DNA的構象發生變化，因此，可通過小分子配體和DNA堿基的電子躍遷偶極矩間偶合產生的信號測定結合模式[21]。

本研究組在前期工作中利用超高效液相色譜-質譜法、ESI-MS、紫外光譜、熒光分析和CD光譜法研究了生物堿類小分子與TC和TTT型三鏈DNA的相互作用，發現DNA的序列和小分子的結構對結合模式都有明顯影響[22-24]。本研究利用質譜法結合光譜學方法對異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的結合方式進行了研究，探討了生物堿類小分子和三鏈DNA的相互作用機理，為進一步研究具有生物活性的黃酮類藥效小分子的藥用機理及新型藥物的設計提供了參考。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

LTQ-XL線性離子阱質譜儀（美國Thermo公司），配有電噴霧（ESI）離子源及Xcalibur2.2數據處理系統；UV-1102ii紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司），配備通道長度為1cm的石英比色容器；MOS-450圓二色光譜偏振儀（法國Bio-Logic公司）；安捷倫1100FLD熒光光譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

黃連堿、藥根堿、表小檗堿、非洲防己堿、小檗紅堿、防己諾林堿和粉防己堿標準品（中國食品藥品檢定研究院）；3條寡聚脫氧核苷酸分子5′-CTCCTCCTCCTCC-3′（CCT，SY）、5′-GGAGGAGGAGGAG-3′（GGA，SR）和5′-GAGGAGGAGGAGG-3′（GGA）（大連寶生物工程有限公司）；EB標準品（美國Sigma公司）；氯化銅、氯化鋅和氯化鎳（上海阿拉丁生化科技有限公司）；氯化鈷（上海麥克林生化有限公司）；氯化錳和氯化鎂（天津市大茂化學試劑廠）；醋酸銨（美國Fluka公司）；甲醇（色譜級，美國Fisher公司）。實驗用水為超純水（長春萊博帕特科技發展有限公司超純水機制備，18.25MΩ·cm）。

1.2實驗方法

1.2.1三鏈DNA的退火制備

3條單鏈DNA按摩爾比為1∶1∶1在150mmol/L乙酸-乙酸銨溶液（pH6.8）中混合，在加入或不加入1mmol/L二價金屬離子的情況下，于90℃加熱10min，然后緩慢冷卻到室溫，過夜，退火，分別制備100μmol/L三鏈DNA儲備液，置于–20℃，待測。

1.2.2電噴霧質譜（ESI-MS）條件

采用25mmol/L乙酸-乙酸銨（pH6.8）/甲醇（80∶20，V/V）將三鏈DNA和小分子稀釋，然后將小分子和三鏈DNA按摩爾比為2∶1混合，使小分子終濃度為20μmol/L，三鏈DNA終濃度為10μmol/L。所有樣品均采用直接進樣方式，蠕動泵流速為8L/min，透鏡電壓為–180V，噴霧電壓為3.6kV，氮氣作為鞘氣和輔助氣，流速分別為55和85L/h。所有數據均在負離子模式下掃描，毛細管溫度為250℃。

1.2.3紫外可見吸收光譜與紫外熱變性實驗條件

采用50mmol/L乙酸-乙酸銨醋酸銨溶液（pH6.8）將三鏈核酸儲備液稀釋到0.8μmol/L，7種生物堿類小分子稀釋到1.6μmol/L，在200～450nm的波長范圍內測定其吸光度。對于熱變性實驗，升溫范圍為20～75℃，升溫速率為1℃/min。在260nm處測量樣品的紫外吸光度，得到吸光度-溫度曲線。熔解溫度（Meltingtemperature，Tm）由吸光度-溫度曲線的導數圖得到。

1.2.4熒光光譜法條件

在激發波長為520nm、發射波長為604.5nm的條件下，固定熒光滴定猝滅實驗中EB濃度為3μmol/L（溶解于150mmol/L乙酸-乙酸銨溶液（pH6.8）），不斷滴入三鏈DNA溶液，同時加入適量EB溶液，保證其濃度不變，直到熒光強度不再增加，此時三鏈DNA溶液濃度的一半為實驗所需濃度。在建立的熒光猝滅方法的基礎上，將不同濃度的藥物溶液不斷滴入熒光猝滅體系中，同時加入適量的EB和三鏈DNA，以保證EB-DNA體系濃度不變。

1.2.5圓二色光譜法條件

采用20mmol/L乙酸-乙酸銨（pH6.8）溶液將三鏈核酸儲備液稀釋到20μmol/L，置于1mm微量石英池中，待測。設定掃描波長為200～320nm，掃描速度為200nm/min。譜圖為3次掃描的平均值，并且已經扣除了緩沖溶液的背景值。

2結果與討論

2.1ESI-MS檢測異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的結合強度

在未加入金屬離子的3條單鏈DNA溶液退火后的質譜圖（電子版文后支持信息圖S1A）中，只檢測到對應于單鏈（m/z1037.64和m/z1251.65）、W-C雙鏈（m/z1581.53和m/z1660.53）和同型二聚體的譜峰（m/z1383.83），未檢測到GGA型三鏈DNA離子。在金屬離子中，堿土金屬Mg2+與三鏈核酸的相互作用研究最廣泛，能穩定d（C）nd（G）nd（G）n三鏈核酸[25-26]。為了考察金屬離子對GGA型三鏈DNA穩定性的影響，將堿土金屬Mg2+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+和Ni2+分別加入到3條單鏈寡核苷酸的混合溶液中一起退火。將退火后的混合溶液進行ESIMS分析，發現上述金屬離子與GGA型三鏈DNA復合物的相對豐度分別為0%、5%、14%、13%、16%和19%。由此可見，金屬離子穩定GGA型三鏈DNA的能力順序為Ni2+gt;Zn2+gt;Cu2+gt;Co2+gt;Mn2+gt;Mg2+。相較于堿土金屬Mg2+，過渡金屬Ni2+和Zn2+等對嘌呤的N7位具有更高的親和力[25，27]，這使得DNA構象縮攏程度增強，甚至產生縮合，因此能更有效地促進GGA型三鏈核酸的形成。其中，Ni2+與GGA型三鏈DNA的結合力最強，因此，本研究在Ni2+存在條件下研究7種生物堿類小分子與GGA型三鏈DNA的結合能力。

在質譜圖中，除了檢測到了單鏈和雙鏈DNA與Ni2+的復合物，還檢測到了三鏈DNA與Ni2+及小分子的復合物，其中，m/z1814.24為[T+5Ni+黃連堿]7–（見電子版文后支持信息圖S1B），m/z1589.74和1817.12分別為[T+5Ni+藥根堿]8–和[T+5Ni+藥根堿]7–（見電子版文后支持信息圖S1C），m/z1811.16為[T+5Ni+表小檗堿]7–（見電子版文后支持信息圖S1D），m/z1814.20為[T+5Ni+小檗紅堿]7–離子（電子版文后支持信息圖S1E），m/z1577.57為[T+4Ni+非洲防己堿]8–（見電子版文后支持信息圖S1F），m/z1850.06為[T+5Ni+防己諾林堿]7–（見電子版文后支持信息圖S1G），m/z1620.20和1852.32分別為[T+5Ni+粉防己堿]8–和[T+5Ni+粉防己堿]7–（見電子版文后支持信息圖S1H）。本研究結果表明，7種生物堿類小分子與GGA型三鏈DNA結合強度的順序為：粉防己堿gt;表小檗堿≈非洲防己堿gt;黃連堿gt;防己諾林堿gt;藥根堿gt;小檗紅堿（圖1）。此外，GGA型三鏈核酸與小分子的復合物峰，無論是形成7電荷還是8電荷的離子，均為其與5個Ni2+的加合峰。因此，異喹啉類生物堿均可與GGA型三鏈核酸相互作用，其中粉防己堿的結合強度最強。

2.2紫外可見光譜法分析異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的相互作用

在1μmol/LGGA型三鏈DNA溶液中加入2μmol/L異喹啉類生物堿小分子后，其紫外吸光度的變化如圖2所示，其中，黃連堿（圖2A）、藥根堿（圖2B）、小檗紅堿（圖2D）和非洲防己堿（圖2E）與GGA型三鏈DNA結合后最大吸收強度增大，說明這4種小分子通過靜電結合到DNA骨架的磷酸基團，使DNA互補堿基不能形成氫鍵，造成三鏈DNA結構收縮和破壞。表小檗堿（圖2C）與GGA型三鏈DNA結合后，260nm處的吸收強度減小并且紅移，推測表小檗堿的芳香發色團與三鏈DNA的堿基發生了堆疊作用，π-π*電子躍遷能量降低，最大吸收波長紅移，進而導致減色效應。研究表明，表小檗堿與GGA型三鏈DNA通過插入作用結合[17]。防己諾林堿（圖2F）和粉防己堿（圖2G）與GGA型三鏈DNA結合后，最大吸收波長藍移且吸收強度增大，說明這兩種生物堿類小分子也不能穩定GGA型三鏈DNA的結構。紫外可見光譜分析結果表明，異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的結合模式取決于其化學結構。

為了考察這7種小分子能否穩定GGA型三鏈DNA，對摩爾比為1∶2的GGA型三鏈DNA/小分子復合物進行變溫紫外分析。通過考察小分子存在/不存在時三鏈DNA的Tm值變化，判斷此小分子是否具有穩定三鏈DNA的作用：若Tm提高則為三鏈DNA穩定劑，若Tm降低則為三鏈DNA去穩定劑[28-29]。如圖3所示，加入黃連堿、藥根堿、表小檗堿、防己諾林堿和粉防己堿后的Tm值與GGA三鏈DNA單獨存在時的Tm的差異較小（圖3A～3C，3F和3G），表明這5種異喹啉類生物堿不能穩定GGA型三鏈DNA。加入小檗紅堿和非洲防己堿后，ΔTm分別為5℃和4℃（圖3D和3E），表明小檗紅堿和非洲防己堿可在一定程度上穩定GGA型三鏈DNA。

2.3熒光光譜法研究異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的相互作用

選擇一種典型的插入劑EB分析異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的結合模式。固定熒光滴定猝滅實驗中EB的濃度為3μmol/L，隨著三鏈核酸濃度增加，熒光強度不斷增大。如圖4A所示，當熒光強度不再增大時，三鏈核酸濃度為9.51μmol/L。基于此結果，確定實驗需要的GGA型三鏈DNA的濃度為4.755μmol/L。由7種不同化合物存在條件下的EB-GGA型三鏈DNA體系的熒光光譜（圖4B～4H）可見，向此體系中加入表小檗堿（圖4D）、防己諾林堿（圖4G）和粉防己堿（圖4H）后，EB-DNA體系的熒光強度隨著藥物濃度增加而逐漸降低，直到低于最大熒光強度的50%，并且CTarget/CDNAlt;100，表明加入表小檗堿、防己諾林堿和粉防己堿會影響體系中EB與GGA型三鏈DNA的作用，即部分EB被藥物分子置換出來而變成游離態，表小檗堿、防己諾林堿和粉防己堿與GGA型三鏈DNA的作用方式主要為插入結合模式。向EB-GGA型三鏈DNA中加入黃連堿后，EB體系的熒光強度幾乎不發生變化（圖4B），說明黃連堿不與EB-GGA型三鏈DNA體系發生作用，其作用方式還需進一步研究。當藥根堿（圖4C）、小檗紅堿（圖4E）和非洲防己堿（圖4F）濃度逐漸增加時，EB-DNA體系熒光強度也在逐漸降低，但未能降低到最大熒光強度的50%，盡管不能判斷出其與GGA型三鏈DNA的相互作用為插入結合，但也表明這3種生物堿與GGA型三鏈DNA的結合能力很強。

2.4圓二色光譜法研究相互作用模式

為了進一步研究GGA型三鏈DNA與異喹啉類生物堿混合物在溶液中的結構信息，進行了CD光譜檢測。在保持三鏈DNA濃度為20μmol/L的實驗條件下，將生物堿小分子的濃度從1nmol/L增加至500μmol/L，觀察系統的CD信號變化。結果表明，在配體存在的情況下，DNA的CD光譜發生顯著改變，這是因為DNA與配體結合后DNA構象的改變導致DNA堿基耦合發生變化[30]。由圖5可見，除表小檗堿（圖5C）外，隨著小分子配體濃度增加，CD譜峰強度增強，并且7種化合物與GGA型三鏈DNA結合后出現負的譜峰，表明這7種小分子的躍遷矩垂直于DNA堿基對的長軸方向[31]。根據文獻[31-32]報道的評價標準，這些小分子與GGA型三鏈DNA的作用為插入結合模式。

目前，許多DNA為臨床使用或在高級臨床試驗中的藥物的藥理學靶點，其中具有抗腫瘤活性的DNA插入劑引起了研究者的特別關注。例如，一些吖啶和蒽環類衍生物是良好的DNA插入劑，已作為化療藥物在市場上銷售[33]。綜合考慮本研究結果，表小檗堿、防己諾林堿和粉防己堿作為GGA型三鏈DNA的插入劑，影響DNA的復制和轉錄等過程，有助于從分子水平上了解抗癌藥物的作用機理，有望發展成為治療腫瘤的化學藥物，為后續藥物的化學結構修飾奠定了理論基礎。通過研究生物堿類小分子與DNA的相互作用模式，可為新藥研發提供新的靶點和思路，以期設計出更有效的藥物，提高藥物的療效和安全性。深入研究這種相互作用機制，將為生物醫學領域帶來更多的創新和突破。

3結論

采用質譜法、UV-vis光譜法、熒光光譜法和CD光譜法研究了黃連堿、藥根堿、表小檗堿、小檗紅堿、非洲防己堿、防己諾林堿和粉防己堿與GGA型三鏈DNA的相互作用。比較了多種堿土金屬離子對GGA型三鏈DNA形成的穩定性影響，發現Ni2+能更有效地促進GGA型三鏈DNA的形成。此外，研究表明，異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的相互作用存在多種機制，本研究觀察到了靜電作用和插入結合模式，相互作用的差異說明了小分子結構影響的重要性。紫外變溫實驗結果表明，小檗紅堿和非洲防己堿可以穩定GGA型三鏈DNA結構。本研究結果有助于理解異喹啉類生物堿與GGA型三鏈DNA的相互作用，同時為研發新型異喹啉類生物堿治療試劑提供了理論基礎。