羅望子種子中木葡聚糖的提取工藝優(yōu)化

孫 婷，劉桂亭，林莎莎，鄒圣燦，王寶群

（青島琛藍(lán)海洋生物工程有限公司，山東青島 266104）

羅望子（Tamarindus indica L.） 是蘇木科（Cae salpiniaceae） 酸豆屬（Tamarindus） 的常綠大型喬木[1]，主要產(chǎn)于印度、孟加拉國(guó)、緬甸等地，在我國(guó)云南、廣西等地區(qū)也有種植[2-4]。羅望子種子中的多糖含量高達(dá)60%[5]，其中木葡聚糖（Xyloglucan，XG） 是羅望子種子中的主要成分之一。因XG 資源豐富、工業(yè)生產(chǎn)成本低，又具有穩(wěn)定、增稠等性質(zhì)，可被用于代替果膠、明膠等作為一種食品添加劑，廣泛應(yīng)用于各種飲品、食品中。除此之外，XG 還有著良好的流變特性[6-7]、凝膠性[8-12]、黏附性[13]、生物相容性[14]，以及藥物緩釋[15-20]、降血糖血脂[21-22]、調(diào)節(jié)膽汁代謝[23]、體內(nèi)防粘連[24-25]等生物活性，使眾多學(xué)者越來(lái)越關(guān)注其在生物醫(yī)藥、醫(yī)用材料等領(lǐng)域的應(yīng)用。

羅望子種子中雖含有大量木葡聚糖，但其仍含有蛋白質(zhì)（15.0%～20.0%）[26]、脂肪（3.0%～7.5%）[27]、纖維（2.5%～8.0%）[28]等雜質(zhì)。蛋白質(zhì)和脂肪是羅望子木葡聚糖提取過(guò)程中需重點(diǎn)去除的對(duì)象，相比之下，脂肪較易去除，而蛋白質(zhì)則較為困難。羅望子種子中的蛋白質(zhì)約有61%為可溶性蛋白，39%為不可溶性蛋白。同時(shí)，可溶性蛋白由約21%的鹽溶性蛋白、19%的水溶性蛋白、17%的堿溶性蛋白及4%的醇溶性蛋白組成。因此，想要獲得高純度木葡聚糖的關(guān)鍵是在不引起多糖損失的前提下，高效去除羅望子種子中水溶性蛋白質(zhì)。目前，對(duì)于羅望子木葡聚糖的提取純化方法有2 種，分別是經(jīng)典的水提醇沉法和有機(jī)酸提取法。水提醇沉法主要是通過(guò)醇沉將大部分多糖提取出來(lái)，而有機(jī)酸提取法則是通過(guò)等電點(diǎn)沉降法去除蛋白質(zhì)，2 種方法均可去除羅望子木葡聚糖中部分蛋白質(zhì)。通過(guò)這2 種方法制備的多糖，有著溶解性差、純度不高等缺點(diǎn)，極大地限制了羅望子木葡聚糖在生物醫(yī)藥和醫(yī)用材料中的應(yīng)用，尤其是對(duì)于植入體內(nèi)應(yīng)用的第三類醫(yī)用材料，因?yàn)檩^高的蛋白質(zhì)殘留有導(dǎo)致免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)亟需一種可以制備高純度羅望子木葡聚糖的方法。采用酸、堿處理，結(jié)合活性炭吸附、透析的方法去除多糖中的蛋白質(zhì)，并對(duì)工藝進(jìn)行初步研究，為木葡聚糖的提取工藝提供新思路，為其在生物醫(yī)藥、醫(yī)用材料、食品、造紙、紡織等領(lǐng)域的應(yīng)用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

羅望子，云南貓哆哩集團(tuán)提供；醋酸（分析純）、考馬斯亮藍(lán)G-250、85%磷酸（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；活性炭，福建元力活性炭股份有限公司提供；透析袋（50 kDa），湖南羽博生物科技有限公司提供；牛血清白蛋白，北京索萊寶科技有限公司提供；鱟試劑（0.1 mL/支）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（10 EU /支），湛江博康海洋生物有限公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SF-2000 型高速粉碎機(jī)，上海市藥材有限公司產(chǎn)品；HH-1 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；AR224CN 型電子天平，奧豪斯儀器（常州） 有限公司產(chǎn)品；JSB6-02 型電子計(jì)重秤，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司產(chǎn)品；DZ267-32C10 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；Master-E plus UF 型純水機(jī)，上海和泰儀器有限公司產(chǎn)品；LYO-100FS 型冷凍干燥機(jī)，北京開元永盛凍干技術(shù)有限公司產(chǎn)品；T6 型新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；雷磁PHS-3E型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；Alpha 型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Bruker 公司產(chǎn)品；AVANCE III HD 400 MHz 型核磁共振譜儀，美國(guó)Bruker 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羅望子木葡聚糖的提取工藝流程

將羅望子種子經(jīng)過(guò)烘炒、粉碎、過(guò)篩、脫脂處理得到羅望子多糖粗粉；精確稱取一定量的羅望子多糖粗粉，在高溫下，按一定比例用水溶解，將溶液離心取上清液，得到羅望子多糖水提液；向水提液中加入醋酸，調(diào)節(jié)pH 值至2.5～4.5，靜置沉降；再取上清液加入氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH 值至10.5～12.5，靜置沉降；取上清液加入活性炭吸附，離心后將上清液裝入50 kDa 透析袋中透析；將透析后的溶液經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到羅望子木葡聚糖。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

（1） 料液比對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響。分別選取料液比為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，酸處理pH 值為3，堿處理pH 值為12，在其他步驟不變的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定樣品蛋白質(zhì)殘留量。

（2） 酸處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響。分別選取酸處理pH 值為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，料液比為1∶1，堿處理pH 值為12，在其他步驟不變的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定樣品蛋白質(zhì)殘留量。

（3） 堿處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響。分別選取堿處理pH 值為10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，料液比1∶1，酸處理pH 值為3，在其他步驟不變的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定樣品蛋白質(zhì)殘留量。

1.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.4 多糖含量檢測(cè)

依據(jù)“苯酚- 硫酸法”測(cè)定樣品中多糖含量。

1.2.5 蛋白質(zhì)殘留量檢測(cè)

依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》 （2020 版） 四部通則0731 蛋白質(zhì)含量測(cè)定法中第五法“考馬斯亮藍(lán)法（Bradford 法）”測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)殘留量。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)毒素檢測(cè)

依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》 （2020 版） 四部通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中方法2“光度檢測(cè)法”測(cè)定樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

1.2.7 紫外吸收光譜

將所得木葡聚糖配制成質(zhì)量濃度4 mg/mL 的水溶液，待充分溶解后進(jìn)行紫外光譜掃描，波長(zhǎng)范圍為200～400 nm。

1.2.8 紅外吸收光譜

將所得木葡聚糖與溴化鉀按比例（1∶100） 混勻、研磨、壓片后進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描的范圍為4 000～500 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響

分別選取料液比為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5（g∶mL），對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響。

料液比對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響

由圖1 可知，料液比對(duì)羅望子木葡聚糖蛋白質(zhì)含量的影響并不顯著，當(dāng)料液比為1∶2 時(shí)，蛋白質(zhì)含量最低，為1.25%。因此，選擇1∶2 為最佳料液比。

2.1.2 酸處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響

分別選取酸處理pH 值為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響。

酸處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 酸處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響

羅望子粗粉中含有大量水溶性蛋白質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)pH 值至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（Protein isoelectric point，PI），使蛋白質(zhì)溶解性變小，形成容易去除的沉淀物。由圖2 可知，酸處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖蛋白質(zhì)含量的影響較大，隨著pH 值升高，蛋白質(zhì)含量先降低后升高，在pH 值為3.5 時(shí)蛋白質(zhì)含量最低，說(shuō)明大部分帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)被去除。因此，選擇pH 值3.5 為最佳酸處理pH 值。

2.1.3 堿處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響

分別選取堿處理pH 值為10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響。

堿處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 堿處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響

由圖3 可知，堿處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖蛋白質(zhì)含量的影響較大，隨著pH 值升高，蛋白質(zhì)含量先降低后升高，在pH 值為12 時(shí)達(dá)到最低值，說(shuō)明大部分帶正電荷的蛋白質(zhì)被去除。因此，選擇pH 值12 為最佳堿處理pH 值。

2.2 羅望子木葡聚糖純度正交試驗(yàn)結(jié)果

為優(yōu)化羅望子木葡聚糖的提取工藝，選取對(duì)提取工藝影響最大的3 個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3 個(gè)水平：料液比（1∶1，1∶2，1∶3）、酸處理pH 值（3.0，3.5，4.0）、堿處理pH 值（11.5，12.0，12.5）進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2 可知，羅望子木葡聚糖最佳提取工藝為料液比1∶3，酸處理pH 值3.5，堿處理pH 值12.0。通過(guò)計(jì)算極差可知酸處理pH 值對(duì)羅望子木葡聚糖純度的影響最大，其次為堿處理pH 值，而料液比的影響最小。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

羅望子木葡聚糖最佳提取工藝正交試驗(yàn)中，因此需在該條件下再進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)：將羅望子多糖粗粉按料液比為1∶3 進(jìn)行溶解，待樣品溶解后將溶液離心取上清液，得到“羅望子多糖水提液”；向水提液中加入醋酸，調(diào)節(jié)pH 值至3.5，靜置沉降；再取上清液加入氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH 值至12.0，靜置沉降；隨后，取上清液加入活性炭吸附，離心后將上清液裝入50 kDa 透析袋中透析；最后，將透析后的溶液經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到“精制羅望子木葡聚糖”。

2.3.1 理化指標(biāo)檢測(cè)

經(jīng)檢測(cè)精制羅望子木葡聚糖的蛋白質(zhì)含量為0.2%，細(xì)菌內(nèi)毒素含量為150 EU/g，總糖含量為99.63%。

2.3.2 紫外吸收光譜檢測(cè)

羅望子木葡聚糖的紫外吸收光譜見(jiàn)圖4。

圖4 羅望子木葡聚糖的紫外吸收光譜

由圖4 可知，羅望子多糖水提液于波長(zhǎng)260 nm處無(wú)吸收峰，但在波長(zhǎng)280 nm 處有較大吸收峰，證明該溶液含有大量蛋白質(zhì)。精制羅望子木葡聚糖于波長(zhǎng)260 nm 和280 nm 處均無(wú)吸收峰，表示樣品中不含有蛋白質(zhì)和核酸，或含量很少，與正交試驗(yàn)結(jié)果相同。

2.3.3 紅外吸收光譜檢測(cè)

羅望子木葡聚糖的紅外吸收光譜見(jiàn)圖5。

圖5 羅望子木葡聚糖的紅外吸收光譜

由圖5 可知。表3 列舉了部分峰的具體峰位置。2 個(gè)樣品在3 600～3 200 cm-1處有O-H 伸縮振動(dòng)的吸收峰，在3 000～2 800 cm-1處有C-H 伸縮振動(dòng)的吸收峰，以上2 個(gè)峰為糖類物質(zhì)的特征吸收峰。同時(shí)，2 個(gè)樣品在1 380～1 370，1 040～1 030，940，890 cm-1處均有木葡聚糖的特征峰，其中1 380～1 370 cm-1為木葡聚糖中CH2彎曲振動(dòng)[29]，1 040～1 030 cm-1為木葡聚糖中的C-O-C 伸縮振動(dòng)，940 cm-1為葡萄糖的環(huán)振動(dòng)，890 cm-1為葡萄糖和木糖β 端基的鏈接。說(shuō)明2 個(gè)樣品中均含有木葡聚糖。此外，羅望子多糖水提液在1 530 cm-1處有N-H 彎曲振動(dòng)吸收峰，在1 250 cm-1處有C-N 伸縮振動(dòng)峰，這2 個(gè)峰為蛋白質(zhì)或多肽的特征吸收峰，而在精制羅望子木葡聚糖中不存在這2 個(gè)峰，說(shuō)明經(jīng)最佳提取方案制備的精制羅望子木葡聚糖其純度大幅度提高，而蛋白質(zhì)含量較低，與正交試驗(yàn)、紫外吸收光譜結(jié)果相似。

表3 羅望子木葡聚糖的紅外測(cè)試結(jié)果/ cm-1

羅望子木葡聚糖的紅外測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。

3 結(jié)論

以羅望子種子為原料，利用羅望子木葡聚糖耐熱、耐酸堿的特性，采用酸、堿處理，結(jié)合活性炭吸附、透析的方法去除多糖中的蛋白質(zhì)，優(yōu)化了羅望子木葡聚糖的提取工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)分析料液比、酸處理pH 值、堿處理pH 值3 種因素對(duì)木葡聚糖純度的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，該提取工藝的最佳條件為料液比1∶3，酸處理的pH 值3.5，堿處理的pH 值12.0；各因素對(duì)木葡聚糖純度影響的大小順序?yàn)樗崽幚韕H 值＞堿處理pH 值＞料液比。經(jīng)驗(yàn)證，在最佳條件下，羅望子木葡聚糖的細(xì)菌內(nèi)毒素含量為150 EU/g，總糖含量為99.63%，其蛋白質(zhì)含量大幅度降低，含量為0.2%，與紅外吸收光譜和紫外吸收光譜結(jié)果相類似。通過(guò)此工藝提取的木葡聚糖純度較高，為木葡聚糖的提取工藝提供了新思路，也對(duì)其在生物醫(yī)藥、醫(yī)用材料、食品、造紙、紡織等領(lǐng)域的應(yīng)用作出貢獻(xiàn)。