利用響應面法優化狐臭柴葉多糖提取工藝、單糖組成及生物活性研究

楊丹丹，朱玉昌，周大寨

（1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北恩施 445000；2.湖北民族大學林學園藝學院，湖北恩施 445000；3.湖北民族大學生物與食品工程學院，湖北恩施 445000）

狐臭柴（Premna Puberula Pamp）又名長柄臭黃荊、斑鳩占和神仙豆腐柴等，屬于馬鞭草科豆腐柴屬植物，是多年生長的落葉灌木［1］。主要分布于湖南、湖北、廣西、廣東以及云貴川等地區。狐臭柴葉片中含有豐富的黃酮類［2］、酚類、揮發油類及多糖類等［3］多種活性成分，具有廣泛的食用價值和藥用價值，有關狐臭柴葉片的研究集中在食品加工、扦插繁殖、藥理研究等方面［4］。在食品加工方面，民間常用豆腐柴屬植物制作“神豆腐”，近年來，神仙豆腐加工工藝不斷完善，張翔等［5］采用豆腐柴葉片制作觀音豆腐，在料液比1∶8（g·mL-1）、pH為4、溫度為90 ℃、熱水燙漂40 s條件下制作觀音豆腐品質最好。在扦插繁殖方面，研究不同因素對狐臭柴扦插成活率的影響，幸菲菲［6］研究狐臭柴種苗快速繁殖生物技術，其中，二年生3個枝節的狐臭柴扦插的成活率高達95.6%。在藥理作用方面，目前主要研究狐臭柴提取物的抗氧化性、揮發油的抗炎作用等。楊寧線等［7］研究狐臭柴葉、莖、根等提取物的抗氧化性，結果表明葉部位提取物抗氧化較好。付立霞等［8］研究狐臭柴莖揮發油的抗炎活性，結果表明狐臭柴莖揮發油對LPS 誘導RAW 264.7細胞炎癥模型具有較好的抗炎作用［9］。有關于狐臭柴多糖的研究主要是果膠的抗炎作用、理化性質等［10］。

綜上，為充分開發利用狐臭柴資源，采用草酸-磷酸氫二鈉溶液提取狐臭柴酸溶性多糖（PSAP），通過單因素試驗、響應面試驗進行PSAP提取的工藝優化，分析其單糖組成，探討PSAP對DPPH自由基、羥自由基、ABTS 自由基和鐵離子還原能力等幾種自由基體外抗氧化活性能力以及研究A549 肺癌細胞和HepG2肝癌細胞的增殖和遷移能力，旨為狐臭柴在食品開發以及臨床治療等方面提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本試驗所需狐臭柴葉片由湖北雄展公司提供，由湖北民族大學易詠梅鑒定為狐臭柴葉片。

草酸、濃硫酸、無水乙醇、正丁醇、苯酚、抗壞血酸、水楊酸、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯甲烷等（國藥集團化學試劑有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（西格瑪奧德里奇貿易有限公司）；2，2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS、梯希愛化成工業發展有限公司）；0.25%胰酶（大連美侖生物科技有限公司）；細胞增殖-毒性檢測試劑盒CCK-8（北京蘭杰柯科技有限公司）；1640 培養基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素溶液（生工生物工程股份有限公司）；A549肺癌細胞和HepG2肝癌細胞（中國醫學科學院細胞研究所）等。

P680 LPG高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Milli-Q純水超純水一體系統（美國默克密理博公司）；TU-1901 紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；M200PRO 酶標儀（帝肯貿易有限公司）；CO2培養箱（賽默飛世爾科技有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 PSAP的前處理及提取

稱取100 g狐臭柴粉末，在料液比1∶10（g·mL-1）的條件下用85%乙醇進行浸泡脫脂、脫色、除去低聚糖和單糖等雜質，反復浸泡4～5次，料液比1∶10的條件下用丙酮浸泡1～2次。脫色后粉末55 ℃烘干過60目篩，即為狐臭柴脫脂脫色粉末。

將狐臭柴脫脂脫色粉用0.05 mol·L-1草酸-磷酸氫二鈉pH為2的提取液，在料液比1∶30（g·mL-1）、提取溫度60 ℃的磁力攪拌器中水浴提取60 min，5 000 r·min-1、15 min離心，重復提取3次并且合并上清液，濃縮至原體積1/3 左右，Sevage 法除蛋白［11］，加入無水乙醇使其溶液最終濃度為80%乙醇，沉淀過夜，5 000 r·min-1、15 min離心，沉淀冷凍干燥即為酸溶性多糖（PSAP）。

1.2.2 PSAP含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定PSAP含量［12］。

1.2.3 單因素試驗試驗研究提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）、料液比（1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g·mL-1））、草酸-磷酸氫二鈉溶液pH（2、3、4、5、6）、提取時間（120、150、180、210、240 min）對PSAP提取率的影響。

1.2.4 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，選擇影響顯著的溫度、料液比、時間等3個單因素為考察因素，進行3因素、3水平的響應面試驗分析。試驗條件見表1。

表1 響應面分析因素和水平Tab.1 The factors and levels of response surface analysis

1.2.5 PSAP單糖組成測定

PSAP水解在參考文獻［13］的基礎上進行修改：配制10 mg·mL-1PSAP溶液，取100 μL于5 mL棕色離心管中，并加100 μL 4 mol·L-1的三氟乙酸，N2密封，105 ℃烘箱水解4 h，取出立即冷卻，氮吹吹干，加200 μL甲醇，氮吹吹干，重復3次去除有機試劑，得到PSAP水解后的樣品。

水解后樣品與標準品衍生在參考文獻［14］的基礎上進行修改：將PSAP水解樣品中加入50 μL超純水溶解，加50 μL 0.6 mol·L-1的氫氧化鈉，搖勻后加100 μL 0.5 mol·L-1PMP甲醇溶液，混勻后封管。70 ℃水浴80 min，加100 μL 0.3 mol·L-1鹽酸中和，加水補至2 mL，加入同體積三氯甲烷，振蕩10 min，5 000 r·min-1、15 min離心，取離心后上層的清液，重復3次，過0.22 μm有機過濾膜，HPLC 檢測分析。標準品配制10 mg·mL-1按上述方法衍生。

色譜條件：色譜柱為Kromasil 100-5-C18（250×4.6 mm、5 μm）；流速1 mL·min-1；柱箱溫度25 ℃；檢測波長250 nm；進樣量30 μL；流動相A：乙腈，流動相B：50 mmol·L-1乙酸銨溶液，洗脫程序為0～45 min、17%A～22%A、83%B～78%B。

1.2.6 PSAP抗氧化活性測定

DPPH自由基清除能力的測定：參考TANG等［15］的方法，并加以調整；羥自由基清除能力的測定：參考TIAN等［16］的方法，并加以調整；ABTS自由基清除能力的測定：參考LIU等［17］的方法，并加以調整；還原能力的測定：參考PETRAGLIA等［18］的方法，并加以調整。

1.2.7 PSAP抗腫瘤活性

（1）A549和HepG2細胞培養

參考商紅旗［19］的方法，并加以調整進行細胞培養。A549肺癌細胞和HepG2肝癌細胞生長于含10%的胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的1640培養基，細胞貼壁生長，5%CO2、37 ℃培養箱孵育。

細胞傳代：培養瓶內細胞長滿80%～90%面積時，棄瓶內培養基，用1 mL pH 為7.4 的磷酸緩沖溶液（PBS）清洗細胞，棄廢液并加1 mL 0.25%胰酶消化1 min左右，迅速加1 mL培養基終止消化，反復吹打細胞使其脫落，將懸液于5 mL離心管離心，棄上清液，沉淀用2 mL培養基重懸，放入細胞培養瓶進行分瓶傳代，培養瓶內補培養基至4 mL，畫8字混勻細胞，密封瓶口于培養箱中孵育。

（2）PSAP對A549和HepG2細胞增殖試驗

參考YAO等［20］的方法，并加以調整，采用CCK-8法測定A549肺癌和HepG2肝癌細胞增殖抑制率，當培養瓶內細胞長滿80%～90%面積時，棄瓶內培養基并加1 mL 0.25%胰酶消化1 min左右，加1 mL培養基終止消化，吹打均勻，制成細胞懸液，按1∶5稀釋細胞懸液，96孔板內每孔100 μL，培養箱孵育48 h后，棄培養基，加1 mL PBS 迅速清洗死細胞，重復3次，分別向各孔加入100 μL含不同PSAP濃度（0、1、2、3、4、5、6 mg·mL-1）的培養基，每組6個復孔，培養箱孵育48 h后，棄培養基，每孔加入100 μL 10%CCK-8溶液，繼續培養45 min，酶標儀450 nm測吸光度值。計算細胞增殖抑制率為：

式中：Y表示細胞增殖抑制率（%）；A0表示空白組的吸光度值；A1表示試驗組吸光度值；A2表示對照組吸光度值。

（3）PSAP對549和HepG2細胞遷移率試驗

參考LUO等［21］的方法，并加以調整，采用劃痕試驗測定A549和HepG2細胞遷移率，在6孔板上，用記號筆畫5條橫穿過孔線，豎畫2條直線，取對數生長期細胞接種于6孔板中，濃度為1×105個·mL-1，每孔2 mL，培養箱中孵育48 h，使細胞貼壁，棄培養基，在豎畫2條直線的中間用100 μL槍頭畫線，1 mL PBS清洗死細胞，重復3 次，分別加入2 mL 用1%FBS 1640 培養基配制PSAP（1、3、5 mg·mL-1）溶液，空白組加2 mL 1%FBS 1640培養基，分別在0、24 h在倒置顯微鏡下拍照，用Image J軟件測量各時間段劃痕間距，計算遷移率：

式中：Y表示細胞遷移率（%）；A0表示0 h劃痕間距值；A1表示24 h劃痕間距值。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

根據1.2.2 中試驗步驟以葡萄糖質量濃度（x）、吸光度值（y）作標準曲線方程：y=0.016 6x+0.012 2；相關系數R2=0.997 6。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取溫度對PSAP提取率的影響

確定料液比1∶30（g·mL-1）、pH為2、提取時間為30 min條件下，進行不同溫度（60、70、80、90、100 ℃）PSAP提取的單因素試驗，提取溫度對PSAP提取率的影響見圖1（A）。由圖1（A）可知，隨著溫度的升高，PSAP提取率呈現大幅度增加的趨勢后逐漸下降，溫度達90 ℃時，PSAP提取率達到峰值，此時提取率為（17.81±0.13）%，升高到一定溫度后細胞壁和表皮組織變得更加松弛，更有利于提取液的充分提取，當溫度在100 ℃時，PSAP 提取率明顯下降，由于高溫破壞多糖分子結構導致水解，因此，提取率呈現下降趨勢。單因素最佳提取溫度為90 ℃，選擇80、90、100 ℃作響應面試驗。

圖1 不同因素對PSAP提取率的影響Fig.1 The influence of different factors on PSAP extraction rate

2.2.2 料液比對PSAP提取率的影響

確定提取溫度為90 ℃、pH為2、提取時間為30 min條件下，進行不同料液比（1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g·mL-1））PSAP提取的單因素試驗，料液比對PSAP的提取率影響見圖1（B）。由圖1（B）可知，在料液比為1∶30～1∶70（g·mL-1），PSAP 提取率隨著料液比的增加呈現先增加后下降的趨勢，當提取液在1∶40（g·mL-1）時，PSAP提取率最大為（17.84±0.24）%，當料液比高于1∶40（g·mL-1）時，呈現下降趨勢可能由于提取液已經達到飽和的狀態，料液比增高反而使質量傳遞的速度減慢，導致提取率下降，與HU等［22］研究結果相似。單因素最佳提取料液比為1∶40（g·mL-1），選擇1∶30、1∶40、1∶50（g·mL-1）作響應面試驗。

2.2.3 pH對PSAP提取率的影響

確定提取溫度為90 ℃、料液比為1∶40（g·mL-1）、提取時間為30 min條件下，進行不同pH（2、3、4、5、6）PSAP提取的單因素試驗，pH對PSAP提取率的影響見圖1（C）。由圖1（C）可知，隨著pH的增加，PSAP提取率呈現下降趨勢，當pH為2時，提取率達到（18.3±0.14）%，強酸度的條件下更有利于多糖的溶出，單因素最佳提取pH為2，與熊小輝等［23］研究結果類似。

2.2.4 提取時間對PSAP提取率的影響

確定提取溫度為90 ℃、料液比為1∶40（g·mL-1）、pH為2的條件下，進行不同提取時間（120、150、180、210、240 min）的單因素試驗，提取時間對PSAP提取率的影響見圖1（D）。由圖1（D）可知，隨著時間的增加，PSAP 先呈現遞增趨勢，當提取時間在210 min 時，PSAP 提取率為（28.78±0.25）%，此時為峰值，在提取時間超過210 min后，PSAP呈現較為平穩的趨勢，造成這種結果的原因可能是由于提取時間過長導致多糖分子結構被破壞，提取率不增反降。單因素最佳提取時間為210 min，選取180、210、240 min作響應面試驗。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 Box-Behnken響應面試驗設計與結果

通過單因素試驗結果表明，以提取溫度、料液比、時間等3 個因素為自變量，狐臭柴脫脂脫色粉中PSAP提取率為響應值，通過Box-Behnken響應面設計對PSAP提取條件進一步優化，PSAP提取試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken 響應面試驗設計和結果Tab.2 The design and results of Box-Behnken response surface test

2.3.2 擬合模型的建立與結果分析

通過響應面試驗用表2 中數據對模型進行方差分析，結果見表3，由表3 可知，模型P=0.000 2（P＜0.05）是具有顯著性的，因變量與自變量線性關系顯著（R2=0.966 0），模型調整確定系數值為0.922 2，模型的失擬項為0.573 7＞0.05，不顯著，表明此模型可以分析和預測PSAP提取的最佳工藝條件。3個因素對PSAP的提取率影響大小依次為A（溫度）＞B（料液比）＞C（時間），二次多項回歸方程如下：

表3 響應面試驗的方差分析結果Tab.3 The ANOVA results for response surface experiments

2.3.3 響應面試驗交互作用分析

各交互項對PSAP 提取率的影響見圖2，根據Box-Behnken 試驗所得的結果并分析二次多項回歸方程，獲得PSAP最佳提取條件：提取溫度為99.31 ℃、料液比為1∶31（g·mL-1）、提取時間為240 min時，響應面試驗預測PSAP提取率最高，為31.86%。

2.3.4 驗證試驗結果

根據實際操作情況，在提取溫度為100 ℃、料液比為1∶31（g·mL-1）、時間為240 min、草酸-磷酸氫二鈉pH為2的提取條件下，PSAP提取率為（31.04±0.21）%，響應面預測理論值為31.86%，實際值與響應面預測的誤差為0.82%，說明此模型可以用來預測PSAP的提取。

2.4 PSAP單糖組成分析

各單糖標準品和PSAP色譜峰以及出峰時間見圖3（A）和圖3（B）。由圖3（A）和圖3（B）可知，對比單糖標準品保留時間，得出PSAP主要由8種單糖組成。峰面積占比分別為甘露糖0.22%、鼠李糖6.13%、葡萄糖醛酸4.58%、半乳糖醛酸31.98%、葡萄糖18.31%、半乳糖9.90%、阿拉伯糖10.23%、巖藻糖4.09%，出峰時間在17.36 min，存在未知峰，推測為其他未知單糖。

圖3 混合單糖對照品和PSAP水解后樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC plot of mixed monosaccharide reference substance and PSAP hydrolyzed sample

2.5 PSAP抗氧化活性測定結果

2.5.1 PSAP對DPPH自由基清除能力的影響

DPPH自由基內存在自由基清除劑時，其乙醇溶液從紫色變淺色，DPPH溶液變色深淺程度反映自由基清除劑的清除效果，在517 nm處有最大吸收峰。這一反應被廣泛用于不同植物的提取物的抗氧化活性［24］。PSAP和Vc在1.0～5.0 mg·mL-1濃度范圍內對DPPH自由基清除能力的影響見圖4（A）。由圖4（A）可知，PSAP具有一定的DPPH自由基清除能力，且隨著濃度的增加清除能力也逐漸增加。當濃度達到5 mg·mL-1時，清除率達到（69.02±4.15）%，經過線性擬合，半數抑制濃度IC50值為3.69 mg·mL-1，相比于Vc有一定差距。

2.5.2 PSAP對羥自由基清除能力的影響

水楊酸可使過氧化氫和二價鐵離子反應生成有高活性羥自由基顏色變深，在510 nm波長有最強吸收峰值［25］。PSAP和Vc在1.0～5.0 mg·mL-1濃度范圍內對羥自由基清除能力的影響見圖4（B）。由圖4（B）可知，隨著濃度的增加，PSAP清除率呈現上升的趨勢，濃度在5 mg·mL-1時，PSAP清除率達峰值為（80.01±2.29）%，IC50值為2.91 mg·mL-1，接近Vc的清除能力。

2.5.3 PSAP對ABTS自由基清除能力的影響

PSAP 和Vc在0.2～1.0 mg·mL-1濃度范圍內對ABTS 自由基清除能力的影響見圖4（C）。由圖4（C）可知，隨著濃度的增加，清除效果明顯增加，在濃度為1.0 mg·mL-1時，PSAP清除率為（93.87±1.12）%，此時清除率與Vc相接近，PSAP對ABTS自由基清除能力的IC50值為0.43 mg·mL-1。

2.5.4 PSAP對還原能力的影響

PSAP在1.0～5.0 mg·mL-1濃度范圍內對總還原能力的影響見圖4（D）。由圖4（D）可知，PSAP隨著濃度的增加，還原能力明顯增加，在濃度5.0 mg·mL-1時，PSAP在700 nm處吸光度值為0.389。

2.6 PSAP抗腫瘤活性

2.6.1 A549和HepG2細胞增殖抑制率試驗結果

PSAP對A549和HepG2細胞增殖抑制作用見圖5（A）和圖5（B），在不同給藥濃度下處理A549和HepG2細胞48 h，CCK-8法測定細胞存活率，不同濃度的PSAP對A549和HepG2均有增殖抑制的效果，并且呈現劑量依賴性，其中，對A549細胞，在不同處理濃度下均有顯著差異（P＜0.05）；在HepG2細胞中，給藥濃度為4～5 mg·mL-1，無顯著差異，其余給藥濃度均有顯著差異（P＜0.05），在給藥濃度達到6 mg·mL-1時，對A549和HepG2細胞抑制率分別為（60.20±0.83）%和（61.44±1.01）%。

圖5 PSAP對A549和HepG2細胞的抑制和遷移作用的影響Fig.5 Effect of PSAP on the inhibition and migration of A549 and HepG2 cells

2.6.2 A549和HepG2細胞劃痕試驗結果

PSAP 對A549 和HepG2 細胞劃痕試驗結果見圖5（C）和圖5（D），PSAP 對A549 和HepG2 細胞有一定的抑制遷移效果，呈現劑量依賴性，由圖5（C）可知，在A549細胞中，不同給藥濃度與0濃度相比均有顯著差異（P＜0.05），說明不同給藥濃度有一定抑制遷移效果；由圖5（D）可知，在HepG2細胞中，不同給藥濃度與0濃度相比較有顯著差異，說明可抑制HepG2細胞遷移表明PSAP對A549和HepG2細胞均具有較好的抑制遷移效果，并且呈現劑量依賴性。

3 討論與結論

本試驗以狐臭柴為原料，通過酸法提取狐臭柴葉中PSAP并進行單因素和響應面試驗工藝優化，確定最佳工藝：提取溫度為100 ℃、料液比為1∶31 g·mL-1、時間為240 min、草酸-磷酸氫二鈉pH為2的條件下重復提取3次，PSAP提取率為（31.04±0.21）%。采用HPLC對PSAP水解后的單糖組成進行分析，峰面積占比主要為甘露糖0.22%、鼠李糖6.13%、葡萄糖醛酸4.58%、半乳糖醛酸31.98%、葡萄糖18.31%、半乳糖9.90%、阿拉伯糖10.23%、巖藻糖4.09%組成。體外抗氧化試驗結果表明，PSAP 對DPPH 自由基、羥自由基、ABTS自由基強清除能力較好，IC50值由低到高分別為ABTS自由基、羥自由基和DPPH自由基，其濃度分別為0.43、2.91、3.69 mg·mL-1，在食品加工業可作為天然的抗氧化劑。同時細胞試驗表明，PSAP 對A549和HepG2細胞增殖和遷移具有一定抑制效果，且抑制效果明顯，并呈現一定劑量依賴性，PSAP可為醫藥領域研究提供一定理論基礎。