蓖麻葉總黃酮純化工藝優(yōu)化及抗氧化研究

穆莎茉莉，袁曉霞，李國(guó)瑞，包英才

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028043；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 通遼 028000；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)系統(tǒng)創(chuàng)新培育中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

蓖麻為大戟科植物，植株高大［1］，枝葉繁茂，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，南北方地區(qū)均有種植，資源豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。蓖麻葉中含有多種活性成分，如黃酮類、有機(jī)酸類、香豆素類、生物堿類等［2］。研究表明，黃酮化合物對(duì)·OH、、DPPH·、ABTS+·有良好的清除能力，具有一定的抗氧化能力［3-5］、抗疲勞作用［6］和抑菌能力［7］。天然植物中的黃酮化合物含量較低，提取后含有較多雜質(zhì)，需要進(jìn)一步分離純化。其分離純化的方法較多，如離心分離法、溶劑氣浮分離技術(shù)、重結(jié)晶法、柱層析色譜法、雙水相萃取法和膜分離法等［8-9］，其中，大孔樹脂柱層析色譜法因大孔樹脂種類較多、可再生、選擇性好、反應(yīng)條件溫和而應(yīng)用最為廣泛［10］。筆者對(duì)從蓖麻葉中提取的總黃酮進(jìn)行純化及抗氧化活性研究，旨在通過大孔樹脂的純化作用提高蓖麻總黃酮提取物純度，為開展后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

蓖麻鮮葉采自內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)業(yè)科技園區(qū)作物品種園。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)試劑為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）；纖維素酶5萬U·g-1（江蘇瑞陽生物科技有限公司）；1，1-二苯基-2-苦基肼（純度≥98%，合肥巴斯夫生物科技有限公司）；抗壞血酸、氫氧化鈉、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鹽酸（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；AB-8、NKA-9、HPD100、S-8、ADS-17、DM130型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

N-4 紫外分光光度計(jì)（上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）；HH-4 恒溫水浴鍋（江蘇常州榮華儀器制造有限公司）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏儀表有限公司）；XO-SM超聲波組合儀（南京先歐儀器制造有限公司）；A-O104分析天平（梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蓖麻葉總黃酮粗提液的制備 取蓖麻葉清洗后烘干并粉碎，過60目篩，得到蓖麻葉粉。稱取蓖麻葉粉50.0 g，采用酶法提取工藝稍加修改［11］，纖維素酶添加量0.5%、pH 為4.5、酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間80 min，酶解完成滅活并抽濾，濾渣用60%乙醇，超聲300 W條件下提取30 min 后抽濾，將2次濾液合并濃縮后用蒸餾水稀釋，得到蓖麻葉黃酮粗提液。

1.2.2 大孔樹脂的預(yù)處理

6 種型號(hào)的大孔樹脂（AB-8、NKA-9、HPD100、S-8、ADS-17、DM130）采用陳素雯等［12］的方法處理備用。

1.2.3 大孔樹脂的篩選

靜態(tài)吸附和解吸：稱取樹脂各2.0 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入1.56 mg·mL-1蓖麻總黃酮溶液50 mL，置于恒溫振蕩器上（25 ℃，100 r·min-1），充分吸附24 h，過濾，測(cè)定濾液中蓖麻總黃酮濃度并計(jì)算大孔樹脂對(duì)總黃酮的吸附率、吸附量。將吸附飽和的樹脂用水沖洗后抽濾，置于100 mL 錐形瓶中加入70%乙醇50 mL，震蕩24 h充分解吸，收集解吸液，測(cè)定總黃酮濃度。

吸附率=（C0-C1）/C0×100%；吸附量（mg·g-1）=（C0-C1）V0/M；解吸率=［C2V2/（C0-C1）V0］×100%；解吸量（mg·g-1）=C2V2/M。其中，C0為吸附前總黃酮濃度（mg·mL-1），V0為上樣液體積（mL），C1為吸附后溶液中總黃酮濃度（mg·mL-1），C2為解吸后總黃酮濃度（mg·mL-1），V2為解吸液體積（mL），M為樹脂質(zhì)量（g）。

1.2.4 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取15.0 g 優(yōu)選后的樹脂，濕法裝柱，分別考察下面各因素對(duì)蓖麻葉中總黃酮的純化作用的影響。

（1）上樣流速及上樣體積對(duì)吸附作用的影響：控制上樣濃度為0.98 mg·mL-1，上樣流速分別為1、2和3 BV·h-1，每10 mL收集1份流出液，當(dāng)流出液中蓖麻總黃酮濃度為上樣液濃度的10%時(shí)達(dá)到泄漏點(diǎn)，繪制泄露曲線。

（2）不同上樣濃度對(duì)大孔樹脂吸附作用的影響：以上樣體積120 mL，上樣流速2 BV·h-1，pH為4，質(zhì)量濃度分別為0.20、0.59、0.98、1.37和1.76 mg·mL-1的總黃酮粗提液，考察上樣濃度對(duì)純化蓖麻黃酮的影響。

（3）pH對(duì)大孔樹脂吸附作用的影響：以上樣體積120 mL，上樣流速2 BV·h-1，上樣濃度0.98 mg·mL-1，調(diào)節(jié)上樣溶液的pH至3、4、5、6和7，考察不同pH的上樣液對(duì)樹脂吸附率的影響。

（4）洗脫濃度對(duì)大孔樹脂解吸作用的影響：以溶液體積120 mL，流速2 BV·h-1，總黃酮濃度0.98 mg·mL-1，調(diào)節(jié)pH 為4 進(jìn)行上樣，上樣后以4 BV 蒸餾水洗脫后，控制洗脫液乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%和90%，考察乙醇洗脫濃度對(duì)解吸作用的影響。

（5）洗脫流速、洗脫液體積對(duì)大孔樹脂的解吸作用的影響：飽和吸附后的樹脂先用水洗去雜質(zhì)，選擇70%乙醇作為洗脫劑，控制洗脫流速分別為2、3和4 BV·h-1進(jìn)行洗脫，每10 mL收集1份流出液，并測(cè)定流出液中的總黃酮濃度，繪制解吸曲線，考察洗脫流速、洗脫體積對(duì)解吸作用的影響。

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

收集洗脫液并測(cè)定計(jì)算洗脫液中總黃酮含量，將洗脫液濃縮干燥稱重，在最佳純化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算總黃酮純度［14］。

總黃酮純度=M1/M0×100%，式中，M1為溶液中總黃酮質(zhì)量（mg），M0為溶液濃縮干燥后的質(zhì)量（mg）。

1.2.6 蓖麻總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

將VC與純化后的蓖麻黃酮配制成不同濃度的待測(cè)液，分別取2 mL置于試管中，分別加入0.2 mmol·L-1DPPH乙醇溶液2 mL，混勻避光靜置30 min后于517 nm處測(cè)定其吸光度（a1）；將上述操作中的DPPH換成無水乙醇，重復(fù)操作過程，得到吸光度（a2）；將2 mL DPPH和2 mL無水乙醇反應(yīng)作為空白對(duì)照，517 nm處測(cè)定其吸光度（a0），DPPH清除率［14］按下式計(jì)算：Y=［1-（a1-a2）/a0］×100%。

1.3 蓖麻葉總黃酮的測(cè)定

參考林春梅［15］的方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.220 0X-0.211 4（R2=0.999 6），各濃度溶液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同方法測(cè)出吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Micorosoft Excel 2010進(jìn)行圖表制作及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大孔樹脂吸附解吸性能比較

表1為不同大孔樹脂解吸性能比較。由表1可知，對(duì)蓖麻總黃酮吸附能力最強(qiáng)的是樹脂S-8，吸附率超過了90%，但其解吸率最低，因此不適用于本試驗(yàn)。通過綜合比較，選用吸附量和解吸率均較高的HPD100型號(hào)樹脂進(jìn)行純化蓖麻總黃酮的后續(xù)試驗(yàn)。

表1 不同樹脂對(duì)蓖麻總黃酮的吸附性能Tab.1 Adsorption properties of different resins on total flavonoids from castor

2.2 上樣流速與上樣體積對(duì)蓖麻總黃酮純化作用的影響

HPD100型樹脂動(dòng)態(tài)泄露曲線，分別以不同的流速1、2和3 BV·h-1上樣，上樣流速越大泄漏點(diǎn)出現(xiàn)越早，上樣流速大會(huì)使樣液中的部分總黃酮未能與樹脂充分接觸、吸附而流出，以3 BV·h-1的流速上樣，在流出液體積80 mL 時(shí)出現(xiàn)了泄漏點(diǎn)；當(dāng)上樣流速為1、2 BV·h-1時(shí)，泄露點(diǎn)分別在140 mL 和120 mL 出現(xiàn)（圖1）。考慮到純化效率和時(shí)間成本，選擇2 BV·h-1為最佳上樣流速，120 mL為最佳上樣體積。

圖1 HPD100樹脂動(dòng)態(tài)泄露曲線 Fig.1 Dynamic leakage curve of HPD100 resin

2.3 上樣液濃度對(duì)吸附率的影響

隨上樣濃度的逐漸增加，總黃酮的吸附率呈先升高再降低趨勢(shì)，0.98 mg·mL-1時(shí)吸附率最高，見圖2。總黃酮濃度較低時(shí)，樹脂孔徑吸附不完全，而總黃酮濃度較高時(shí)，溶液中的醇溶性雜質(zhì)增加會(huì)與黃酮化合物競(jìng)爭(zhēng)樹脂的吸附位點(diǎn)，使得吸附率降低。

圖2 上樣濃度對(duì)吸附作用的影響Fig.2 Effect of loading concentration on adsorption

2.4 pH對(duì)大孔樹脂吸附作用的影響

pH對(duì)吸附率的影響較大，隨pH的增加，樹脂對(duì)蓖麻總黃酮的吸附能力降低（圖3）。由于黃酮化合物是多羥基酚類，在酸性條件下易被樹脂吸附，而堿性條件下其結(jié)構(gòu)改變不易被樹脂吸附［16］，故在pH為4時(shí)吸附率最高。

圖3 不同pH對(duì)吸附作用的影響Fig.3 Effect of different pH on adsorption

2.5 洗脫液濃度的選擇

隨乙醇濃度的增加，吸附在樹脂上的黃酮化合物解吸能力也不斷增強(qiáng)，乙醇濃度為70%時(shí)，解吸率最大（圖4），說明在此濃度下，大部分被吸附的總黃酮被洗脫下來，乙醇濃度繼續(xù)增加時(shí)，可能會(huì)將吸附的雜質(zhì)也洗脫下來，影響試驗(yàn)結(jié)果，故洗脫濃度定為70%乙醇，較為合適。

圖4 不同洗脫濃度下的解吸率Fig.4 Desorption rate at different elution concentrations

2.6 洗脫流速、洗脫液體積對(duì)大孔樹脂解吸作用的影響

洗脫流速為4 BV·h-1時(shí)，解吸曲線峰值最早出現(xiàn)，而且出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，說明洗脫液流速過大洗脫液未與吸附物充分接觸，致使解吸效果不理想。洗脫流速為2 BV·h-1時(shí)，使用解吸液體積較大為130 mL，洗脫效果不佳，洗脫效率低。洗脫流速為3 BV·h-1時(shí)，流出液濃度較為集中，洗脫效率高。綜上，選擇洗脫流速為3 BV·h-1，洗脫體積為100 mL（圖5）。

圖5 解吸曲線Fig.5 Desorption curves

圖6 蓖麻總黃酮、Vc對(duì)DPPH的清除能力Fig.6 DPPH scavenging ability of total flavonoids and Vc from castor

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳純化條件下進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，得到純化后蓖麻葉總黃酮純度分別為55.84%、56.21%、56.97%，平均值為56.34%（RSD=1.02%）。結(jié)果表明，該條件下對(duì)蓖麻總黃酮進(jìn)行純化效果好且試驗(yàn)重復(fù)性好。

2.8 蓖麻總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力

蓖麻總黃酮對(duì)DPPH的清除能力隨著濃度的增加而增大，但對(duì)于DPPH的清除能力低于Vc，蓖麻總黃酮質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH的清除率為78.51%。

3 討論與結(jié)論

大孔樹脂由于極性和粒度大小不同，對(duì)物質(zhì)的吸附、解吸能力也不同，即使對(duì)于同一類物質(zhì)，其吸附能力也有所不同，其吸附與解吸能力還因樣品溶劑種類、洗脫劑種類和濃度、上樣流速及洗脫流速等因素的不同而產(chǎn)生差異。陳素雯等［12］從6 種不同類型的大孔樹脂中篩選純化龍脷葉總黃酮的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AB-8型純化效果最佳。王林美等［17］純化柞樹葉總黃酮的試驗(yàn)中，篩選出最佳的大孔樹脂為D101型。而在本試驗(yàn)中，適用于純化蓖麻葉總黃酮的大孔樹脂為HPD100型。

利用HPD100型大孔樹脂純化蓖麻總黃酮，最佳工藝條件為上樣濃度0.98 mg·mL-1、pH為4、上樣流速為2 BV·h-1、洗脫劑70%乙醇、洗脫流速為3 BV·h-1，蓖麻葉總黃酮純度由純化前的19.48%增加至56.34%，提高了2.89倍。純化后的蓖麻總黃酮質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH的清除率為78.51%。