腫瘤細胞對雷公藤甲素遞送系統(tǒng)的敏感性考察

王風杰，金玲玲，曹瑞珍，尹美珍

（內蒙古民族大學 醫(yī)學院，內蒙古 通遼 028043）

雷公藤甲素（Triptolide，TPL）是中藥雷公藤的主要成分，對肺癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤細胞具有多途徑、多靶點的抑制增殖和殺滅作用［1-6］以及抗耐藥性作用［4］，被研究者［7］認為優(yōu)于傳統(tǒng)化療藥物順鉑、絲裂霉素和紫杉醇。然而，TPL在臨床應用中由于其嚴重的全身毒性受到了限制。納米藥物載體依賴EPR效應可富集于腫瘤部位，表面引入腫瘤細胞膜過度表達某種受體的配體，通過受體介導作用可提高腫瘤細胞對藥物載體的內吞效率，將藥物遞送到腫瘤細胞內，從而降低藥物由于無選擇性而導致的全身毒性。

普朗尼克是一種兩親性的三嵌段聚合物，在水溶液中可自組裝成具有“核-殼”結構的納米膠束，將疏水性藥物包載于內核中。由于多種腫瘤細胞膜表面過度表達葉酸受體［8-10］，因而葉酸作為配體被廣泛應用于靶向藥物載體的研究。普朗尼克膠束親水鏈外殼上的羥基，很容易耦連小分子葉酸。研究發(fā)現(xiàn)2種不同普朗尼克的親水和疏水嵌段之間相互作用，可增加載藥膠束的穩(wěn)定性，不受血液稀釋的影響［11］。普朗尼克F-127分別與P105、P123以及L61制備的3種雙普朗尼克載藥膠束均能顯示出較強的抗腫瘤作用［12-14］。普朗尼克F-127和F-68常被用作藥用輔料，不僅生物相容性好，而且經濟易得，因此，筆者通過本實驗以F-127和F-68為載體材料，制備裝載TPL的葉酸修飾的雙普朗尼克載藥膠束，旨在考察腫瘤細胞對該遞藥系統(tǒng)的敏感性，為TPL靶向遞送的抗癌研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物、材料與試劑

普朗尼克F-127、F-68（BASF，Ludwigshsfen，Germany），雷公藤甲素（純度98.5%，Aladdin），葉酸、N，N’-羰基二咪唑（Aladdin），透析袋（Spectra，Millipore，MWCO 1000），胎牛血清（四季青），RPMI-1640培養(yǎng)液（Hyclone）。

1.2 雷公藤甲素遞送系統(tǒng)的制備

1.2.1 FA-F-127綴合物的制備

取適量葉酸，用DMSO溶解后，加入等摩爾的N，N’-羰基二咪唑，在暗處攪拌24 h，再加入1/4量的普朗尼克F-127，暗處反應24 h。反應混合物裝入透析袋，用去離子水透析72 h，期間每隔3～6 h更換1次去離子水，再經冷凍干燥后得到葉酸修飾的普朗尼克F-127綴合物（FA-F-127）。

1.2.2 FA-F-127/F-68-TPL的制備

將普朗尼克F-68和FA-F-127各100 mg以及7 mg的TPL，用適量無水乙醇充分溶解，室溫下以氮氣流將溶劑蒸干，真空干燥過夜后得到透明的薄膜。將薄膜用一定量的去離子水，在50 ℃條件下，300 rpm·min-1攪拌30 min進行水化，靜置至室溫后，用0.22 μm無菌濾膜過濾，得到FA-F-127/F-68-TPL溶膠溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩-127/F-68-TPL溶膠溶液中TPL的含量采用RP-HPLC法測定。以下實驗所提及FA-F-127/F-68-TPL的濃度實則為含TPL的濃度。

1.2.3 FA-F-127/F-68的制備

不加雷公藤甲素，與1.2.2同法制備FA-F-127/F-68（空載體）溶膠溶液。

1.3 細胞及細胞培養(yǎng)

HepG2細胞（人肝癌細胞系）、MCF-7細胞（人乳腺癌細胞系）、769-P細胞（人腎癌細胞系），均購自武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心；SK-MES-1 細胞（人肺鱗癌細胞系），購自上海科學院細胞保藏中心。4種細胞均置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 倒置顯微鏡觀察

將對數(shù)生長期的HepG2、SK-MES-1、MCF-7和769-P 4種細胞分別接種于6孔培養(yǎng)板。待24 h細胞貼壁后，將每種細胞分為7 組。3 個濃度的FA-F-127/F-68-TPL 組，分別更換含25、50、100 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL 的完全培養(yǎng)液；3 個濃度的FA-F-127/F-68（空載體）組，分別更換與FA-F-127/F-68-TPL組含等濃度載體的完全培養(yǎng)液；1個對照組，更換新鮮的完全培養(yǎng)液。將細胞置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況并拍照。

1.5 生長抑制率和半數(shù)抑制濃度測定

將對數(shù)生長期的HepG2、SK-MES-1、MCF-7和769-P細胞分別以每毫升1×104密度接種于96孔培養(yǎng)板。待細胞貼壁后，將每種細胞分為4個濃度（25、50、100、200 ng·mL-1）的FA-F-127/F-68-TPL組，并設空載體組以及1個對照組，加藥方法同上。將細胞置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT與細胞共孵育4 h后，棄掉每孔液體，加入DMSO 150 μL，震蕩15 min，多功能酶標儀（SpectraMax Paradigm，Molecular Devices，USA）檢測各孔在570 nm處的吸光度（OD）值。各重復孔的OD值取平均值，計算細胞的生長抑制率，并利用在線擬合工具獲得擬合函數(shù)，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.6 腫瘤細胞的活性測定

將對數(shù)生長期的HepG2、SK-MES-1以及MCF-7細胞分別以每毫升1×104密度接種于96孔培養(yǎng)板。待細胞貼壁后，將每種細胞分為FA-F-127/F-68-TPL組、裸藥TPL組和對照組。FA-F-127/F-68-TPL組和TPL組分別更換含F(xiàn)A-F-127/F-68-TPL和TPL濃度為50 ng·mL-1的培養(yǎng)液，對照組更換新鮮的完全培養(yǎng)液。細胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于藥物作用細胞24、48、72 h 時，檢測各孔的OD 值，方法同上。各重復孔的OD值取平均值，采用統(tǒng)計學t檢驗分析組間差異性。

2 結果

2.1 FA-F-127/F-68-TPL對腫瘤細胞形態(tài)及生長狀態(tài)的影響

在FA-F-127/F-68-TPL作用細胞24 h或48 h時，光鏡下可見對照組與空載體組的HepG2、SK-MES-1、MCF-7以及769-P細胞均生長旺盛，沒有明顯差異，說明空載體對4種細胞均無明顯影響。而不同濃度的FA-F-127/F-68-TPL對4種細胞的生長狀態(tài)與對照組比較有不同程度的影響。

2.1.1 FA-F-127/F-68-TPL對肝癌細胞的影響

圖1 顯示FA-F-127/F-68-TPL 作用HepG2 細胞的光鏡觀察結果。作用HepG2 細胞24 h，濃度為25 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL 使HepG2 細胞的數(shù)量明顯減少，可見FA-F-127/F-68-TPL 能抑制細胞增殖；當濃度為50 ng·mL-1以上時，F(xiàn)A-F-127/F-68-TPL導致大量的HepG2細胞死亡而漂浮于培養(yǎng)液中。作用HepG2細胞48 h，25 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL也可使大量HepG2細胞死亡。

圖1 FA-F-127/F-68-TPL處理HepG2細胞24 h和48 h的光鏡照片F(xiàn)ig.1 Light microscope photos of HepG2 cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24 h and 48 h

2.1.2 FA-F-127/F-68-TPL 對肺癌細胞的影響

圖2 顯示FA-F-127/F-68-TPL 作用SK-MES-1 細胞的光鏡觀察結果。FA-F-127/F-68-TPL 作用SK-MES-1 細胞24 h，25 ng·mL-1組的SK-MES-1 細胞增殖減慢，50 ng·mL-1和100 ng·mL-1組的SK-MES-1 細胞大量死亡；作用SK-MES-1 細胞48 h 時，F(xiàn)A-F-127/F-68-TPL各濃度組均可見大量漂浮的死亡細胞。

圖2 FA-F-127/F-68-TPL處理SK-MES-1細胞24 h和48 h的光鏡照片F(xiàn)ig.2 Light microscope photos of SK-MES-1 cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24 h and 48 h

2.1.3 FA-F-127/F-68-TPL對乳腺癌細胞的影響

圖3顯示FA-F-127/F-68-TPL作用MCF-7細胞的光鏡觀察結果。作用MCF-7細胞24 h，與對照組比較，不同濃度FA-F-127/F-68-TPL 使MCF-7 細胞增殖減弱，形態(tài)略變圓。作用細胞48 h，25 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL使MCF-7細胞形態(tài)明顯變圓，當濃度為50 ng·mL-1以上時使MCF-7細胞大量死亡。

圖3 FA-F-127/F-68-TPL處理MCF-7細胞24 h和48 h的光鏡照片F(xiàn)ig.3 Light microscope photos of MCF-7 cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24 h and 48 h

2.1.4 FA-F-127/F-68-TPL對腎癌細胞的影響

圖4 顯示FA-F-127/F-68-TPL 作用769-P 細胞的光鏡觀察結果。FA-F-127/F-68-TPL 作用后的769-P細胞明顯的變化是細胞逐漸收縮，隨細胞收縮加重，769-P細胞通過伸出突起相互連接，變?yōu)橄嗷ザ逊e。作用細胞24 h或48 h，F(xiàn)A-F-127/F-68-TPL導致細胞收縮的程度與其濃度呈正相關；同一濃度的FA-F-127/F-68-TPL導致細胞收縮的程度與作用時間呈正相關。

圖4 FA-F-127/F-68-TPL處理769-P細胞24 h和48 h的光鏡照片F(xiàn)ig.4 Light microscope photos of 769-P cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24 h and 48 h

總之，通過光鏡觀察可知，F(xiàn)A-F-127/F-68-TPL 能使HepG2、SK-MES-1、MCF-7 和769-P 細胞增殖減慢，形態(tài)改變，甚至誘導細胞死亡。由此可認為，F(xiàn)A-F-127/F-68-TPL 對4 種細胞都有一定的毒性作用。根據FA-F-127/F-68-TPL誘導腫瘤細胞死亡的作用時間和使用劑量，評價4種腫瘤細胞的敏感性。由于50 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL 作用腫瘤細胞24 h 時，能誘導大量的HepG2 細胞和SK-MES-1細胞死亡，而作用腫瘤細胞48 h時，才能誘導MCF-7細胞死亡，但仍不能誘導769-P細胞死亡。由此可初步推測，HepG2和SK-MES-1細胞對FA-F-127/F-68-TPL較為敏感，而769-P細胞的敏感性最差。

2.2 FA-F-127/F-68-TPL對腫瘤細胞的生長抑制率和IC50

作用HepG2、SK-MES-1、MCF-7和769-P細胞24 h后，不同濃度的空載體組與對照組的OD 值無統(tǒng)計學差異，說明在此濃度范圍內空載體對腫瘤細胞沒有影響。

生長抑制率大于30%以上被認為有抑制作用。由表1的生長抑制率可知，作用細胞24 h，50～200 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL對HepG2細胞和SK-MES-1細胞有抑制作用。表2數(shù)據顯示，F(xiàn)A-F-127/F-68-TPL對HepG2細胞的IC50低于對SK-MES-1細胞的IC50，100～200 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL對MCF-7細胞有抑制作用，而對769-P細胞無抑制作用。由此可見，4種腫瘤細胞對FA-F-127/F-68-TPL的敏感順序應為HepG2細胞＞SK-MES-1細胞＞MCF-7細胞＞769-P細胞。

表1 FA-F-127/F-68-TPL作用腫瘤細胞24 h的生長抑制率Tab.1 Growth inhibition rate of tumor cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24 h

表2 FA-F-127/F-68-TPL對腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）Tab.2 Half inhibitory concentration（IC50）of FA-F-127/F-68-TPL on tumor cells

2.3 FA-F-127/F-68-TPL與TPL的細胞毒性比較

測定細胞的吸光度值（OD值），可判斷細胞的活性。OD值越小，細胞活性越弱，同時反映藥物的毒性越大。圖5顯示，50 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL作用HepG2、SK-MES-1和MCF-7細胞24 h，對于各種細胞，F(xiàn)A-F-127/F-68-TPL 組的OD 值與對照組比較有顯著性差異（P＜0.01），而TPL 組的OD 值與對照組比較則無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。說明這3種腫瘤細胞對濃度為50 ng·mL-1的TPL不敏感，而對FAF-127/F-68-TPL則敏感。

圖5 FA-F-127/F-68-TPL作用各種腫瘤細胞24 h的各組細胞OD值Fig.5 OD values of various tumor cells in each group after FA-F-127/F-68-TPL treating for 24 h

作用細胞24～72 h，HepG2、SK-MES-1和MCF-7細胞的OD 值變化曲線（圖6（a）、圖6（b）和圖6（c））均顯示：FA-F-127/F-68-TPL組的OD值變化曲線呈下降趨勢，而TPL組的OD值變化曲線接近對照組的OD值變化曲線，呈上升趨勢。說明FA-F-127/F-68-TPL對3種腫瘤細胞的毒性比同濃度的TPL的細胞毒性大。在作用細胞24、48、72 h的時間點，3種細胞的FA-F-127/F-68-TPL組的OD值均小于對照組的OD 值（P＜0.01），同時，也均小于TPL 組的OD 值（P＜0.01）。說明FA-F-127/F-68-TPL 和TPL 對腫瘤細胞的毒性有顯著性差異。

圖6 FA-F-127/F-68-TPL作用腫瘤細胞24～72 h的OD值變化曲線Fig.6 Change curves of OD value of tumor cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24～72 h

這些結果說明，F(xiàn)A-F-127/F-68-TPL比裸藥的毒性大，從而提高腫瘤細胞的敏感性。

3 討論

倒置顯微鏡是觀察培養(yǎng)細胞最常用的工具之一，其操作技術簡單，能夠方便、快速地對培養(yǎng)細胞進行連續(xù)的動態(tài)觀察。細胞形態(tài)能直觀地反映細胞的生存狀態(tài)，細胞形態(tài)的改變是判斷細胞生存狀態(tài)好壞的最直接證據之一，可直觀、定性地考察抗癌藥物的療效。本實驗倒置顯微鏡觀察了FA-F-127/F-68-TPL對培養(yǎng)的4種腫瘤細胞生存狀態(tài)的影響，根據FA-F-127/F-68-TPL的劑量和作用時間、腫瘤細胞形態(tài)的改變程度、誘導細胞死亡，定性評價4種腫瘤細胞對FA-F-127/F-68-TPL的敏感性。

腫瘤細胞的一個重要生物學特征就是細胞的持續(xù)分裂和不斷增殖，因此，對腫瘤細胞的增殖抑制是評價藥物療效的一個重要指標。MTT比色法常用于體外檢測抗癌藥物活性，間接判斷細胞的存活率和增殖程度。該方法靈敏度高，重復性好，操作簡便、經濟、快速，實驗結果比較可靠，一直被廣泛用于抗腫瘤藥物敏感性的測定和篩選實驗。本實驗通過MTT試驗評價4種腫瘤細胞對FA-F-127/F-68-TPL的敏感性，與倒置顯微鏡觀察結果基本相符。因此，可推測4種腫瘤細胞對FA-F-127/F-68-TPL的敏感順序為HepG2細胞＞SK-MES-1細胞＞MCF-7細胞＞769-P細胞，且FA-F-127/F-68-TPL提高了腫瘤細胞的敏感性。