自動QuEChERS-UPLC-MS/MS 檢測茶葉中68 種農殘

吳 艷

（福建省產品質量檢驗研究院，福建福州 350002）

茶樹適宜的生長環境一般比較溫暖潮濕，加上種植單一化、缺乏生物多樣性的特點，較易發生病蟲草害[1]。國家允許在茶樹種植過程中使用一些低毒高效的農藥，以保證產品質量和產量。有些茶農盲目追求茶葉產量，濫用或誤用農藥，導致茶葉中農藥殘留遠遠超過國家規定的限量[2-3]，隨著殘留農藥對人體健康和環境所造成的影響越來越受到各國政府和公眾的關注，許多國家都開展了相關研究[4-6]，相繼制定了更嚴格的農藥殘留限定標準和更低的最高殘留限量（MRL）[7-9]，并研究開發出新技術方法加強對茶葉中農藥殘留的檢測工作[10]，確保茶葉的產品質量安全。

農藥種類繁多，茶葉種植過程中經常存在多種農藥同時使用的問題，使檢測工作更具難度和挑戰[11]，傳統農藥殘留檢測樣品前處理步驟復雜和儀器分析時間較長[12]。因此，有必要建立一種集簡單、快速、自動化水平高的前處理技術和分析時間短、定性定量準確的儀器分析技術于一體的檢測方法。

以茶葉中吡唑醚菌酯、噻蟲胺、噻嗪酮、唑蟲酰胺等68 種常用的農藥為測試目標化合物，采用全自動QuEChERS 樣品前處理設備結合超高效液相色譜- 串聯質譜儀（UPLC-MS/MS），建立一種更快、更準確、更靈敏的方法，為茶葉質量安全監測提供方法參考與支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品：76 份茶葉樣品，均購自福建省福州市、泉州市、寧德市和南平市的超市和茶葉店。

68 種農藥標準品（純度≥95%），天津阿爾塔公司提供；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、乙二胺- N- 丙基硅烷化硅膠（PSA）、石墨化炭黑（GCB），日本島津公司提供；多壁碳納米管（MWCNTS）、氨基化多壁碳納米管（MWCNTS-NH2），天津Bonna-Agela 公司提供；醋酸鈉、乙酸、無水MgSO4（分析純），國藥集團提供；丙酮、乙酸乙酯、乙腈（色譜純），Meker 公司提供。

1.2 儀器與設備

METTLER AL204101 型電子天平，梅特勒- 托利多儀器公司產品；Milli-Q 型超純水系統，美國Millipore 公司產品；AB SCIEX Triple Quad 5500 型液相色譜- 串聯三重四極桿質譜儀（配ESI 源）；全自動QuEChERS 樣品前處理系統，北京慧榮和科技有限公司產品；K600 型粉碎機，德國Braun 公司產品。

1.3 標準溶液配制

混合標準儲備溶液：稱取適量的各農藥標準品于50 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制乙酰甲胺磷、涕滅威、甲拌磷砜、特丁硫磷、氯菊酯、甲基異柳磷、殺螟丹、聯苯菊酯、依維菌素質量濃度均為50 mg/L；殺蟲脒、特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜、甲拌磷、水胺硫磷、毒死蜱、氟蟲脲、西瑪津質量濃度均為20 mg/L；其他各農藥質量濃度均為10 mg/L 的混合標準儲備液，于避光-18 ℃及以下條件保存。

混合標準溶液：吸取一定量混合標準儲備液，用乙腈稀釋，配制乙酰甲胺磷、涕滅威、甲拌磷砜、特丁硫磷、氯菊酯、甲基異柳磷、殺螟丹、聯苯菊酯、依維菌素質量濃度均為0.005，0.010，0.050，0.250，1.000，2.500 mg/L；殺蟲脒、特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜、甲拌磷、水胺硫磷、毒死蜱、氟蟲脲、西瑪津質量濃度均為0.002，0.004，0.020，0.100，0.400，1.000 mg/L；其他各農藥質量濃度均為0.001，0.002，0.010，0.050，0.200，0.500 mg/L，現用現配。

基質匹配標準工作溶液：選擇未檢出目標物的茶葉樣品按照1.4.1 方法進行前處理作為空白基質溶液。吸取一定量混合標準儲備液，用空白基質溶液稀釋，濃度與混合標準溶液一致，現用現配。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品前處理

取500 g 茶葉于粉碎機中，調節10 檔轉速粉碎3 min 備用。稱取制備茶粉2 g（精確至0.01 g） 于50 mL 塑料離心管中，放入自動QuEChERS 樣品前處理設備中，設置試驗方案（在樣品中加10 mL 超純水渦旋混勻，靜置30 min，加入10 mL 乙腈，劇烈震蕩3 min，再加入醋酸鈉1.5 g、無水MgSO46 g，再次劇烈振蕩1 min 后離心。取4 mL 樣液至內含無水硫酸鎂600 mg，PSA 200 mg，C18200 mg，MWCNTS-NH250 mg的QuEChERS 凈化管中，渦旋混勻1 min 后離心，準確吸取2 mL 上清液于15 mL 試管中），運行試驗方案，待儀器停止后，取出15 mL 試管，吸取凈化液過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜，待測。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：Waters HSST3，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；流動相A 為0.002 mol/L 乙酸銨（含0.02%甲酸），流動相B 為甲醇；柱溫40 ℃，進樣量1 μL，流速0.4 mL/min，流動相采用梯度洗脫程序。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.3 質譜條件

離子源類型：電噴霧離子化（ESI），掃描方式：正、負離子同時掃描，電噴霧電壓5 500 V（ESI+）、-4 500 V（ESI-），離子源溫度550 ℃，霧化氣0.345 MPa，輔助加熱氣0.345 MPa。數據采集模式為多反應監測模式（MRM）。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優化

2.1.1 提取劑的選擇

市售茶葉一般比較干燥，含水量較少，前處理過程中可先加入水浸泡一段時間以提高茶葉細胞的通透性，再加入有機溶劑提取，從而提高農殘的析出。茶葉用水浸泡后，水溶性雜質也隨之溶出并轉移到提取液中，增加凈化難度[13]，常用的提取溶劑中，甲醇、丙酮與水不易分離，研究發現[14]，乙腈對不同極性農藥均有較高的提取率，且乙腈能與水互溶，在鹽作用下又能與水兩相分離。同時，采用乙腈提取比其他常用溶劑（如甲醇、丙酮） 提取帶入的雜質要少。采用乙酸酸化乙腈，可改善部分農藥殘留項目（如丁硫克百威） 在純乙腈中不穩定的現象。因此，試驗采用了1.0%乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 吸附劑種類選擇

QuEChRS 通常采用PSA、C18和GCB 混合后作為凈化材料，該凈化材料提高凈化效果同時減少基質干擾[15-16]。PSA 能夠顯著除去茶葉中的糖類、脂肪酸等干擾物質；C18主要用于吸附脂質等非極性物質；GCB 對茶葉提取液中含有的色素的去除能力較強，但是很多平面結構的農藥，也會被其吸附，從而導致部分農藥殘留檢測的準確性下降[17-18]。因此，在參考國標方法[19]使用PSA 200 mg和C18200 mg吸附劑的基礎上，采用正交試驗法考查了再加入GCB，MWCNTS-NH2和MWCNTS 的凈化效果，結果表明使用MWCNTS-NH250 mg 效果最佳。

2.1.3 全自動QuEChERS 系統參數優化

全自動QuEChERS 樣品前處理設備集成了自動開合蓋、自動加液、自動加鹽、自動加陶瓷勻質子、震蕩、渦旋、離心、冰浴和精密移液等功能，儀器集成的上述各獨立模塊，由多功能機械臂為調度中心，通過算法軟件串聯各功能模塊，可進行多組樣品并行試驗，一次可同時處理60 個樣品，操作簡單、全程無需人員值守，避免人工操作誤差，保證檢測準確性，實現全流程自動化檢測，大幅提高了試驗效率。相較于人工QuEChERS，能夠獲得高回收率，同時其結果穩定性也更好。

除上述吸附劑種類外，對試驗結果準確度影響較大的參數還有：純水浸泡時間、浸泡時間、凈化劑使用量。選取上述4 個因素，按照1.4.1 的方法處理空白茶葉樣品，測試0.05 mg/kg 加標水平下儀器的前處理效果，以68 種目標化合物的平均回收率為測試指標，進行四因素三水平的正交試驗。對結果影響程度依次為吸附劑種類＞吸附劑用量＞浸泡時間＞提取時間，綜合考慮效率、成本等方面，最終選定的前處理條件為浸泡時間30 min，提取時間3 min，凈化吸附劑選用PSA 200 mg，C18200 mg和MWCNTS-NH250 mg。

2.2 儀器條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇

主要對比了Waters BEH C18（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm） （文獻[19]報道多采用C18色譜柱） 和Waters HSS T3（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm） 色譜柱的效果。結果表明，HSS T3 色譜柱對68 種化合物的保留能力、峰型、化合物響應上都優于C18色譜柱，因此選擇HSS T3 柱作為分析柱。

2.2.2 流動相的選擇

采用乙腈為有機相；在水相中加入一定比例的乙酸銨可以促進化合物的電離，對比了流動相A 相乙酸銨不同含量和不同流速對目標化合物的分離效果的影響。乙酸銨含量主要影響目標化合物的保留時間和響應強度，流速主要影響目標化合物的保留時間和峰形。綜合考慮不同條件下的分離效果，最終選擇濃度為0.002 mol/L 乙酸銨水溶液（含0.02%甲酸） 作為流動相A 相，設置流速為0.4 mL/min，使目標化合物達到一個更好的分離檢測效果。為了實現提高分離效率同時縮短檢測時間，對色譜流動相洗脫程序進行優化，使68 種農藥的出峰時間介于0.50～6.88 min。

2.3 基質效應的評價

基質效應計算公式：

式中：A——目標物在樣品基質中的峰面積；

B——目標物在純溶劑中的峰面積。

當ME 大于0 時表現為基質增強；ME 絕對值小于25 %時，基質效應可忽略；ME 絕對值在25%～50%時，基質效應略顯著；ME 絕對值大于50%時，基質效應顯著。

各目標農藥的線性回歸參數、檢出限和基質效應見表2。

表2 各目標農藥的線性回歸參數、檢出限和基質效應

由表2 可知，除甲磺隆、氯磺隆和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽表現為基質增強外，其他65 種目標物均表現為基質抑制效應，且噻蟲嗪、殺蟲脒等7 種農藥基質效應顯著。因此，采用基質匹配標準曲線進行定量，以消除基質效應。

2.4 線性范圍和檢出限

將茶葉空白樣品用1.4.1 的樣品前處理方法，得到基質提取液，再用1.3 中方法制備基質標準工作溶液，以每種農藥的質量濃度為X 軸，定量離子對的峰面積為Y 軸繪制標準曲線。68 種農藥在各自線性范圍內均呈良好的線性關系， 線性相關系數均高于0.99。68 種農藥的LOD（3 S/N） 與LOQ（10 S/N）分別在0.03～1.02 μg/kg 與0.11～3.39 μg/kg。

0.05 mg/kg 基質加標樣品提取液的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 0.05 mg/kg 基質加標樣品提取液的MRM 色譜圖

2.5 加標回收及精密度

在空白茶葉試樣添加水平分別為各農藥組分的1 倍定量限、2 倍定量限和10 倍定量限，每個水平做6 個平行。在3 個不同添加水平下，68 種農藥的加標回收率為73.1%～108.5%，相對標準偏差（RSD）為0.1%～9.3%，表明方法的準確度和精密度均較好。

2.6 實際樣品檢測

利用所建立的方法對市售的76 份不同茶葉樣品進行68 種農藥殘留的檢測。結果顯示，有16 份樣本均未檢出以上68 種農藥；共有15 種農藥被檢出，檢出率從高到低依次為聯苯菊酯、唑蟲酰胺、多菌靈、呋蟲胺、噻嗪酮、茚蟲威、噻蟲嗪、吡蟲啉、噠螨靈、毒死蜱、苯醚甲環唑、噻蟲啉、吡唑醚菌酯、噻蟲胺、水胺硫磷，分別在53，36，25，22，20，15，13，11，9，7，6，4，4，2，2 份樣本檢出，其中2 份檢出水胺硫磷的茶葉結果不合格，其他茶葉結果均合格。

3 結論

應用氨基化多壁碳納米管改進全自動QuECh-ERS 法結合超高效液相色譜- 串聯質譜，針對茶葉基質中68 種農藥殘留，建立了一種自動化程度高的樣品前處理與快速檢測技術。優化樣品前處理各參數，使檢出限和定量限滿足檢測的需求。該方法簡化了復雜基質前處理的流程， 能夠滿足茶葉農藥殘留檢測需求，且準確度高、靈敏度好、分析時間短、簡便快速，可用于大批量茶葉樣品中68 種農藥殘留的快速檢測，能夠有效地節省人力資源和降低出錯率，以期實現實驗室降本增效。