奶牛子宮內膜炎乳房鏈球菌耐藥性與毒力基因檢測分析

劉志強

香河縣農業農村局，河北廊坊 065400

0 引言

子宮內膜炎是奶牛常見產科疾病，不僅損害機體健康，還會引起不孕、泌乳量下降、產犢間隔延長、淘汰率增加和養殖經濟損失[1]。該病的致病因素復雜，但細菌感染是引起奶牛子宮內膜炎的主要原因，包括葡萄球菌、大腸埃希菌、鏈球菌等數十種病原菌[2]。乳房鏈球菌（Streptococcus uberis，S.uberis）是具有溶血能力的革蘭氏陽性球菌，直徑小于2.0 μm，兼性厭氧，營養要求高[3]，是圈舍飼養環境普遍存在的細菌[4]，可致奶牛感染乳房炎、子宮內膜炎等疾病。細菌的致病機制與毒力因子密切相關，S. uberis菌株攜帶與其致病力和持續感染相關的毒力因子，如透明質酸莢膜的編碼基因hasA、hasB、hasC，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）編碼基因gapC及黏附相關基因等，可在宿主中黏附定植，造成組織細胞損傷，逃避宿主免疫應答，持續破壞宿主免疫系統，引起宿主機體致病[5，6]。臨床治療奶牛子宮內膜炎中，抗生素發揮重要作用，但存在不合理使用造成細菌耐藥性、牛奶抗生素殘留超標等問題。對S.uberis耐藥性監測有利于科學合理使用抗生素，提高藥物治療效果，降低細菌耐藥性。本研究采集香河縣部分奶牛場子宮內膜炎患牛的子宮黏液樣本，對S.uberis進行分離鑒定、耐藥性、毒力基因檢測，了解分離菌株攜帶毒力基因致病機制、細菌耐藥性，為有效防控奶牛子宮內膜炎提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2023年6月，選取香河縣5 家奶牛場臨床表現發情不規律、屢配不孕、子宮分泌棕褐色或紅色膿性黏液的76 頭空懷奶牛，每頭采用輸精槍進入子宮，通過獸用注射器吸取子宮黏液，裝入采樣管，1 份/頭，共收集樣本76 份，送實驗室備檢。

1.2 主要培養基、試劑和抗生素

血瓊脂平板、CAMHB肉湯，購自廣東環凱微生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；2×Taq Super Master Mix，DL2000 DNA Marker，購自天根生化科技（北京）有限公司；紅霉素、氨芐西林等8 種抗生素，購自杭州微生物試劑有限公司；細菌16S rRNA通用引物及hasA、hasB、hasC等10 種毒力基因特異性引物，由北京擎科生物技術有限公司合成，引物生物信息見表1。

表1 11 種基因PCR 引物生物信息

1.3 主要儀器

DNA凝膠成像系統、酶標儀、PCR擴增儀，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.4 乳房鏈球菌PCR 鑒定

將病料無菌接種于血瓊脂平板，37 ℃培養24 h，挑取白色或灰白色、邊緣整齊、表面光滑隆起、光澤鮮亮、細小的卵圓形菌落，再連續傳代3 次接種于血瓊脂平板，取純培養菌落，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取S. uberis的DNA，以此為模板，使用16S rRNA引物進行PCR擴增。

擴增體系為25 μL：2×Taq Super Master Mix 12.5 μL，濃度10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，DNA模板 2 μL，滅菌超純水補至25 μL，同時以滅菌超純水為陰性對照。

反應程序：95 ℃預變性5 min；93 ℃變性25 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，共運行30 個循環；72 ℃終延伸8 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為陽性后送北京擎科生物技術有限公司進行核酸測序，并在NCBI數據庫中利用Blast程序與收錄的參考菌株乳房鏈球菌（登錄號：JF896457.1）比對，確定分離菌株的屬和種。

1.5 乳房鏈球菌耐藥性檢測

根據美國臨床實驗室標準委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）（2017版）發布的《需氧菌稀釋法藥敏試驗指南》，采用微量肉湯稀釋法測定氨芐西林、四環素、紅霉素、左氧氟沙星、克林霉素、利福平、慶大霉素、頭孢噻呋共8 種抗菌藥對分離菌株乳房鏈球菌的最小抑菌濃度（M i n i m u m Inhibitory Concentration，MIC）。在96 孔板中加入100 μL抗菌藥液，使用CAMHB肉湯對其進行2 倍梯度稀釋，然后加入1 0 0 μ L 終濃度為1 × 105CFU/mL的菌懸液，37 ℃培養2 4 h。質控菌株為肺炎鏈球菌A T C C 4 9 6 1 9。觀察每孔混合液變化，若96 孔板中肉湯培養基混濁，表明有細菌生長；若肉湯培養基完全清亮，表明無細菌生長[12]。以無細菌生長的抗菌藥最小濃度作為該抗菌藥對S. uberis的MIC。并參照CLSI發布的8 種抗菌藥耐藥臨界值判斷抗生素耐藥性，見表2。

表2 8 種抗菌藥的耐藥臨界值 單位：μg/mL

1.6 乳房鏈球菌毒力基因檢測

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取S. uberis基因組DNA，以hasA、hasB、hasC、slp、sua、gapC、pauA、fpb、acdA、cfu為特異性引物，用PCR檢測S. uberis毒力基因攜帶情況。PCR擴增體系和反應條件同1.4（各引物退火溫度見表1）。

2 結果

2.1 乳房鏈球菌分離鑒定

76 份樣本經過細菌分離培養，有18 份產生的菌落特征符合乳房鏈球菌，進一步采用PCR分子鑒定。這18 株分離菌經與NCBI數據庫收錄的參考菌株同源性比對，均達到96.6%以上，為S. uberis。總分離率23.68%，5 家養殖場18 株S.uberis分離情況見表3。

表3 18 株乳房鏈球菌分離情況

2.2 乳房鏈球菌耐藥性檢測

采用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法進行18 株S.uberis對8 種抗生素的耐藥性檢測。結果發現（表4），其耐藥率為16.67%～88.89%。9 株對紅霉素耐藥，MIC值為0.063～2 μg/mL；6 株對左氧氟沙星耐藥，MIC值為0.031～32 μg/mL；12 株對克林霉素耐藥，MIC值為0.125～4 μg/mL；16 株對慶大霉素耐藥，MIC值為0.25～32 μg/mL；13 株對四環素耐藥，MIC值為0.125～16 μg/mL；10 株對氨芐西林耐藥，MIC值為0.063～32 μg/mL；3 株對頭孢噻呋耐藥，MIC值為0.125～4 μg/mL；10 株對利福平耐藥，MIC值為0.125～16 μg/mL。

表4 乳房鏈球菌耐藥性檢測結果 單位： %

2.3 乳房鏈球菌毒力基因檢測

用PCR對18 株乳房鏈球菌的10 種毒力基因進行檢測（表5），結果顯示，有9 種毒力基因被檢出，但未檢出hasC。所有菌株均檢出slp、sua、gapC、fpb、cfu、pauA，而hasA、hasB、acdA檢出率分別為38.89%（7/18）、50.00%（9/18）、33.33%（6/18）。共有5 種類型毒力基因組合，其中slp＋sua＋cfu＋gapC＋fpb＋pauA＋acdA和slp＋sua＋cfu＋gapC＋fpb＋pauA＋hasB占比較高，分別為27.78%和33.33%。

表5 9 種毒力基因組和類型

3 討論

乳房鏈球菌為常見的環境性致病菌，是一種廣泛存在于奶牛體內不同部位、墊料、土壤及奶牛群環境中的病原菌，對人和動物均能表現易感，但一般不引起發病，只在宿主免疫力下降或組織發生損傷時才出現明顯的炎癥反應。分娩母牛在產犢過程中子宮頸口處于張開狀態，定植于生殖道內的正常菌群及環境性致病菌逆行進入子宮，大部分致病菌在21 d內通過奶牛子宮的自凈作用被排出體外，而無法排出的致病菌可導致奶牛感染子宮內膜炎。大量研究證實，乳房鏈球菌是奶牛子宮內膜炎的主要致病菌之一。王孝武等[13]報道，甘肅某奶牛場子宮內膜炎病原菌的分離鑒定結果發現，乳房鏈球菌分離率為8.33%。凌丁等[14]對南寧市郊奶牛子宮內膜炎病原菌進行研究，發現乳房鏈球菌分離率為25.00%。李蕊等[15]對保定市奶牛子宮內膜炎的致病菌進行分離鑒定，乳房鏈球菌檢出率為20.80%。本研究對76 份奶牛子宮內膜炎樣本進行乳房鏈球菌分離鑒定，總分離率為23.68%。表明乳房鏈球菌已成為不同地區、不同奶牛場的奶牛子宮內膜炎常見致病菌。

細菌致病力與其攜帶毒力因子密切相關，研究毒力因子有助揭示致病機理，建立疫病診斷方法，篩選基因靶點研制疫苗。pauA基因編碼纖溶酶原激活物，可將纖溶酶原激活為纖溶酶，水解宿主細胞外基質蛋白及上皮細胞緊密連接蛋白，促進細菌定植及擴散[4]，pauA能激活牛、羊和馬纖溶酶原的纖溶酶原激活劑，但不能激活豬或人纖溶酶原[16]。透明質酸莢膜由hasA、hasB、hasC基因編碼，因其在吞噬中發揮重要作用而成為主要毒力因子之一[17]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）由gapC基因編碼，是一種廣泛存在于原核和真核生物表面的酶，參與糖酵解，將甘油醛-3-磷酸甘油轉化為1，3-二磷酸甘油酸，被認為是毒力因子[18，19]。乳房鏈球菌黏附分子能結合乳鐵蛋白，在乳房炎發病機制中起重要作用，由sua基因編碼。cfu基因編碼CAMP因子，可增強β-溶血型金黃色葡萄球菌的溶血活性。acdA基因編碼Zn結合蛋白，slp基因編碼表面脂蛋白，fpb基因編碼一種經分選酶加工的表面蛋白[6]。本研究18株乳房鏈球菌均攜帶毒力基因slp、sua、cfu、gapC、fpb和pauA，表明這些毒力基因在致病過程中發揮主要作用，并且流行廣泛，可作為研制疫苗的候選基因。hasA、hasB和acdA檢出率較低，表明不是主要致病因子，其發病機理有待進一步研究。

長期以來，在奶牛子宮內膜炎的治療中，抗菌藥依然是常用藥物，但不合理使用和耐藥基因變化導致細菌耐藥性問題日益嚴重。對細菌進行耐藥性監測可為臨床使用抗菌藥提供參考，降低細菌耐藥性和多種耐藥譜擴大。本研究對8 種抗菌藥的乳房鏈球菌MIC值進行檢測，結果表明，乳房鏈球菌對慶大霉素、克林霉素、四環素耐藥性較嚴重，分別達88.89%、66.67%、72.22%，僅對左氧氟沙星和頭孢噻呋較敏感。Zhang等[20]報道，從我國西北地區臨床型奶牛乳房炎病例分離的乳房鏈球菌對四環素（耐藥率81.3%）和克林霉素（耐藥率62.5%）高度耐藥，而對氨芐西林（耐藥率2.7%）敏感。趙祎云等[21]發現，蘭州地區奶牛乳房炎乳房鏈球菌對氨芐西林、左氧氟沙星耐藥。Garch等[22]2015—2016年對歐洲乳房炎調查，結果表明大部分乳房鏈球菌對氨芐西林敏感，24.0%、37.5%的菌株分別對紅霉素、四環素耐藥。上述結果表明細菌耐藥性存在區域差異化，這與養殖場使用抗菌藥習慣有關。

4 結論

本研究表明，香河縣奶牛子宮內膜炎病例中乳房鏈球菌的分離率較高，攜帶多種已知毒力基因。該地區乳房鏈球菌對慶大霉素、克林霉素、四環素耐藥性較高，對左氧氟沙星和頭孢噻呋較敏感。