生乳中黃曲霉毒素M1快速檢測方法的比對

李 婕，曹學(xué)思，楊愛君，何 瑛，紀(jì)坤發(fā)，羅少杰

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 510000

0 引言

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是迄今發(fā)現(xiàn)污染農(nóng)產(chǎn)品毒力最強的一類生物毒素[1]。常見的有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，其中AFB1的含量與毒力最大[2]。黃曲霉毒素B1通常存在于花生、玉米、堅果等農(nóng)副產(chǎn)品中[3]。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1的4-羥基衍生物[2]。它是動物在攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料和食品后在體內(nèi)產(chǎn)生的代謝物[4]，可致癌、致畸、致突變，其結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，溶于多種有機(jī)試劑，如氯仿、乙腈和甲醇等[5，6]，存在于動物分泌的乳汁和尿液中。牛乳是受黃曲霉毒素M1污染風(fēng)險程度較高的食品之一。為保證安全衛(wèi)生，各國都制定了嚴(yán)格限量標(biāo)準(zhǔn)：美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）規(guī)定牛乳中黃曲霉毒素M1的限量水平為0.5 μg/kg，我國也規(guī)定牛乳中黃曲霉毒素M1含量不得超過0.5 μg/kg[7]。運用簡易、便捷、快速、準(zhǔn)確且適用的檢測方法，測定牛生乳中黃曲霉毒素M1的污染狀況，對乳品企業(yè)在日常生乳驗收、乳品生產(chǎn)制造的過程中，能更好維護(hù)產(chǎn)品質(zhì)量，保障消費者食品安全，具有重要意義。

目前測定牛乳中黃曲霉毒素M1殘留量的方法有：色譜法、免疫化學(xué)法、光電化學(xué)法、光電發(fā)光法等。這些方法操作復(fù)雜繁瑣、耗時長，或所需檢測設(shè)備昂貴，均不利于乳品企業(yè)快節(jié)奏的生乳驗收。而黃曲霉毒素M1膠體金快速檢測試紙條法是一種利用膠體金免疫層析技術(shù)的新型檢測方法，操作過程簡易、耗時短、成本低、檢出限符合國家標(biāo)準(zhǔn)，且特異性、靈敏度強，干擾性小，能較好滿足乳品企業(yè)快節(jié)奏的生乳驗收及成品奶檢測需求。本文采用黃曲霉毒素M1膠體金快速檢測試紙條法和ELISA檢測試劑盒法做比對試驗，驗證膠體金快速檢測試紙條法對不同加標(biāo)濃度檢測結(jié)果的重現(xiàn)性，驗證該法的結(jié)果穩(wěn)定性，并檢驗該法結(jié)果報陽的樣品濃度。同時，檢測ELISA檢測試劑盒法檢測結(jié)果的重現(xiàn)性、回收率和RSD值，驗證該法檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和精密度，并驗證2 種方法檢測結(jié)果的一致性，證實2 種方法聯(lián)合使用測定生乳中黃曲霉毒素M1殘留量的可行性，為乳品企業(yè)進(jìn)行快速生乳驗收提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

RomerLabs黃曲霉毒素M1ELISA檢測試劑盒，易瑞黃曲霉毒素M1膠體金快速檢測試紙條。

1.2 儀器和設(shè)備

SIGMA離心機(jī)、Thermo酶標(biāo)儀、BIOEASY金屬浴熱器、BIOEASY-SAFF Reader 02型膠體金試紙條讀數(shù)儀、BRAND 8道移液器、BRAND單道移液器、CRYSTAL漩渦振蕩器等。

2 檢測原理

黃曲霉毒素M1膠體金快速檢測試紙條法的檢測原理：樣品溶液中黃曲霉毒素M1與膠體金標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗體相結(jié)合，封閉膠體金標(biāo)記黃曲霉毒素M1抗體上的黃曲霉毒素M1抗原結(jié)合位點，阻止膠體金標(biāo)記黃曲霉毒素M1抗體與纖維素膜上檢驗區(qū)中黃曲霉毒素M1蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，使之顯色較弱，甚至不顯色；反之，如樣品溶液中沒有黃曲霉毒素M1，則不能阻止膠體金標(biāo)記黃曲霉毒素M1抗體與纖維素膜上檢測區(qū)中黃曲霉毒素M1蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，顯色較強。

黃曲霉毒素M1E L I S A 檢測試劑盒法的檢測原理：試劑盒應(yīng)用直接競爭酶聯(lián)免疫吸附原理。樣品中黃曲霉毒素M1或標(biāo)準(zhǔn)品與酶-黃曲霉毒素M1偶合物中黃曲霉毒素M1競爭結(jié)合微孔中特異抗體，經(jīng)洗板去除未參加抗原-抗體反應(yīng)的黃曲霉毒素M1，加入底物液，顏色變藍(lán)。再加入反應(yīng)終止液，反應(yīng)液顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)黃。在450 nm（OD450 nm）濾鏡及630 nm示差濾鏡下使用酶標(biāo)儀對微孔板進(jìn)行吸光度值測量。利用標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較判讀結(jié)果。

本文對生乳樣品進(jìn)行0.1 、0.2 、0.3 、0.4和0.5 μg/kg加標(biāo)，用膠體金快速檢測試紙條做平行檢測，查看檢測結(jié)果，以及試紙條在哪個殘留濃度會報陽反應(yīng)，再用ELISA檢測試劑盒對各加標(biāo)樣進(jìn)行平行定量試驗，查看檢測結(jié)果的重現(xiàn)性，驗證檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，并計算結(jié)果的回收率與RSD值，驗證其檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，比較2 種方法檢測結(jié)果的呼應(yīng)程度，驗證兩法聯(lián)用模式是否可行。

3 試驗步驟

3.1 黃曲霉毒素M1 膠體金快速檢測試紙條法檢測步驟

（1）取200 μL奶樣加入紅色試劑微孔中，抽吸5～10 次直至微孔試劑混合均勻；

（2）（40±2）℃溫育3 min；

（3）將試紙條插入紅色試劑微孔中；

（4）（40±2）℃溫育4 min；

（5）結(jié)果判讀見圖1，即陰性結(jié)果R＞1.1；弱陽性結(jié)果0.9≤R≤1.1；陽性結(jié)果R＜0.9；R值＝T/C。

圖1 儀器結(jié)果判讀示意圖

3.2 黃曲霉毒素M1 ELISA 檢測試劑盒使用方法

3.2.1 樣品前處理

（1）移液器吸取10 mL生乳到試管中，4 ℃靜置30 min；

（2）3 000 r/min加速度下將樣品離心10 min；

（3）離心樣品脂肪層下取0.4 mL去脂樣品，與0.1 mL 100%甲醇混合；

（4）準(zhǔn)備用于ELISA檢測。

3.2.2 檢測步驟

使用前，所有試劑及試劑盒內(nèi)材料需恢復(fù)至室溫。

（1）將適量標(biāo)記顏色的稀釋孔條放入微孔板架，使每個標(biāo)準(zhǔn)品或樣品對應(yīng)一個稀釋孔。

（2）將等量有抗體包被的微孔條放入微孔板架。

（3）按240 μL/孔或2 mL/條用量體積，從酶聯(lián)偶合物試劑瓶中量取所需試劑至試劑槽。使用8 道移液器移取200 μL酶聯(lián)偶合物至每個稀釋孔中。

（4）使用單道移液器，分別移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，至已裝200 μL酶聯(lián)偶合物的稀釋孔中，反復(fù)吹吸3 次以上混勻溶液，最后將吸頭中液體排空。每移取1 個標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時，必須換上新吸頭。使用換有全新吸頭的8 道移液器，快速移取每個稀釋孔中液體各1 0 0 μ L，至相應(yīng)有抗體包被的微孔中。室溫下放置6 0 min。過程中不可搖動微孔板，以免引起孔與孔之間液體污染。

（5）60 min后，將孔中液體甩入水槽，用稀釋后的沖洗緩沖液沖洗各孔，然后將微孔中的水甩入水槽中，重復(fù)5 次。沖洗后，將吸水紙巾放置在桌面上，使微孔板倒置扣擊紙面，盡可能將殘留水分排出。擦干微孔板底反面的水珠。

（6）按120 μL/孔或1 mL/條用量體積，從底物試劑瓶內(nèi)量取所需底物液至試劑槽，使用8 道移液器移取100 μL底物至每個微孔中，避光室溫下放置20 min。

（7）20 min后，按照120 μL/孔或1 mL/條用量體積，從終止液試劑瓶內(nèi)量取所需終止液至1 個試劑槽中，使用8 道移液器依序向每個微孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)。微孔顏色應(yīng)由藍(lán)變黃。

（8）用酶標(biāo)儀在450 nm濾鏡及示差濾鏡630 nm下讀取結(jié)果，記錄每個微孔的吸光度OD值。

（9）結(jié)果判讀：通過計算軟件快速得檢測結(jié)果，0 ng/kg標(biāo)準(zhǔn)品OD值需＞0.5，否則說明試劑失效。使用軟件計算結(jié)果時，其標(biāo)準(zhǔn)品曲線的線性相關(guān)系數(shù)（R）需為-1.000～-0.990。

4 儀器預(yù)熱及校準(zhǔn)

4.1 儀器預(yù)熱

開啟酶標(biāo)儀、金屬浴熱器、膠體金試劑條讀數(shù)儀，預(yù)熱30 min。

4.2 膠體金試劑條讀數(shù)儀校準(zhǔn)

讀取校準(zhǔn)紙條得讀數(shù)0.9 3 及0.9 5，符合0.90±0.10的儀器校準(zhǔn)要求，讀數(shù)儀性能正常。

5 結(jié)果與分析

5.1 膠體金快速檢測試紙條對不同濃度黃曲霉毒素M1 奶樣的檢測結(jié)果

由表1可知，膠體金快速檢測試紙條在樣品加標(biāo)濃度為0.2 μg/kg時開始報陽，遠(yuǎn)低于GB/T2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中0.5 μg/kg的要求，具有較好的初篩價值。

表1 膠體金快速檢測試紙條對不同濃度黃曲霉毒素M1 奶樣的檢測結(jié)果

5.2 ELISA 檢測試劑盒對不同濃度黃曲霉毒素M1 奶樣的檢測結(jié)果

黃曲霉毒素M1ELISA檢測試劑盒標(biāo)樣曲線線性相關(guān)系數(shù)R=-0.997 0。標(biāo)準(zhǔn)品0 μg/kg的OD值讀數(shù)1.992，符合說明書-1.000≤R≤-0.990范圍、標(biāo)準(zhǔn)品（0 μg/kg）吸光度值不低于0.5的檢測要求。具體曲線見圖2。該法檢測結(jié)果重現(xiàn)性與穩(wěn)定性結(jié)果見表2，其檢測回收率在94.83%～100.53%之間，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》中要求的60%～120%范圍，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度較高。RSD值在1.11%～3.01%之間，檢測結(jié)果的精密度較好。

表2 樣品重現(xiàn)性及回收率測定結(jié)果（n=6）

圖2 黃曲霉毒素M1 ELISA 檢測試劑盒的檢測曲線結(jié)果（R ＝-0.997 0）

6 結(jié)論

本文采用ELISA檢測試劑盒法和膠體金快速檢測試紙條法對添加了不同濃度黃曲霉素M1的生乳樣品進(jìn)行比對檢測。結(jié)果表明：膠體金快速檢測試紙條法對含有不同濃度黃曲霉毒素M1生乳樣品的測定結(jié)果呈現(xiàn)出一定梯度效應(yīng)，并在殘留量0.2 μg/kg時顯示R＜0.9陽性結(jié)果，遠(yuǎn)低于GB/T 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中要求0.5 μg/kg水平，有較好的重現(xiàn)性。其操作方便，檢測所需設(shè)備投入少，能耗低，耗時短（7 min），具有較好定性初篩檢測價值。

黃曲霉毒素M1ELISA檢測試劑盒在比對試驗中，能與膠體金快速檢測試紙條的檢測結(jié)果呼應(yīng)，且結(jié)果的重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度和精密度高，具有較好定量檢測價值。

本文討論的2 種黃曲霉毒素M1檢測法操作方便快捷，耗時短，結(jié)果有一定的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性。使用膠體金快速檢測試紙條對生乳中黃曲霉毒素M1殘留量定性初篩，發(fā)現(xiàn)試紙條結(jié)果報陽時，再利用ELISA檢測試劑盒定量試驗的聯(lián)合檢測模式，對乳品企業(yè)進(jìn)行生乳中黃曲霉毒素M1殘留量的快速篩查，有一定基礎(chǔ)參考價值。