火焰原子吸收光譜法測定牛乳中鈣含量的不確定度評定

邢益俊，劉傳栩，楊愛君，何 瑛，紀坤發

廣東燕塘乳業股份有限公司，廣東廣州 510507

0 引言

鈣是人體含量最多的礦物質元素，也是骨骼健康不可缺少的元素，適當補充鈣能促進青少年生長發育，預防中老年骨質疏松、牙齒松動和心血管疾病[1]。牛乳含豐富的鈣，很容易吸收，是人體補充鈣的最佳選擇之一[2]。市場中乳制品品類多樣，消費者也比較關注營養成分含量。鈣作為重要的營養指標之一，乳中鈣含量是實驗室日常檢測的重要項目。如何準確檢測乳中鈣含量，是實驗室工作人員首先考慮的問題。受環境、儀器設備和人員操作方法等多因素影響，可能導致測量結果不準確和誤差[3]。測量不確定度是測量系統最基本、最重要的特性指標，是測量結果的重要標志。測量不確定度越小，說明測定結果越準確[4，5]。

本試驗采用GB 5009.92—2016《食品安全國家標準_食品中鈣的測定》標準中第一法，用火焰原子吸收光譜法測定牛乳中鈣含量。該方法靈敏度高，檢測結果準確、快速，是目前測定牛乳中鈣含量最常用方法之一[6]。按照CNAS-GL006：2019《化學分析中不確定度的評估指南》[7]和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[8]評定試驗的不確定度，分析與評定牛乳中鈣含量檢測結果帶來不確定度的關鍵因素，為檢測結果準確性和可信度提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

生牛乳，來源自陽江紅五月良種奶牛場。

1.2 試劑

鈣單元素溶液標準物質（1 000 μg/mL），購自中國計量科學研究院；硝酸（65%，優級純），購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；氧化鑭（4N，高純），購自國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸（分析純），購自廣州化學試劑廠；試驗用水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規則和試驗方法》中規定的一級水。

1.3 儀器設備

Aanalyst原子吸收光譜儀（配有鈣空心陰極燈），美國珀金埃爾默公司；Multiwave PRO微波消解儀，安東帕（上海）商貿有限公司；趕酸機，上海博通化學科技有限公司；Mili-Q超純水系統，美國Millipore公司；單道移液器和容量瓶（A級），德國Brand公司；METTER TOLEDO 204T電子天平（感量0.1 mg），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 檢測原理

牛乳試樣經微波消解儀消解后，加入氧化鑭溶液作為釋放劑，定容，直接吸入空氣-乙炔火焰中原子化，在422.7 nm處測定共振線，在一定范圍內鈣含量與吸收值成正比。

1.4.2 檢測過程

使用火焰原子吸收光譜法測定牛乳中鈣含量的步驟見圖1。

圖1 火焰原子吸收光譜法測定牛乳中鈣含量

1.4.3 試劑及標準曲線配制

氧化鑭溶液（50 g/L）配制：稱取29.32 g氧化鑭于干凈燒杯中，用少量水濕潤后加入125 mL鹽酸溶解，轉入500 mL容量瓶中，多次用一級水潤洗燒杯，逐一轉入容量瓶中，定容至500 mL，搖勻備用。

鈣溶液標準儲備液（50 μg/mL）配制：用5 mL移液器準確吸取鈣單元素溶液標準物質（1 000 μg/mL）2.5 mL于50 mL容量瓶中，用一級水定容至50 mL搖勻備用。

鈣溶液標準曲線工作液配制：用移液器準確吸取鈣溶液標準儲備液（50 μg/mL）0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于50 mL容量瓶中，加入2.0 mL氧化鑭溶液，再加入1 mL硝酸，用一級水定容至50 mL，配制濃度0 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL。

1.4.4 樣品制備

準確稱取牛乳0.25 g于微波消解內管中，加入5 mL硝酸，緩慢旋緊螺蓋，按照微波消解儀程序步驟消解（表1）。冷卻后取出消解內管，置于趕酸機中140 ℃趕酸至約剩1 mL，待消解液冷卻后轉移至100 mL容量瓶（A級）中，用一級水沖洗內蓋，一并轉移至該容量瓶中，再加入4 mL氧化鑭（50 g/L）溶液，最后用一級水定容至100 mL刻度，混勻備用，同時做空白試驗。

表1 微波消解儀程序步驟

1.4.5 檢測儀器工作條件參數設定

原子吸收光譜儀工作條件參數見表2。

表2 原子吸收光譜儀工作條件參數

1.4.6 檢測結果計算

根據GB 5009.92—2016《食品安全國家標準 食品中鈣的測定》，該方法的計算數學模型：

式（1）中：

X—試樣中鈣的含量，單位mg/100 g；

p—試樣待測液中鈣的質量濃度，單位mg/L；

p0—空白溶液中鈣的質量濃度，單位mg/L；

f —試樣消化液的稀釋倍數為1：

100、1 000—稀釋倍數；

V—試樣消化液的定容體積，單位mL；

m —試樣重量，單位g。

2 結果與分析

2.1 鈣含量測定不確定度分量的來源與分類

根據數學模型，引入不確定度的主要來源如下（表3和圖2）:

表3 鈣含量測定不確定度分量的來源與分類

圖2 測定不確定度因果關系

（1）樣品稱量（m）產生的不確定度；

（2）試樣消化液定容體積（V）產生的不確定度；

（3）鈣標準曲線溶液質量濃度；

（4）重復測定試樣的不確定度。

2.2 鈣含量測定不確定度分量的量化

2.2.1 試樣稱樣量（m）不確定度

使用萬分之一天平（最大稱樣量220 g、感量0.1 mg）準確稱量牛乳樣品0.250 g，檢定證書標明測量結果的擴展不確定度U=0.5 mg，k=2，樣品稱樣量的標準不確定度u（m）：

2.2.2 消化液定容體積（V）的不確定度

該消化液定容體積主要受兩個因素影響：校準和溫度影響。

（1）微波消解后，消化液轉移到100 mL容量瓶（A級），定容至刻度，依據JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》，100 mL容量瓶（A級）的檢定證書上標明，測量結果擴展不確定度U為0.050 mL，k=2。因此該容量瓶引入的標準不確定度：

（2）使用時和校準時，溫度不同對溶液和容量瓶體積影響引入的不確定度按矩形分布計算。水膨脹系數2.1×10-4/℃，玻璃容器膨脹系數9.75×10-6/℃，從證書看到，該玻璃容器校準時溫度20 ℃，而本實驗室溫度變動為±4 ℃，容器瓶容積膨脹遠小于液體體積膨脹，容量瓶膨脹可忽略不計。產生的體積變化為±（50×4×2.1×10-4）=±0.042 mL，采用矩形分布將溫度變化分量轉化為標準不確定度：

由上述兩個分量合成可得試樣消化液定容的標準不確定度：

試樣消化液定容體積（V）的相對標準不確定度：

2.2.3 標準曲線溶液的不確定度

（1）鈣標準物質溶液引入的不確定度

本試驗所用鈣單元素溶液標準物質（1 000 μg/mL），由中國計量科學研究院提供，GBW（E）080118國家標準物質證書（批次號：23012）注明其相對擴展不確定度U為5 μg/mL（k=2），鈣標準物質溶液濃度引入的相對標準不確定度：

（2） 鈣溶液標準儲備液及工作曲線溶液稀釋配制過程中移液器引入的不確定度

A：5 mL單道移液器的檢定證書標明，該移液器容量相對誤差測量結果擴展不確定度為0.1%，U為5 μL（k=2），因此，5 mL可調移液器標準不確定度分量（表4）：

表4 5 mL 移液器引入的相對標準不確定度分量

5 mL可調移液器相對標準不確定度：

B：1 mL單道移液器的檢定證書標明，該移液器容量相對誤差測量結果擴展不確定度為0.15%，U為1.5 μL（k=2），因此，1 mL可調移液器標準不確定度分量（表4）：

1 mL可調移液器相對標準不確定度：

C：配制鈣標準儲備液需要移取2.5 mL鈣單元素標準物質溶液；配制鈣標準工作溶液分別移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL鈣標準儲備液。根據公式（13），可得單道可調移液器分別移取1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL液體體積的相對標準不確定度（表4）。

（3）鈣標準儲備液和鈣標準工作曲線定容引入的不確定度

A：由于鈣標準儲備液、鈣標準工作溶液的配制都用同批次的50 mL容量瓶（A級），其檢定證書標明，測量結果擴展不確定度U為0.030 mL，k=2。該容量瓶引入的標準不確定度：

B：使用時和校準時溫度不同對溶液和容量瓶體積影響引入的不確定度，按矩形分布計算，水產生的體積變化為±0.042 mL，采用矩形分布將溫度變化分量轉化為標準不確定度：

上述兩個分量合成可得50 mL容量瓶定容后的標準不確定度：

50 mL容量瓶定容后的相對標準不確定度：

（4）鈣標準儲備液配制引入的不確定度

使用5 mL的單道移液器準確移取2.5 mL鈣單元素溶液標準物質（1 000 μg/mL）于50 mL容量瓶（A級）中，用一級水定容至刻度。配制濃度50 μg/mL的鈣標準儲備液。則鈣標準儲備液的相對標準不確定度：

（5）鈣標準工作曲線溶液配制引入的不確定度

分別使用1 m L 和5 m L 單道移液器準確移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL濃度50 μg/mL的鈣標準儲備液于5 個50 mL容量瓶（A級），加入2 mL氧化鑭（50 g/L）溶液，用一級水定容至刻度。配制濃度1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL和5.0 μg/mL的鈣標準工作曲線溶液。由于配制鈣標準工作曲線溶液使用5 次鈣標準儲備液，鈣標準工作曲線溶液配制引入的相對標準不確定度：

2.2.4 標準工作曲線擬合引入的不確定度

標準工作曲線共6 個濃度點，每個濃度點分別用原子吸收光譜儀檢測1 次，得到相應吸光度A，以濃度為橫坐標x，縱坐標y為對應吸光度，擬合后得曲線方程y=0.037 8x+0.001，相關系數r2=0.999 8，將標準工資曲線各濃度值c帶入方程后結果見表5

根據公式再把表5里各個點的數值代入以下公式：

式中： u——擬合曲線的不確定度；

p——試樣的測量次數，p=1；

n——標準工作曲線濃度的個數，n=6；

x——標準工作曲線實際檢測出的平均濃度，c0=2.500 2 μg/mL；

xi——標準工作曲線各個濃度點實際檢測出的濃度，μg/mL；

a——曲線的斜率，=0.037 8；

SR——回歸曲線的剩余標準差（殘差的標準差）；

y——標準工作曲線各個濃度實際檢測出的吸光度；

yi——根據擬合曲線公式算出標準工作曲線各個濃度的吸光度。

標準工作曲線擬合帶來的相對標準不確定度：

鈣標準工作曲線溶液質量濃度的相對標準不確定度：

2.2.5 試樣的重復性測定（Rep）引入的不確定度

在同樣條件下重復檢測牛乳試樣10 次，檢測結果見表6。

表6 牛乳試樣中鈣含量重復性試驗檢測數據

重復性試驗(Rep)引入的標準不確定度：

即重復性試驗（Rep）引入的相對標準不確定度：

式中，n為牛乳試樣測定的重復次數，為測定牛乳試樣中鈣含量的平均值。

2.3 鈣含量測定合成相對標準不確定的分量

各不確定度分量值見表7。

表7 牛乳中鈣含量的不確定度來源匯總

試樣中鈣含量的相對標準不確定度：

試樣中鈣含量的合成標準不確定度uc（試樣）

2.4 鈣含量的擴展不確定度

取置信概率P為95%時，k=2，則該牛乳中鈣含量的擴展不確定度：

3 結果報告

取95%置信概率P，k=2，該牛乳樣品中鈣含量的測定結果可表示X= +U=（123.8±3.22）mg/100 g。

4 結論

從不確定度的評定過程可看出，鈣標準工作曲線溶液質量濃度引入的相對標準不確定度較大，其次是重復性測定引入的不確定度，試樣稱量與溶液定容體積引入的不確定度較小。鈣標準工作曲線溶液質量濃度引入的相對標準不確定度較大的主要因素：鈣標準儲備液的配制、標準工作曲線溶液的配制和其擬合引入的不確定度。因此，配制儲備液時盡量減少稀釋次數，配制鈣標準工作曲線溶液的濃度點不宜過多，對檢測儀器和移液器定期校準、維護保養，保持性能良好。