Box-Behnken響應面法結合熵權法優化三黃洗劑提取工藝

劉龍云,王曉權,2,孫 松,白中穩,戴若萌,何曉麗

(1.合肥職業技術學院生物工程學院,安徽 合肥 238000;2.合肥師范學院化學與化學工程學院,安徽 合肥 230000;3.合肥遠志醫藥科技開發有限公司,安徽 合肥 230000)

三黃洗劑收載于《中醫外科學》,處方由大黃、黃柏、黃芩、苦參四味中藥組成,具有清熱止癢、保護收斂的作用,治療各種急性無滲出性皮炎、單純性皮膚瘙癢。其臨床主要用于治療小兒皮膚念珠菌病、皮膚濕疹樣病變、帶狀皰疹、急性生陰部濕疹、尋常型膿皰瘡、尖銳濕疣、皮炎、濕疹、癤病、蚊蚤叮咬,伴有紅腫焮癢,或有少量滲液等[1-4],臨床療效確切,應用于臨床多年,是多家醫院的院內制劑。通過文獻調研,我們發現關于三黃洗劑的制法較為傳統,現代提取工藝研究較少,阻礙其進一步開發利用。

Box-Behnken設計-響應面法(Box-Behnken design-response surface methodology,BBD-RSM)是近年來廣泛應用的多實驗條件優化的方法[5-9],通過建立多元回歸方程擬合因素和效應值之間的函數關系。相較于單因素實驗與正交實驗,響應面法優點在于利用最少的實驗組數對實驗條件進行優化,有效地提升了提取效率。

本研究在單因素實驗確定三黃洗劑提取條件的基礎上,以小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的質量濃度為考察指標,用熵權法結合BBD-RSM法對三黃洗劑的提取工藝進行優化,以期實現三黃洗劑中有效成分的高效提取,為其進一步開發利用提供參考。

1 實驗部分

1.1 試藥與儀器

大黃、黃柏、黃芩、苦參(購于安徽省中醫院);大黃素(批號110756-201913)、鹽酸小檗堿(批號110713-202015)、黃芩苷(批號110715-202223)、漢黃芩苷(批號112002-201702)、苦參堿(含量測定用,批號110805-202010),對照品來自于中國食品藥品檢定研究院;甲醇色譜純(美國阿斯頓化學技術有限公司),磷酸(成都市科隆化學品有限公司),乙醇(國藥集團化學試劑有限公司),純化水(娃哈哈集團(杭州)有限公司)。

Waters2695-2996高效液相色譜儀(Waters有限公司);ChromCore C18(250 mm×4 mm,5 μm)色譜柱(北京英萊克科技發展有限公司);HH-2數顯恒溫水浴鍋(金壇市富華電器有限公司);梅特勒-托利多分析天平MF-MS105梅特勒-托利多集團);GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司);RS-FS1401粉碎機(合肥榮事達小家電有限公司);WE-H3-18K臺式高速離心機(蘇州威爾實驗用品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

將大黃、黃柏、黃芩、苦參分別粉碎,過3號篩,浸出物測定時過2號篩,備用。

1.2.2 對照品溶液的制備

1.2.2.1 小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素

精密稱取小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的對照品適量,加入甲醇后進行超聲處理,直至完全溶解,制成質量濃度分別為0.816、0.544、0.808、0.086 mg/mL的混合對照品溶液,0.48 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得[10]。

1.2.2.2 苦參堿

精密稱取苦參堿對照品適量,加甲醇超聲處理至完全溶解,制成質量濃度為1.046 0 mg/mL的苦參對照品溶液,使用0.48 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得苦參堿對照品溶液[11-12]。

1.2.2.3 供試品溶液

取制備的樣品粉末各2 g于錐形瓶中,加乙醇溶液100 mL,搖晃使藥粉全部潤濕,恒溫水浴鍋中加熱提取,提取液以4 000 r/min的轉速離心3 min后,取上層清液,用0.48 μm的微孔濾膜濾過,取續濾液,即為苦參供試品溶液。

1.2.2.4 陰性對照溶液制備

按照比例分別稱取三黃洗劑處方的大黃、黃柏、黃芩、苦參這四味藥材各3份,制成不含大黃、不含黃芩、不含黃柏、不含苦參的陰性樣品,并按“1.2.2.3”步驟操作,制得陰性樣品溶液。

1.3 小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素含量測定

1.3.1 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B);洗脫梯度:(0～20 min,10%A→37%A;20～30 min,37%A;30～31 min,37%A→38%A;31～36 min,38%A;36～50 min,38%A→65%A;50～80 min,65%A→100%A),體積流量1.0 mL/min;檢測波長265 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 μL[13-17]。

1.3.2 專屬性考察

按照“1.3.1”色譜條件,精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL注入高效液相色譜儀,分析溶劑、混合標準品、供試品溶液和陰性對照品溶液在波長264 nm條件下的HPLC色譜圖。

1.3.3 線性考察

精密吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL,按“1.3.1”中色譜條件進樣測定。以質量濃度對色譜峰的峰面積進行線性回歸,繪制小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素的標準曲線。

1.3.4 精密度考察

取“1.2.2.1”中同一混合對照品溶液,重復進樣5次,計算RSD。

1.3.5 穩定性考察

按照“1.2.2.3”方法制備供試品溶液,于0、2、4、8、12 h進樣,計算RSD。

1.3.6 加樣回收率考察

精密量取已知質量濃度的6份樣品溶液各2 mL,置10 mL容量瓶中,加入適量混合對照品溶液,混合均勻,按“1.2.2.3”方法制備供試品溶液,按“1.3.1”中色譜條件進樣檢測,以峰面積為統計指標,分別計算各成分的平均回收率和RSD。

1.4 苦參堿含量測定

1.4.1 色譜條件

ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈-[0.01 mol/L乙酸銨溶液(濃氨試液調pH為 8.1)](V∶V=3∶2)為流動相A,0.01 mol/L乙酸銨溶液(濃氨試液調pH為8.1)為流動相B,洗脫梯度(0～20 min,10%A→30%A;20～40 min,30%A→40%A;40～50 min,40%A→60%A),體積流量1.0 mL/min,檢測波長225 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 μL[18]。

1.4.2 專屬性考察

按照“1.4.1”中色譜條件,精密吸取溶劑、對照品溶液、供試品溶液各10 μL 注入液相色譜儀,觀察供試品溶液中待測成分與對照品在相同的保留時間是否有對應的色譜峰。

1.4.3 線性關系

按照“1.2.2.2”方法,精密稱取苦參堿標準品適量,用甲醇稀釋,以峰面積Y對苦參堿質量濃度作回歸方程。

1.4.4 精密度考察

取“1.2.2.2”步驟的對照品溶液,重復進樣5次,計算峰面積的RSD。

1.4.5 穩定性考察

按照“1.2.2.3”方法制備供試品溶液,于0、2、4、8、12 h進樣,計算峰面積的RSD。

1.4.6 加樣回收率考察

精密量取已知含量的6份樣品溶液各2 mL,置于10 mL容量瓶中,加入適量的混合對照品溶液,混合均勻,按“1.2.2.3”中方法制備供試品溶液,按“1.4.1”中色譜條件進樣,計算平均回收率和RSD。

1.5 提取工藝研究

1.5.1 綜合評分計算

熵權法[19-21]是根據多項指標所提供的信息確定各指標的權重。信息熵Ej表示體系的混亂程度。熵值越小,其權重越高,在綜合評價中所起作用也越大,具體計算方法如下:

①用公式(1)對數據歸一化處理。

(1)

②利用公式(2)、(3)、(4)計算出各指標的信息熵Ej。

(2)

k=1/lnm,

(3)

(4)

其中,Pij為第j個指標下第i組的概率,0≤Pij≤1,k為樣本數對數的倒數,m為實驗的樣本數。

③用公式(5)計算出權重系數Wj。

(5)

1.5.2 單因素實驗

1.5.2.1 提取溫度

按處方配比取所需藥材適量,以提取時間90 min、乙醇濃度50%為固定量,考察不同提取溫度下,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的質量濃度變化,結合綜合評分法優選最佳提取溫度。

1.5.2.2 乙醇濃度

按處方配比取所需藥材適量,以提取時間90 min、提取溫度55 ℃為固定量,考察不同乙醇濃度下,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的質量濃度變化,綜合評分法優選最佳乙醇濃度。

1.5.2.3 提取時間

按處方配比取所需藥材適量,以提取溫度55 ℃、乙醇濃度50%為固定量,考察不同提取時間下,小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的質量濃度變化,在90 min之后,選擇最佳提取時間。

1.6 Box-Behnken響應面法

本研究在前期預實驗中,發現提取溫度(X1)、乙醇濃度(X2)、提取時間(X3)對三黃洗劑提取工藝綜合評分影響顯著,故本實驗以X1、X2、X3為考察因素,采用 Design Expert 8.0.6 軟件設計3因素3 水平Box-Behnken響應面法實驗方案。以小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的質量濃度的綜合評分Z1、Z2、Z3、Z4、Z5為因變量,采用熵權法綜合評分法優選三黃洗劑提取工藝,計算綜合評分(Z)。

1.7 驗證實驗

按照最佳工藝條件進行3次驗證實驗,并進行含量測定。

2 結果與分析

2.1 小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素含量測定

2.1.1 專屬性考察結果

混合標準品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液的HPLC色譜圖見圖1。由圖1可知,供試品溶液中待測成分與對照品在相同的保留時間有對應的色譜峰。

(a)混合標準品 (b)供試品

(c)大黃陰性 (d)黃芩陰性

(e)苦參陰性 (f)黃柏陰性峰1-小檗堿;峰2-黃芩苷;峰3-漢黃芩苷;峰4-大黃素。圖1 混合標準品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液的HPLC色譜圖

2.1.2 線性考察結果

分別繪制各對照品的標準曲線。各對照品的回歸方程、相關系數r、線性范圍見表1,結果表明各成分在相應質量濃度范圍內線性關系良好。

表1 小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素的線性關系

2.1.3 精密度考察結果

小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素對應峰面積的RSD分別為1.05%、1.12%、1.33%、1.26%,結果表明儀器精密度良好。

2.1.4 加樣回收考察結果

小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素加樣回收率結果見表2,符合方法學要求。

表2 小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素加樣回收率結果(n=6)

2.2 苦參堿含量測定

2.2.1 專屬性考察結果

供試品溶液中待測成分與對照品在相同的保留時間有對應的色譜峰。

2.2.2 線性關系結果

繪制對照品標準曲線,峰面積Y對鹽酸小檗堿質量濃度回歸方程:Y5=3 474 968.657 53X-155 42,r=0.999 6,在209.2～1 046.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 精密度考察結果

重復進樣5次,峰面積的RSD為2.07%。結果表明儀器精密度良好。

2.2.4 加樣回收率考察結果

苦參加樣回收率結果見表3,符合方法學考察。

表3 苦參加樣回收率結果(n=6)

2.3 綜合評分計算結果

應用熵權法計算得到小檗堿、黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素、苦參堿的權重值分別為 0.226、0.233、0.175、0.258、0.107。綜合評分Y=0.226Z1+0.233Z2+0.175Z3+0.258Z4+0.107Z5,其中,Z1為小檗堿的質量濃度,Z2為黃芩苷質量濃度,Z3為漢黃芩苷質量濃度,Z4為大黃素質量濃度,Z5為苦參堿質量濃度。計算不同實驗組別各指標成分綜合評分。

2.4 單因素實驗結果

提取時間、提取溫度、乙醇濃度對綜合評分的影響結果如圖2(a)～(c)所示。

(a)提取時間 (b)提取溫度 (c)乙醇濃度圖2 提取時間、提取溫度、乙醇濃度對綜合評分的影響

2.5 Box-Behnken響應面法實驗結果

工藝優化實驗因素水平、實驗方案與結果見表4。

表4 Box-Behnken實驗設計與響應值

采用 Design Expert 8.0.6軟件將各組綜合評分數據進行多元回歸和二項式分析,對3個因素的二次回歸模型方程建立綜合評分:

F=5.75+0.153 7X1+0.068 8X2+0.112 5X3+0.047 5X1X2+

對回歸模型進行方差分析,結果見表5。

表5 Box-Behnken設計方差分析結果

圖3 提取溫度、提取時間、乙醇濃度與提取功率交互作用對綜合評分影響的等高線圖和響應面圖

2.6 驗證實驗結果

根據模型擬合結果,提取溫度為56.4 ℃,提取時間為93.9 min,乙醇濃度為71.5%,按照最佳工藝條件進行3次驗證實驗,并進行含量測定。如表6所示,驗證實驗綜合評分均值為5.84,與理論最佳工藝樣品的綜合評分5.80基本吻合,說明優化得到的提取工藝條件較為穩定可行。

表6 驗證實驗結果

3 討論

中藥復方組分較多,不同的加工工藝對復方質量有很大的影響[21]。液體制劑具有體積大、運輸攜帶不方便的特點,可通過優化中藥復方的提取工藝,將提取液濃縮為濃縮液、浸膏或粉末,進而制成其他制劑,方便使用。中藥復方工藝優化的評價方法是學者們一直在探索的問題,王銳等[22]以桑皮苷A、指紋圖譜相似度、出膏率以及地骨皮乙素為評價指標,通過模糊層次分析法(fuzzy analytical hierarchy process,FAHP)-熵權法結合基準關聯度確定各指標權重系數,計算綜合評分,優化經典名方瀉白散的提取工藝;李婉玉等[23]以總多糖、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮的含量,及浸膏得率為評價指標,采用AHP結合熵權法確定權重系數,以多指標綜合加權評分法優化復方紅黃咀嚼片提取工藝;張星等[24]利用多元統計分析對指紋圖譜 共有峰數據進行主成分分析(principal component analysis,PCA)與正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)并計算得分,優化經典名方四妙勇安湯煎煮工藝。

本實驗建立RP-HPLC檢測方法,以三黃洗劑中五種代表性成分為評價指標,先進行單因素實驗確定因素的考察范圍,再通過Box-Behnken響應面法考察因素之間的交叉影響,結合熵權法進行綜合評分,優化三黃洗劑提取的工藝參數。實驗結果表明,提取溫度56.4 ℃,提取時間93.9 min,乙醇濃度71.5%,綜合評分為5.84,與模型理論預測值基本一致,表示該模型準確度可信,質量穩定,能夠較合理地應用于三黃洗劑提取的工藝優化,為中藥復方的制劑研究提供參考。