基因編輯工具CRISPR-Cas9與CRISPR-Cas12a的比較與應用

王煬坤,紀世新,蘇瑩瑩,孫英旗,宋相偉

(長春師范大學生命科學學院,吉林 長春 130032)

CRISPR-Cas系統是一種原核生物適應性免疫機制,用于清除外源的核酸,從而在原核生物中獲得抵抗病毒的能力[1]。CRISPR-Cas系統由兩部分組成:在大腸桿菌中發現的簇狀規則間隔的短回文重復序列[2](Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相關蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)。該系統可以分為兩大類,分別為Class1和Class2[3]。Class1需要多個效應蛋白組合作用才能完成靶向剪切功能;Class2包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型,只需要單個效應蛋白就可以完成靶向剪切作用。Class2因具有簡單性而被廣泛使用[4]。它們均通過向導RNA(guide RNA,gRNA)識別靶標的原間隔子相鄰基序(protospacer adjacent motif,PAM),進而對靶標起作用。本文對Class2中應用最廣泛的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a的作用機制及其應用領域進行闡述,并對二者進行比較。

1 Cas9與Cas12a的作用機制比較

1.1 PAM識別位點不同

PAM是前間隔序列的5′或3′端延伸幾個堿基構成的十分保守的序列,長度一般為2～5 bp。PAM可以使CRISPR-Cas系統區分自身的核酸和外源的核酸[5],避免CRISPR-Cas系統出現自身免疫反應。

PAM存在于靶標DNA雙鏈中,Cas9能夠識別富G序列5′-NGG-3′,通過Cas9羧基端保守的精氨酸殘基的主溝與非互補鏈的GG二核苷酸相互作用識別[6]。有研究表明,Cas9也能夠識別沒有PAM的RNA。 STRUTT等[7]證明,在Cas9亞型中,空腸彎曲桿菌Cas9(CjCas9)可以不依賴靶標RNA分子中的PAM位點,直接利用RNA-RNA相互作用,從而識別RNA。使得CRISPR-Cas9直接靶向RNA成為可能,進一步擴大了CRISPR-Cas9系統的應用范圍,這表明Cas9可以對DNA和RNA病毒進行細胞防御。

Cas12a能夠識別富T序列5′-TTTV -3′,相對于富G的Cas9 PAM來說,擴大了基因組靶標的廣度[8]。KLEINSTIVER等[9]設計了一種增強型酸氨基球菌Cas12a變種(enAsCas12a)實驗,使標準PAM位點上的基因組編輯活性擴大了兩倍。除了典型的PAM外,Cas12a還可以對含C的PAM序列進行識別,與靶標DNA雙鏈相互作用。

1.2 gRNA的結構不同

gRNA是一種小分子非編碼RNA[10],作用于動質體(一種附有鞭毛的原生動物,包含某些能使人類或其他動物發生嚴重疾病的寄生蟲)體內的RNA編輯后轉錄修飾過程。gRNA也可與前體mRNA(pre-mRNA)結合,通過在pre-mRNA中插入一定數量的U,形成成熟的mRNA。gRNA靶向結合基因組中的特定靶標DNA序列,是CRISPR系統的一個共同特性。gRNA的表達水平與基因編輯效率密切相關。

Cas9的gRNA是由反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)與CRISPR RNA(crRNA)組成的100 nt的雜合體,又稱小向導RNA(small guide RNA,sgRNA)[11]。sgRNA可以識別基因組上的特定序列,而Cas9可以作為剪刀,對DNA序列進行剪切。為了提高基因組編輯的準確性,研究人員對Cas9核酸酶進行突變,使其只能剪切靶標DNA雙鏈中的一條鏈。通過sgRNA引導突變的Cas9對靶標DNA進行剪切,可以降低脫靶效應,提高基因組編輯的特異性。

Cas12a的gRNA僅由42 nt組成,它將自己的 pre-crRNA 加工為成熟的 crRNA,而不需要tracrRNA。它與Cas12a結合可以對靶 DNA 進行剪切[12]。另外,對crRNA進行結構優化,增加crRNA的穩定性,可以提高它與Cas12a的結合能力,從而增強Cas12a的活性。

1.3 發揮功能的階段不同

CRISPR序列由前導序列、重復序列和間隔序列組成。CRISPR-Cas系統中的Cas9和Cas12a都有獨特的適應、表達和干擾階段(圖1)。

圖1 CRISPR-Cas9/12a的模塊化結構

適應階段相當于鄰近PAM的序列的捕獲階段,細菌識別出外源DNA,利用Cas蛋白復合物與外源的靶標DNA分子結合,導致其雙鏈斷裂[13]。入侵噬菌體或質粒的短DNA片段(原間隔序列)整合在CRISPR位點前導序列的末端,產生新的間隔序列。在CRISPR-Cas9系統中,Cas9-tracrRNA復合物與Csn2和Cas1-Cas2構成的復合物一起參與間隔序列的獲取,而在CRISPR-Cas12a系統采用Cas12a、Cas1、Cas2和Cas4獲取間隔物。

表達階段是crRNA的合成和表達,CRISPR序列連同間隔序列被轉錄成pre-crRNA。pre-crRNA的加工通常會產生30～65 nt的成熟crRNA,這些成熟crRNA只包含一個間隔[14]。它們與一個或多個Cas蛋白結合形成效應復合物,對靶序列進行特異性識別,負責CRISPR-Cas免疫特異性的向導[10]。在 Cas9系統中,pre-crRNA 表達由嵌入在CRISPR序列中的富含AT的前導序列的啟動子控制。與pre-crRNA 具有互補序列的tracrRNA是加工pre-crRNA所必需的。靶標DNA被Cas9特異性識別,并被內源性RNaseⅢ進一步切割[15]。然后,由核酸酶修剪crRNA的5′端,形成成熟的crRNA。同時,可以人為地將crRNA和tracrRNA結合為 sgRNA進行基因編輯。與Cas9系統不同,Cas12a負責pre-crRNA的加工,而不需要tracrRNA與pre-crRNA的共同作用就可產生成熟的crRNA[8]。Cas12a在不需要tracrRNA的情況下,將其自身的前crRNA加工為成熟的crRNA,使其成為一種具有核糖核酸內切酶活性的獨特效應蛋白[16]。pre-crRNA轉錄完成后,Cas12a將其剪切到CRISPR序列中形成的發夾結構的上游4 nt處,產生中間crRNA分子,中間crRNA分子在體內進一步加工為成熟crRNA[17]。

在干擾階段中,crRNA和Cas蛋白整合成一個復合物,利用crRNA識別靶標DNA或RNA,從而激活復合物的切割活性,使宿主細胞免受感染[2]。Cas9和Cas12a作為核酸酶(圖2),在干擾過程中起著關鍵作用。Cas9包含RuvC和HNH兩個核酸酶結構域,這兩個結構域分別負責在crRNA-target DNA復合物中移位和靶標DNA鏈的剪切。HNH核酸酶可以剪切靶標DNA;RuvC核酸酶可以分裂成RuvC-Ⅰ、RuvC-Ⅱ和RuvC-Ⅲ亞結構域,并剪切非靶標DNA[18]。Cas12a的氨基酸序列只包含一個RuvC核酸酶結構域[19]。Cas12a、crRNA和靶標DNA構成的復合物,在結構上揭示了具有獨特折疊的核酸酶結構域,在功能上類似于Cas9的HNH結構域。

圖2 效應蛋白的結構域

1.4 剪切靶標的機制不同

CRISPR-Cas作為一種分子剪刀,可以特異性地識別外源核酸并利用Cas蛋白剪切靶標DNA序列,從而實現對自身的免疫(圖3)。

圖3 CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a的剪切方式

在CRISPR-Cas9系統中,Cas9與sgRNA相互作用。Cas9識別PAM序列后,靶標 DNA 解開雙鏈,sgRNA和DNA 互補結合。當DNA與sgRNA結合完成后,Cas9在HNH和RuvC結構域的催化位點上剪切靶標DNA,產生平末端的雙鏈斷裂[20]。

在CRISPR-Cas12a系統中,利用crRNA引導的Cas12a作用于非靶標單鏈DNA和靶標雙鏈DNA[8]。Cas12a在crRNA的引導下識別含PAM的靶標雙鏈DNA,使其解鏈。靶標雙鏈中的一條鏈與crRNA形成環狀復合體,進而釋放出Cas12a中的RuvC的活性位點,使得靶標DNA解旋后被剪切。當Cas12a完成對靶標DNA的剪切后,會激活Cas12a反式裂解單鏈DNA的無差別切割活性[21]。

2 Cas9和Cas12a在診斷領域與治療領域中的作用比較

2.1 Cas9主要應用治療領域

癌基因的調控方式與正常基因不同,可促進正常細胞的惡性轉化。CRISPR-Cas9系統為改變癌基因活性提供了有效的措施,從而抑制腫瘤生長,為有效治療腫瘤奠定了堅實的基礎。

GAO等[22]評估了CRISPR-Cas9系統對宮頸癌前病變的治療效果,發現CRISPR-Cas9在抑制宮頸癌前病變細胞系的細胞生長和集落形成以及誘導細胞凋亡方面表現出了特異性。在K14-HPV16轉基因小鼠HPV驅動的自發性宮頸癌變模型中,應用CRISPR-Cas9處理可導致E7基因突變,并恢復RB、E2F1和CDK2的表達,從而逆轉宮頸癌變表型,證明了當CRISPR-Cas9靶向HPV16 E7時,可以有效逆轉HPV相關的體外宮頸癌變以及K14-HPV16轉基因小鼠的宮頸癌變,在宮頸癌前病變的臨床治療中顯示出巨大潛力。LIU等[23]開發了一種名為CRISPReader的技術,可以有效控制靶向轉基因和翻譯。他們利用 CRISPReader技術對基因電路進行改進和優化,將基因電路微型化和簡單化,并構建了介導人膀胱癌細胞中基因表達的微型基因回路。通過調控CRISPR-Cas9介導的腫瘤抑制基因hBax、E-cadherin和p21,有效抑制了膀胱癌細胞的增殖,降低了細胞活力,誘導細胞凋亡。

心血管疾病(CVD)是全球死亡的主要原因,占2019年死亡總人數的32%。Cas9可降低低密度脂蛋白膽固醇水平,加強對心血管疾病的預防。

堿基編輯器是由CRISPR-Cas9與胞嘧啶脫氨酶結構域組成的,它能以序列特異的方式將基因組DNA 中的胞嘧啶堿基改變為胸腺嘧啶堿基,而無須雙鏈DNA斷裂。科學家們將其植入成年小鼠的肝臟,以評估它是否能在Pcsk9(9型枯草蛋白酶)基因中引入位點特異性無義突變。這導致了成年小鼠血漿PCSK9蛋白水平大幅降低,血漿膽固醇水平也有一定程度的降低[24]。研究人員通過CRISPR-Cas9介導的基因整合技術,將LEF1基因導入到19號染色體上。結果證明LEF1/hUCB間充質干細胞在氧化應激條件下的增殖和存活率提高。這項研究表明,干細胞療法與促進細胞存活的轉錄因子LEF1基因組編輯相結合,可成為心血管疾病的有效治療策略[25]。

2.2 Cas12a主要應用診斷領域

CRISPR-Cas12a與其他技術相結合,可以實現快速即時檢測,在病毒檢測方面具有極大的前景。

CHEN等[26]的團隊研發了一個基于CRISPR的DNA診斷平臺,命名為“DETECTR”。它結合等溫擴增技術(LAMP/RPA),可以快速、準確地檢測出臨床相關的HPV。LIU等[27]利用Cas12a反式裂解單鏈DNA活性的能力,結合亞甲基藍標記的單鏈DNA,同時利用帶負電荷的氧化銦錫電極,制作了一個簡單、無固定化、靈敏度高、均勻的電化學生物傳感器,用于檢測HPV。MAYURAMART等[28]結合RT-RPA和CRISPR-Cas12a技術檢測流感病毒和SARS-CoV-2,靈敏度高、特異性強,是檢測流感病毒和SARS-CoV-2的有效方法,并可用于其他傳染病的檢測。

食品安全直接關系到廣大人民群眾的身體健康和生命安全[29]。基于CRISPR-Cas12a系統的熒光傳感技術從疾病診斷擴展到食品安全監測領域,為食品安全檢測提供了一種新策略。

副溶血性弧菌廣泛存在于海產品中,該菌可引致腸袢腫脹、充血和腸液潴留,引起腹瀉。ZHANG等[30]將副溶血弧菌特殊熱嗜性溶血素基因的一段序列作為靶標,設計出相應的crRNA,將CRISPR-Cas12a系統預裝在試管蓋內,然后對提取的蝦樣品進行PCR擴增。離心混合試劑后在37 ℃反應5～10 min,可在紫外光下肉眼讀取結果,該方法推進了其在食品安全保障領域的應用。BONINI等[31]建立了一種基于CRISPR-Cas12a的無標記阻抗生物傳感方法,用于檢測大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。電化學阻抗光譜法可以靈敏而強大地檢測電極表面微小的物理和化學變化。修飾電極上的ssDNA會阻礙電極與溶液之間的電子交換。當 CRISPR-Cas12a識別到目標細菌的特定序列時,就會開啟ssDNA的裂解模式,導致電荷轉移電阻下降。該方法不僅可以縮短檢測時間,還在食品安全、公共衛生安全中具有較高的應用價值。

3 展望

基因組信息在醫療、傳染病預防和其他許多醫療實踐中變得越來越重要。根據已經報道的方法,CRISPR技術不僅在哺乳動物細胞的基因組編輯和基因調控中被廣泛應用,而且在遺傳性疾病治療方面顯示出驚人的發展潛力。對CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a進行區分,有助于其相關技術更好地應用。目前,CRISPR介導的基因組工程的核心是Cas9,但其可能出現的脫靶效應制約了它的發展。因與Cas9具有巨大差異,Cas12a已成為一種可供選擇的分子基因組編輯工具。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a技術的應用已趨于成熟,但其臨床應用仍需進一步完善。如今,Cas12f、Cas13a也逐漸進入人類的視野。盡管CRISPR診斷工具已經顯示出明顯的進步跡象,但由于新興技術轉化為實踐的復雜性,CRISPR的臨床用途、商業試劑盒和設備較少。伴隨著新開發的應用的出現和更多Cas同源物的發現,CRISPR技術已經被用來促進人類健康服務診斷,在醫療方面做出了巨大貢獻。