不同萃取法測定雞蛋中甲氧芐啶殘留量的方法比對

鄭陸紅

摘 要：本研究在樣品經乙腈提取后分別采用陽離子交換固相萃取柱萃取、乙腈飽和正己烷液液萃取和QuEChERS萃取3種不同的萃取凈化方法對雞蛋進行前處理，采用超高效液相色譜-串聯質譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）對雞蛋中甲氧芐啶殘留量進行測定。研究表明3種不同萃取凈化方法在0.5～50.0 μg·L-1甲氧芐啶均具有良好的線性關系，相關系數（R2）大于0.999，檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1，方法回收率均在60.3%～99.7%，相對標準偏差小于15%。3種前處理方法均適用于雞蛋中甲氧芐啶的測定。

關鍵詞：甲氧芐啶；雞蛋；固相萃取法；液液萃取法；QuEChERS萃取法；超高效液相色譜-串聯質譜

Comparativer Study of the Effects of Different Extraction Methods on the Detection of Trimethoprim Residue in Egg

ZHENG Luhong1，2，3

（1.Guangdong Food Industry Institute Co.， Ltd.， Guangzhou 511442， China;

2.Guangdong Provincial Public Laboratory of Food Industry， Guangzhou 511442， China;

3.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station， Guangzhou 511442， China）

Abstract： This study investigated the pre-treatment of eggs using three different extraction and purification methods， namely cation exchange solid-phase extraction， acetonitrile saturated n-hexane liquid-liquid extraction， and QuEChERS extraction， after being extracted with acetonitrile. The residues of trimethoprim in eggs were determined by ultra-high performance liquid chromatogeny-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The result? showned that three different extraction and purification methods exhibit a good linear relationship for trimethoprim in the concentration range of 0.5 ～ 50.0 μg·L-1， the correlation coefficients （R2） were greater than 0.999， the

detection limit was 0.5 μg·kg-1， the quantification limit of 1.0 μg·kg-1， and the recovery rates of the methods ranged from 60.3% to 99.7% with the RSD less than 15%. These three methods are all suitable for the determination of trimethoprim in eggs．

Keywords： trimethoprim; eggs; solid phase extraction; liquid-liquid extraction; QuEChERS extraction; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

甲氧芐啶（Trimethoprim）是一種抗菌增效劑，常將其與磺胺類藥物一起使用，使其抗菌譜擴大、抗菌活性增強，達到抗菌增效的效果[1-3]。甲氧芐啶可用于治療細菌感染性疾病，在獸醫臨床上應用十分廣泛[4]。如果養殖戶違規加大甲氧芐啶用量，且不遵守停藥時間，則容易導致上市畜禽產品中存在藥物殘留。動物產品的甲氧芐啶殘留一般不會對人體產生急性毒性作用，但長期大量攝入甲氧芐啶殘留的食品，可能在人體內蓄積，導致胃腸道損害、皮膚過敏癥狀等。目前，我國已批準甲氧芐啶作為增效劑與磺胺類藥物聯合使用。我國農業農村部2022年頒布的《食品安全國家標準 食品中41種獸藥最大殘留限量》（GB 31650.1—2022）規定甲氧芐啶在家禽蛋中的最大殘留限量值為10 μg·kg-1[5]。

目前，針對雞蛋中甲氧芐啶殘留量分析的檢測方法報道較少。我國已有相關標準來檢測動物源性食品中甲氧芐啶的含量，如《進出口動物源性食品中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶殘留的檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》（SN/T 2538—2010）[6]適用于肌肉、內臟、牛脂肪、雞蛋、魚肉及蜂產品中甲氧芐啶殘留量的測定，但該標準未寫明雞蛋應按哪種前處理方式進行實驗；《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》（GB/T 21316—2007）[7]用于測定動物源食品（肝臟、腎臟、肌肉、水產品和牛奶）中甲氧芐啶的殘留量，針對雞蛋中甲氧芐啶殘留量的檢測方法相對較少。因此，本文對比不同的萃取方法包括固相萃取法、液液萃取法和QuEChERS法的檢出限、回收率、精密度以及基質效應，建立了液相色譜-串聯質譜法檢測雞蛋中甲氧芐啶殘留的方法，為監測雞蛋中的甲氧芐啶殘留提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲氧芐啶（738-70-5），BePure公司；氨水、乙腈、甲醇、正己烷、甲酸，上海安譜科技股份有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉，廣州化學試劑廠；固相萃取小柱PCX（60 mg，3 mL），天津博納艾杰爾科技有限公司；ProElut QuEChERS（15 mL）凈化管，迪馬公司。

超高效液相色譜-串聯質譜儀，Waters公司；天平，梅特勒-托利多有限公司；離心機，天美中國科學儀器有限公司；渦旋振蕩器，廣州綠百草生物科技有限公司；氮吹儀，睿科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試料的制備

取500 g雞蛋，攪拌均勻后裝入潔凈容器內，密封并做好標識。

1.2.2 固相萃取法

稱取2.0 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，超聲20 min，10 000 r·min-1離心5 min，轉移上清液待凈化。PCX固相萃取小柱用3 mL水和3 mL甲醇活化后，取備用液過小柱。依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，用3 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，35 ℃水浴中濃縮至近干。用1 mL 50%乙腈水溶液溶解殘渣，混勻過0.22 μm有機濾膜過濾后供UPLC-MS/MS測定。

1.2.3 液液萃取法

稱取2.0 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，超聲20 min，10 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉移至另一離心管中，加入

20 mL乙腈飽和正己烷渦旋振搖5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取乙腈層于35 ℃水浴中濃縮至近干。用1 mL 50%乙腈水溶液溶解殘渣，混勻過0.22 μm有機濾膜過濾后供UPLC-MS/MS測定。

1.2.4 QuEChERS萃取法

稱取2.0 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，超聲20 min，加入3 g氯化鈉和3 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩2 min，10 000 r·min-1離心5 min。轉移上清液于QuEChERS凈化管中，渦旋混合1 min，10 000 r·min-1離心3 min，準確吸取

5 mL已凈化的提取液于35 ℃水浴中濃縮至近干。用1 mL 50%乙腈水溶液溶解殘渣，混勻過0.22 μm有機濾膜過濾后供UPLC-MS/MS測定。

1.2.5 色譜條件

色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0.00～0.50 min，95%A；0.51～3.00 min，95%A→5%A；3.01～4.00 min，5%A；4.01～

6.00 min，95%A。

1.2.6 質譜條件

通過電噴霧離子源正離子模式下進行多反應監測，電離電壓1.2 kV，源溫度150 ℃，霧化氣溫度400 ℃，錐孔氣流速50 L·h-1，霧化氣流速

1 000 L·h-1。

1.2.7 標準曲線的配制與基質效應

按1.2.2、1.2.3、1.2.4 3種前處理方法，分別用空白基質溶液與50%乙腈水溶液配制成0.500 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1、2.000 μg·mL-1、

5.000 μg·mL-1、10.000 μg·mL-1、20.000 μg·mL-1和50.000 μg·mL-1的基質匹配標準工作溶液和溶劑標準工作溶液。在相同條件下進行測定，分別建立基質標準工作曲線和溶劑標準工作曲線，通過計算基質效應（Matrix Effect，ME）值，判斷基質效應。公式為ME=（基質匹配標準工作曲線的斜率/無基質標準工作曲線的斜率-1）×100%。|ME|值大于50%，為強基質效應；|ME|值在20%～50%，為中等基質效應；|ME|值小于20%，為弱基質效應[8]。

1.3 結果處理

實驗結果采用MassLynx V4.2軟件進行繪圖和數據處理。

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件的選擇

甲氧芐啶呈弱堿性，正離子掃描模式下，在流動相中加入甲酸可提高待測目標化合物的電離效率和改善峰形。因此本試驗考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、水-甲醇和水-乙腈對甲氧芐啶的分離效果、靈敏度及峰形的影響。結果表明，水相中加入0.1%甲酸可較好地提高檢測響應，峰形尖銳對稱，保留時間穩定，重復性好。甲醇極性較乙腈強，在反相液相色譜中甲醇保留強于乙腈，且響應比乙腈高。因此本文選用含0.1%甲酸水溶液-甲醇溶液作為流動相。甲氧芐啶的總離子流圖如圖1。

圖1 甲氧芐啶標準溶液的總離子流圖

2.2 質譜條件的選擇

基于目標物的分子結構和物理化學性質，選擇ESI+離子化模式，通過流動注射進樣對母離子和子離子進行掃描，優化目標物的錐孔電壓與碰撞能量參數，獲得母離子、定量離子和定性離子最優質譜參數見表1。

2.3 萃取凈化方法的選擇

雞蛋中含有大量的蛋白質和脂肪，特別是磷脂，存在雜質多、基質干擾嚴重等問題，去除干擾因素是獸藥殘留檢測分析的難題。本實驗對比了陽離子交換固相萃取柱萃取、乙腈飽和正己烷液液萃取和QuEChERS萃取3種不同萃取凈化方法。QuEChERS萃取凈化的色譜圖有較多雜峰，容易產生干擾，基質效應較大，回收率偏低。液液萃取法能得到較為滿意的除雜效果和回收率，但需要使用大量溶劑，并需要濃縮，費時。固相萃取法能有效地將干擾組分與目標物分離，減小雜質干擾，回收率高，重現性好，且不需要使用大量有機溶劑，對環境的污染小。3種不同萃取凈化方法的圖譜見圖2。相比較，固相萃取法更有優勢。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍、檢出限與定量限

配制系列甲氧芐啶標準溶液，在設定好的儀器條件下進行測定。通過測定甲氧芐啶的峰面積（Y）與其濃度（X）進行回歸分析，甲氧芐啶在0.5～

50.0 μg·L-1線性良好，回歸方程為Y=1 014.9X+

87.444，相關系數R2=0.999 8，可用于準確定量。以信噪比為3作為檢出限，以信噪比為10作為定量限。結果表明，3種檢測方法的檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

2.4.2 基質效應

基質效應是指基質中除待測物之外的其他成分對待測物分析的影響。在離子化過程中，基質中的成分與目標組分存在競爭，改變了目標物的電離效率，表現為離子增強或抑制作用，影響檢測結果的準確性[9]。按1.2.7操作所得基質標曲與溶劑標曲的線性方程、相關系數以及基質效應見表2。結果表明，液液萃取法和固相萃取凈化法基質效應較弱，而QuEChERS萃取凈化法為中等基質效應，需要通過配制基質標準工作曲線進行定量，降低基質效應的影響。

2.4.3 加標回收率與精密度

向陰性雞蛋樣品中分別添加濃度為1.00 μg·kg-1、5.00 μg·kg-1、20.00 μg·kg-1的甲氧芐啶，進行3水平的回收率試驗，每個添加水平重復測定6次。

3種前處理方法3個添加水平下雞蛋樣品中甲氧芐啶的回收率和精密度如表3所示。3種前處理方法回收率均符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》

（GB/T 27404—2008）[10]中回收率與精密度的判定：被測組分含量＜0.1 mg·kg-1，回收率為60%～120%；被測組分含量低于100 μg·kg-1，實驗室內變異系數小于15%。可以看出，3種前處理方法回收率和精密度良好，可滿足雞蛋中甲氧芐啶殘留檢測的需求。QuEChERS法基質效應大，回收率偏低，使用該方法時最好配制基質標曲進行定量。

3 結論

樣品采用乙腈提取，對比了陽離子交換固相萃取柱萃取、乙腈飽和正己烷液液萃取和QuEChERS萃取的萃取凈化效果。3種前處理方法操作簡便，提取時間較短，精密度和加標回收率都在參考控制范圍內，方法的檢出限均為0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。3種前處理方法均適用于雞蛋中甲氧芐啶含量的測定，適用于日常篩選和監測工作，并為農業行政主管部門制定政策和加強管理提供參考。

參考文獻

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