FAPAS牛肉試樣中摻雞肉、馬肉、羊肉、豬肉成分檢測結果分析

劉單單 蘇妙貞 梁穎思 楊丹婷 丁清龍

基金項目：廣東省市場監(jiān)督管理局科技計劃項目（2021ZS03）。

作者簡介：劉單單（1990—），女，河南商丘人，碩士，工程師。研究方向：食品安全與檢測技術。

通信作者：丁清龍（1990—），男，河北滄州人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢測。E-mail：1129749459@qq.com。

摘 要：目的：參加英國FAPAS分析實驗室組織的能力驗證，了解驗證并提高實驗室對于特定項目的檢測能力。方法：依據組織方提供的試樣說明書處理試樣，分別參照雞肉、馬肉、羊肉、豬肉的檢測相關標準，全程采用人員比對方式，雞源性成分同時采用方法比對的方式，對檢出的源性成分進行測序并在NCBI上對測出序列結果進行比對。結果：在試樣（29106）中分別檢出馬源性成分和豬源性成分，經測序比對與檢出源性成分一致。結論：本次實驗室能力驗證結果為滿意，可為同類檢測機構提供參考。

關鍵詞：牛肉；能力驗證；動物源性成分；人員比對

Analysis of the Detection Results of Chicken， Horse Meat， Lamb and Pork Components in FAPAS Beef Samples

LIU Dandan， SU Miaozhen， LIANG Yingsi， YANG Danting， DING Qinglong*

（Guangdong Institute of Food Inspection， Guangzhou 510435， China）

Abstract： Objective： To participate in the proficiency testing organized by the UK FAPAS analytical laboratory， understand the validation and improve the laboratorys testing capabilities for specific projects. Method： Process the samples according to the sample instructions provided by the organizer， and refer to the relevant testing standards for chicken， horse meat， lamb， and pork. Personnel comparison is used throughout the process. Chicken derived ingredients are also compared using method comparison， and the detected source ingredients are sequenced and compared on NCBI. Result： Horse derived components and pig derived components were detected in this sample （29106）， and they were consistent with the detected source components through sequencing comparison. Conclusion： The results of this laboratory capability verification are satisfactory and can provide reference for similar testing institutions.

Keywords： beef; capability verification; animal derived ingredients; personnel comparison

近年來關于食品中肉類制品摻假的報道層出不窮，例如引起全球關注的歐洲馬肉事件，及國內報道出的其他動物源性摻假事件等[1]，肉制品摻假越來越引起人們對食品安全的關注。隨著技術的發(fā)展，分子檢測技術也越來越多地應用到動物源性成分的檢測，尤其是各種實時熒光PCR，可對樣品進行定性或定量檢測[2]；近年來，新型核酸檢測技術的廣泛應用，如環(huán)介導等溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）、微流控芯片、分子信標技術等，使得快速恒溫以及高通量檢測動物源性成分成為可能[3-6]。DNA分子生物學方法為目前首選的用于肉制品源性成分鑒定的方法，其中應用最廣泛的是實時熒光PCR技術[7-8]。能力驗證是體現實驗室檢測能力和實現實驗室質量控制的有效手段[9]，參加能力驗證對于持續(xù)提高實驗室檢測能力和質量控制水平具有重要意義。廣東省食品檢驗所連續(xù)兩年參加了食品中動物源性成分生物鑒定，分別于2022年5月參加了中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心（Analysis Capability Assessment System of Chinese Academy of Inspection & Quarantine，ACAS）組織的食品中牛、羊、豬、馬源性成分檢測能力驗證ACAS-PT1397（2022）[10]和2023年2月參加了英國FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）組織的食品中雞肉、馬肉、羊肉或者豬肉一或多個成分檢測能力驗證FAPAS-29106（2023）。現將2023年FAPAS Proficiency Test 29106的能力驗證情況報告如下，并對兩年的能力驗證結果進行分析討論，以期為同類檢測機構提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ME203天平（美國梅特勒-托利多科技有限公司）；AB2-3S1生物安全柜（新加坡ESCO公司）；Nano核酸蛋白分析儀（日本島津企業(yè)管理有限公司）；CFX-96實時熒光PCR儀（美國伯樂公司）；T100-PCR儀（美國伯樂公司）；Sub-cell GT電泳儀（美國伯樂公司）；GelDoc XR+凝膠成像儀（美國伯樂公司）；Quant Studio 6 Flex實時熒光PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Centrifuge 5430離心機（德國艾本德公司）。

DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（日本TaKaRa公司）；Premix Ex Taq（日本TaKaRa公司）；羊源性成分檢測試劑參照標準SN/T 2051—2008，選用試劑為Real Time PCR Ovine DNA Detection Kit（日本TaKaRa公司）；內參基因、豬源性成分的上游引物、下游引物及探針按照SN/T 3730.8—2013提供的序列信息合成；內參基因（或需要檢測）、雞源性成分的上游引物、下游引物、探針（或有）按照SN/T 2978—2011和GB/T 38164—2019提供的序列信息合成；馬源性成分的上游引物、下游引物、探針按照SN/T 3730.5—2013提供的序列信息合成。以上序列信息合成和PCR產物測序均由生工生物工程上海股份有限公司完成。

1.2 樣品來源

英國FAPAS分析實驗室能力驗證樣品（FAPAS Proficiency Test 29106），牛肉（凍干）試驗材料1份，塑料瓶裝，重約20 g；陽性樣品為市場上購買的雞肉、馬肉、羊肉和豬肉，陰性樣品為牛源性標準品；實驗用水為無菌ddH2O。

1.3 實驗方法

雞源性成分檢測參照SN/T 2978—2011和

GB/T 38164—2019；馬源性成分檢測參照

SN/T 3730.5—2013；羊源性成分檢測試劑和方法參照標準SN/T 2051—2008；豬源性成分檢測參照

SN/T 3730.8—2013；樣品前處理參照組織方提供的試樣說明書。全程采用人員比對（檢驗員A和檢驗員B），部分源性成分采用方法比對的方式。根據各標準要求，對各對照結果進行判定。

1.3.1 NDA提取和檢驗過程質量控制

按照組織方提供的試樣說明書處理試樣后，均勻稱取約200 mg的試樣于1.5 mL離心管中，制備3份平行樣，并取2份牛源性標準品作為提取陰性對照，另取200 mL無菌水作為提取過程控制的空白對照，這兩種對照全程參與試樣提取，參照德國QIAGEN DNA提取試劑盒說明書進行提取并測定DNA濃度。試劑空白對照即用水代替模板；參與比對人員分別在不同的實驗室取樣提取，以防止交叉污染。

1.3.2 提取DNA質量測定

采用核酸蛋白儀測定所提取DNA的濃度和純度（OD260/OD280），將DNA濃度統(tǒng)一用無菌水稀釋至50 ng·μL-1進行后續(xù)實驗，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 雞源性成分PCR擴增

按標準方法GB/T 38164—2019，用Quant Studio 6 Flex實時熒光PCR儀進行雞源性內參照成分檢測。25 μL總反應體系包括12.5 μL的2×premix、上下引物（10 μmoL·L-1）各0.5 μL、探針（10 μmoL·L-1）

0.5 μL、提取的模板DNA 5 μL及ddH2O 6 μL。反應條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時收集熒光。

按標準方法SN/T 2978—2011，用T100-PCR儀進行雞源性成分方法比對檢測。25 μL總反應體系包括2×PCR緩沖液12.5 μL、dNTPs（2 mmol·L-1）

5 μL、上下引物對（10 nmol·L-1）各0.5 μL、DNA聚合酶（1 U·μL-1）1 μL、提取的模板DNA 5 μL及ddH2O

0.5 μL。反應條件為94 ℃預變性1 min，94 ℃變性45 s，63 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR擴增產物電泳檢測：稱取1.5 g瓊脂糖于100 mL電泳級沖液中，加熱，充分溶化后，加入染色劑至終濃度為0.5 μg·mL-1制膠，在電泳槽中加入電泳級沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將8 μL各PCR擴增產物分別和3 μL加樣緩沖液混合，點樣。

9 V·cm-1恒壓，電泳至染色指示劑遷移至凝膠中部。凝膠成像儀下觀察電泳結果并記錄。

1.3.4 馬源性成分實時熒光PCR擴增

按標準方法SN/T 3730.5—2013，用CFX-96實時熒光PCR儀進行馬源性成分檢測。25 μL總反應體系包括12.5 μL的2×premix、上下引物（10 μmoL·L-1）各1 μL、10 μmoL·L-1探針1 μL、提取的模板DNA

2 μL及ddH2O 7.5 μL。反應條件為94 ℃預變性1 min，

1個循環(huán)；94 ℃變性34 s，60 ℃退火延伸45 s，40個循環(huán)，60 ℃收集熒光。

1.3.5 羊源性成分實時熒光PCR擴增

按標準方法SN/T 2051—2008，用CFX-96實時熒光PCR儀進行羊源性成分檢測，25 μL總反應體系包括2×羊源性檢測預混液12.5 μL、羊源性檢測引物混合液（10 μmoL·L-1）1 μL、羊源性檢測探針混合液（10 μmoL·L-1）1 μL、提取的模板DNA 2 μL及ddH2O 8.5 μL。反應條件為95 ℃/10 s，1個循環(huán)；95 ℃/5 s，60 ℃/30 s，40個循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時收集熒光。

1.3.6 豬源性成分實時熒光PCR擴增

按標準方法SN/T 3730.8—2013，用Quant Studio 6 Flex實時熒光PCR儀進行豬源性成分檢測。

25 μL總反應體系包括12.5 μL的2×premix、上下引物

（10 μmoL·L-1）各1 μL、10 μmoL·L-1探針1 μL、提取的模板DNA 2 μL及ddH2O 7.5 μL。反應條件為

50 ℃/2 min，95 ℃/10 min；45個循環(huán)為95 ℃/15 s，58 ℃/1 min，在每次循環(huán)的退火時收集熒光。

1.3.7 測序

當PCR檢出可疑陽性時，對PCR擴增產物進行DNA測序。

2 結果與分析

2.1 試樣DNA提取質量

檢驗人員A取試樣29106（牛肉）3份，分別標記為1-1、1-2、1-3，另取一份陰性樣品（牛源性標準品）標記為NC1；檢驗人員B另取試樣29106（牛肉）3份，分別記為2-1、2-2、2-3，另取一份陰性樣品（牛源性標準品）標記為NC2。每組實驗過程中設置空白對照（KB）、提取對照（TK）、陽性對照（PC）。每組試樣提取DNA后經核酸蛋白分析儀檢測，結果見表1。經測定試樣OD260/OD280值，比值均處于1.8～2.0，提取效果良好。

2.2 雞、馬、羊、豬源性成分檢測結果

試樣29106雞、馬、羊、豬源性成分檢測結果見表2。A、B兩位檢驗員檢測雞源性成分的實時熒光PCR見圖1和圖2，可知兩人檢測結果一致，均為未檢出雞源性成分。在雞源性成分的檢測中同時用到SN/T 2978—2011進行檢測，通過電泳結果（圖3）可知與實時熒光PCR檢測結果一致。

A、B兩位檢驗員檢測馬源性成分的實時熒光PCR見圖4和圖5，可知兩人檢測結果一致，均檢出馬源性成分。A、B兩位檢驗員檢測羊源性成分的實時熒光PCR見圖6和圖7，可知兩人檢測結果一致，均未檢出羊源性成分。A、B兩位檢驗員檢測豬源性成分的實時熒光PCR見圖8和圖9，可知兩人檢測結果一致，均檢出豬源性成分。

2.3 檢出源性成分測序結果

將檢測出豬源性成分和馬源性成分的PCR產物送至生工生物工程上海股份有限公司廣州分公司進行測序。將馬源性測序結果序列與SN/T 3730.5—2013附錄A中序列比對，同源性為100%，并將測序結果序列上傳到NCBI數據庫中進行比對，比對結果為馬源性成分；將豬源性測序結果序列與

B/T 38164—2019附錄A中序列比對，同源性為97%，并將測序結果序列上傳到NCBI數據庫中進行比對，比對結果為豬源性成分。

3 結論

根據FAPAS公布的能力驗證結果，實驗室此次能力驗證結果為“滿意”。為保證檢測結果的準確性，本次能力驗證全程用人員比對的方式進行，并在不同的實驗室取樣和提取試樣核酸，有效防范了取樣和提取過程中的交叉污染，避免了檢測結果異常情況的出現[11]。同時，在雞源性成分的檢測中加入方法比對的方式，兩種方法結果一致，進一步證明了檢測結果的準確性。對檢出的豬源性、馬源性成分分別進行了測序，比對結果良好，均與檢出的源性成分相一致。

本實驗室在2022年5月參加了ACAS組織的食品中牛、羊、豬、馬源性成分檢測能力驗證ACAS-PT1397（2022），與之相比，此次檢測中增加了人員比對、方法比對和測序比對的方式，兩次能力驗證結果均為“滿意”，由此可見本實驗室在分子技術方面有較高的成熟度。

隨著人們生活水平的不斷提高，肉類摻假問題也越來越備受關注，分子檢測技術已成分第三方檢測實驗室不可或缺的一部分。此次能力驗證采用多種方式進行，不僅保證了結果的準確性，也對實驗室整體綜合能力進行了驗證，包括人員能力、技術方法等。隨著檢測技術的不斷發(fā)展，實驗室在能力驗證、盲樣考核等方面，可選擇不同的方式方法，采用新技術、新手段以不斷提升實驗室的綜合能力。本次能力驗證采用的各方面技術為第三方檢測機構的能力考核提供了重要參考價值。

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