蘇州市工業園區市售阿膠類保健品基于PCR技術的檢測結果分析

付群 張玲 龐幸 劉巖 韓蓉 楊嫣驪

作者簡介：付群（1987—），男，江西樟樹人，碩士。研究方向：公共衛生、食品安全。

通信作者：楊嫣驪（1990—），女，江蘇蘇州人，本科。研究方向：藥品安全。E-mail： yangyanli@sipac.gov.cn。

摘 要：阿膠因其獨有的藥用價值在食品、藥品等領域中被廣泛應用。市場上的阿膠類產品良莠不齊，市場監管辨別真偽及摻假的手段多為國家藥典的標準方法液相色譜-質譜聯用法，但該方法樣品處理復雜、檢測成本高、檢測靈敏度不足且易產生假陽性結果。本研究對分布于蘇州市工業園區的多家藥店的阿膠類產品進行隨機取樣，用PCR檢測技術對其動物源性成分進行檢測和分析，為市場監管提供新的參考及思路。

關鍵詞：阿膠；動物源性成分；PCR技術；線粒體DNA

Analysis of PCR-Based Detection Results of Donkey-Hide Gelatin Health Products Sold in Suzhou Industrial Park

FU Qun1， ZHANG Ling2， PANG Xing1， LIU Yan3， HAN Rong4， YANG Yanli1*

（1.Suzhou Industrial Park Food and Drug Safety Inspection Unit， Suzhou 215000， China; 2.Suzhou Institute for Food Control， Suzhou 215000， China; 3.College of Pharmaceutical Sciences， Soochow University， Suzhou 215000， China; 4.Suzhou Prem Biotechnology Co.， Ltd.， Suzhou 215000， China）

Abstract： Donkey-hide gelatin is widely used in the fields of food and medicine because of its unique medicinal value. The ass hide glue products on the market are good and bad， most of the methods for market supervision to distinguish authenticity and adulteration are liquid chromatography-mass spectrometry， which is the standard method of national pharmacopoeia， but this method has some disadvantages， such as complex sample processing， high detection cost， low detection sensitivity and easy to produce false positive results. In this study， samples of donkey-hide products were collected from a number of pharmacies randomly distributed in Suzhou Industrial Park. The animal-derived ingredients of donkey-hide products were detected and analyzed by PCR， which provided provide new reference and train of thought for market supervision.

Keywords： donkey-hide gelatin; animal-derived ingredients; PCR technology; mitochondrial DNA

阿膠是一種由馬科動物驢的皮熬制而成，具有藥用價值的滋補品。近年來，隨著食品衛生健康規范的不斷改革，阿膠也逐漸從藥用方向轉向保健、食療等諸多方向。目前，市場上有藥用型阿膠生產批文的企業有數十家，有食用阿膠生產資質的企業數量更多，致使阿膠市場異常混亂。隨著市場對阿膠需求量的不斷增加，驢皮供不應求，導致阿膠成本上漲。許多企業為了追求利益，在熬制阿膠的過程中摻入豬、牛、羊和馬等價格低廉的動物皮冒充驢皮，致使阿膠的藥用功效降低。

為了整頓阿膠市場，國家先后出臺了多種檢測標準，如《阿膠補血口服液中牛皮源成分檢查項補充檢驗方法》（BJY 201805）、《阿膠補血膏中牛皮源成分檢查項補充檢驗方法》（BJY 201804）等，以上標準檢驗方法及目前中國藥典2020版均采用液相色譜-質譜聯用技術為檢測手段，以液相色譜為分離系統，質譜為檢測系統，通過不同物種的特征肽鑒別阿膠產品的動物源性[1-2]。該技術所需的質譜儀多為國外進口，價格昂貴，且需配套的高效液相色譜儀、氮氣（發生器）、不間斷電源、樣本前處理裝置（離心機、氮吹儀、固相萃取裝置、通風柜等）以及獨立、通風、室溫和濕度合適的實驗室空間，增加了實驗室的運行維護成本。基于PCR技術的分子生物學技術目前已被應用于動物源性的鑒定，如食品檢測中的肉源摻假檢測、動物源中藥材等。本研究采用多重PCR檢測方法（專利號：201810482987.3；201810016749.3），以牛、羊、豬、馬、驢、雞、鴨、狗、鼠、狐貍和兔這11種肉源線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）為檢測靶基因[3-4]，對分布于蘇州市工業園區的50家藥店在售的56個阿膠類商品隨機取樣并進行多重篩查檢測，對篩查結果陽性的樣品通過單重PCR的國標或專利方法進行進一步復檢確認。本文研究了目前市場上阿膠產品質量狀況及常見摻假肉源種類，為市場監管部門提供新的檢測方法和監管思路。

1 材料與方法

1.1 儀器

普通聚合酶鏈式反應（PCR）儀，杭州朗基科學儀器有限公司；凝膠成像儀，杭州朗基科學儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器場；Nanodrop 2000/2000C分光光度計，Thermo scientific公司；微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.2 試劑

DNA提取試劑（PCR級柱式動物線粒體DNAout）盒，天恩澤基因科技有限公司；TAE（50×）凝膠電泳液，BioSharp公司；瓊脂糖，BIOWEST維百奧生物科技公司；本研究所用引物均購自GENEWIZ生物科技有限公司；DreamTaq Green PCR Master Mix、GeneRuler 100 bp DNA ladder及DNA loading Dye，Thermo Scientific公司；SuperRed/GelRed核酸染料，BioSharp公司；PBS溶液，HyClone公司。

1.3 抽檢樣品

本次抽檢的阿膠制品分別來自蘇州市工業園區中金雞湖商務區、獨墅湖科創區、陽澄湖度假區以及高端貿易制造區的50家藥店，共計56份阿膠產品，其中口服液制品8例，膠漿制品11例，其余均為固態顆粒、片劑、板狀和膏制品。

1.4 樣品前處理與核酸提取

塊狀樣品：取1 g樣品，研磨成粉末狀，放入離心管，加入600 μL PBS緩沖液，60 ℃水浴30 min，12 000 r·min-1離心1 min，吸取上清1 μL作為PCR模板。顆粒狀樣品：取1 g樣品放入離心管，加入600 μL PBS緩沖液，60 ℃水浴30 min，12 000 r·min-1離心1 min，吸取上清1 μL作為PCR模板。阿膠漿、口服液類樣品：取2個2 mL離心管，每管中分別加入1.5 mL樣品，12 000 r·min-1離心1 min。將上清液轉移至吸附柱并離心，廢棄收集管中液體，重復多次，直至3 mL樣品全部經吸附柱處理。將吸附柱置于1.5 mL離心管中，加入50 μL 65～80 ℃預熱的TE洗脫液進行洗脫，室溫放置2 min，12 000 r·min-1離心1 min，管底沉淀即為提取的核酸。

1.5 多重PCR體系對阿膠產品中的肉源篩查

本研究采用前期構建的多重PCR方法對阿膠進行初篩，該多重PCR方法由四重PCR和八重PCR雙聯合多重體系組成，可以檢測樣品中是否含有牛、羊、豬、馬、驢、雞、鴨、狗、鼠、狐貍和兔共

11種肉源性成分，具體引物及檢測方法等參照文獻內容[3-4]。多重PCR檢測是為了篩選出除驢以外的肉源成分，再采用單重PCR檢測進一步驗證。

2 結果與分析

2.1 單重PCR驗證

對樣品中出現牛、羊、豬、馬和驢5種動物源阿膠產品，通過單重PCR國家標準方法及相關專利方法對檢測結果進一步驗證，其中，豬、牛、羊按照《肉類罐頭中牛、羊、豬、雞、鴨源性成分檢測方法PCR法》（QB/T 5505—2020）進行測定。由于阿膠加工過程中核酸的分解導致核酸濃度大幅降低，單重PCR驗證階段對所有樣品均進行兩輪PCR反應，第1輪PCR旨在放大樣品核酸中靶標DNA序列分子，經電泳分析篩選出部分動物源性DNA載量較大的樣品，然后以第1輪的PCR產物為模板對此輪未檢出條帶的樣品繼續進行第2輪PCR反應，第2輪反應結束后再進行電泳凝膠結果分析，具體引物及產物如表1所示，相關PCR反應程序如表2～表5所示。

2.2 樣品檢測結果

56份檢測樣品中，10份樣品檢測結果低于最低檢測限，未能檢出常見肉源成分，占樣品總量17.8%；10份樣品檢出了驢源性成分，其中僅1份樣品為單一的驢源性成分；其余36份樣品均未檢出驢源性成分。9份樣品不僅檢出了驢源性成分，還檢出了牛、馬、豬和羊中的1種或多種肉源成分，占樣品總量16.1%。36份樣品檢出了牛、馬、豬、羊中的

1種或多種肉源成分，占樣品總量64.3%。本研究中首先采用多重PCR方法檢測樣品中是否含有牛、羊、豬、馬、驢、雞、鴨、狗、鼠、狐貍和兔共11種肉源性成分[3-4]，采用多重PCR技術是為了高效篩選出樣品中是否含有除驢以外的肉源成分，多重PCR擴增產物通過凝膠電泳中電泳條帶的大小判斷肉源種類，圖1為部分樣品多重PCR電泳結果。為進一步驗證多重PCR檢測結果，再采用《肉類罐頭中牛、羊、豬、雞、鴨源性成分檢測方法 PCR法》（QB/T 5505—2020）中單重PCR檢測方法進一步驗證多重PICR檢測結果，單重驗證PCR代表性電泳結果如圖2所示，檢測結果統計分析如表6～表8所示。

泳道M是100 bp GeneRuler，0是陰性對照，1或2為樣品檢測結果。圖A泳道1～2為牛；圖B泳道1中的兩個條帶為豬和牛；圖C為豬；圖D泳道1～2為驢；圖E為馬/馬騾。

3 結論

阿膠是市場上常見的動物源中藥，中國藥典規定阿膠必須由驢皮熬制而成。阿膠在加工過程中要經歷高溫熬制等一系列加工步驟，導致阿膠中DNA含量大幅降低[6]。本研究基于3方面的考慮選擇了靶基因為mtDNA的PCR檢測方法：mtDNA基因包含不同物種之間的高DNA變異和同一物種個體之間的低DNA變異，可區分肉類物種[7]；肌肉中線粒體拷貝數高，如單個骨骼肌細胞中約有3 500個線粒體拷貝數[8]；線粒體為環狀閉合DNA，不易被破壞[9]。因此基于mtDNA的PCR檢測可有效提高樣品的檢出率。

為了全面了解目前阿膠產品可能出現的摻假動物源，本研究首先選用了“公共引物”介導的多重PCR技術，以狗、雞、牛、豬、馬、驢、狐貍、兔子、鼠、鴨、羊這11種肉源的線粒體DNA作為檢測靶標，對56個檢測樣品進行初篩。多重PCR方法可一次性鑒別多種目標成分，與傳統的單重PCR方法相比，極大地節約了檢測時間和實驗試劑，降低了檢測成本。為進一步確認多重PCR檢測結果，通過單重PCR的國標或專利方法對初篩陽性樣品進行第2輪復檢。檢測結果顯示，56份阿膠樣品中有

45份檢出牛、豬、羊、馬/馬騾1種或多種其他動物源性成分，主要是牛和豬，其次為羊和馬/馬騾。由于檢測靶標為mtDNA，本研究采用的檢測方法不能對馬和馬騾進行區分。此外，本研究56個樣品中，有10個樣品未能有效檢出動物源性成分，表明阿膠制作過程中的DNA降解會使以DNA為靶標的相關分子檢測方法受到限制。

目前，《中華人民共和國藥典》2020年版采用液相色譜-質譜聯用法作為阿膠中動物源性成分檢測的主要手段。其檢測對象為不同物種的特征肽，在動物源性的檢測中需要參比物進行峰形對照[10]。而PCR類檢測方法則直接從DNA序列入手，通過特異引物對各物種特異性的一段序列大量擴增，檢測靈敏度高于液質聯用技術，且無須參比物進行對照，排除了外源假陽性尤其是驢動物源性的可能。因此，兩種分別基于特征肽和DNA的檢測方法的檢測結果可以相互印證。雖然基于PCR技術的分子生物學技術可應用于動物源中藥材的種屬鑒定，但針對DNA序列的PCR類檢測方法尚無阿膠產品動物源摻假的法定檢測方法，本研究結果仍需進一步采用液相色譜-質譜聯用方法進行確認。建議將用于食品肉源鑒定PCR國家標準方法納入阿膠產品法定檢測方法的補充，打擊阿膠產品摻假行為，維護消費者的利益。

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