污染土壤生物修復技術的進展與工程應用現狀

房曉宇，盧滇楠，劉錚

（清華大學化學工程系，北京 100084）

在工業、農業等生產活動中一些污染物通過各種途徑進入土壤，造成了土壤污染。據報道，我國有16.1%的土壤受到污染[1]，22.1%的耕地存在污染混合物[2]；歐洲有280 萬個地點可能受到土壤污染[3]，美國有45萬塊棕地存在潛在或已知的危險物質[4]。農業土壤退化和由此造成的作物產量損失也尤其令人擔憂。經受污染的農作物、土壤灰塵、大氣粉塵等進入人體后，會嚴重損害人的身體健康[5]。土壤擁有最大的陸地碳庫，估計儲存了4.1萬億噸，幾乎是大氣碳估計總量的5倍[6]。受污染的土壤可能無法發揮其在碳循環中的作用。

現有的土壤修復技術及其所適用的污染場地類型如圖1所示，其中土壤修復技術主要分為物理法（換土法、熱脫附、氣相抽提法等）、化學法（萃取法、氧化法、淋洗法等）和生物法（自然衰減、生物刺激、生物強化等）[7]。生物法修復土壤是利用自然界的生物體即植物、真菌、細菌等吸收、轉化、清除或降解污染物[8]。與物理和化學法相比，生物法具有去除率高、無二次污染、對土壤本體結構破壞小等優點，越來越受到各國重視[9]。

圖1 污染場地類型及主要修復技術

本文針對土壤污染物的轉化與利用問題，綜述了生物修復技術在不同污染土壤中的作用機制、適用范圍與工程實例，重點介紹了生物修復菌株篩選、土壤微生態分析、生物修復過程強化三方面的研究進展，并針對生物修復技術工程實施和廢棄生物質轉化案例進行了分析，展望了生物修復技術在土壤修復中所面臨的挑戰和機遇。

1 土壤污染物類型及生物修復技術

根據污染物生物利用度和轉化途徑的不同，可將土壤中污染物分為無機、有機和廢棄生物質三類。無機污染物包括鎘、砷、硒、鈾等，其生物利用度較低；有機污染物包括農藥、殺蟲劑等難降解物質；廢棄生物質則包括農業廢棄物、城鎮生活垃圾、畜禽糞便等。表1列舉了常見的土壤污染物類型及生物修復技術。

表1 土壤污染物的類型和生物修復技術

1.1 生物鈍化無機污染物

生物鈍化是指通過改變污染物在土壤中的化學形態或賦存狀態，從而降低污染物在土壤中的遷移性和生物可利用度，進而減少植物對污染物的吸收[10-11]。土壤中重金屬的賦存形態可分為可交換態、碳酸鹽結合態、鐵錳氧化物結合態、有機物結合態和殘渣態[12]5 種，其中可交換態和碳酸鹽結合態遷移性較強，毒性較大，最容易被生物利用。生物可以通過鈍化將重金屬在土壤中的可利用形態轉化為有機結合態或殘渣態，降低毒性，鈍化機制如圖2所示。從污染物與生物體結合的不同部位，可將重金屬的鈍化途徑分為表面吸附、胞外富集（胞外絡合和胞外沉淀）和胞內沉積等，見表2。鐵錳氧化物結合態和有機物結合態吸附或共沉淀在土壤中，在土壤中pH 和氧化還原電位變化時，部分重金屬元素溶出轉化為可交換態，對環境產生危害[21]。殘渣態重金屬含量穩定，在自然條件下不易釋放，不易被植物吸收或生物鈍化。

表2 生物鈍化土壤中的重金屬污染物案例

圖2 土壤中重金屬生物鈍化機制

細菌表面帶負電并含有羧基、羥基、氨基、巰基等基團，可以通過靜電作用、表面絡合、離子交換等方式吸附重金屬離子。真菌菌絲可在土壤中形成伸展的網狀結構，菌絲特殊的構造可吸附土壤中的重金屬離子。土壤微生物所分泌的多聚糖、脂多糖、糖蛋白、腐殖酸等可與重金屬離子形成絡合物[22]，進而減少重金屬在土壤中的遷移性[11]。Su等[16]和Van Roy 等[23]發現在缺氧條件下，硫酸鹽還原細菌能還原硫酸鹽產生硫化物，進而與金屬離子作用形成不溶性的硫化物沉淀。Macaskie 等[17]分離的檸檬酸細菌屬Citrobacer可分泌一種抗Cd的酸性磷酸酯酶，能分解2-磷酸甘油，產生的HPO42-與Cd2+形成CdHPO4沉淀。受到重金屬脅迫的植物根系會分泌膠質、糖類、有機酸等，在根際環境中與金屬離子相互作用進而抑制植物對重金屬的吸收[24]。被微生物細胞攝取的重金屬離子被分配于細胞內不同器官形成封閉的電子稠密顆粒或與聚磷酸鹽結合積累在液泡或線粒體中，隨后經過代謝作用排出體外。微生物體內可合成金屬硫蛋白（MT），MT 可通過Cys 殘基上的巰基與金屬離子結合形成無毒或低毒絡合物[18]。除了金屬硫蛋白外，微生物細胞內部的多肽段也可以與金屬離子結合將其沉積在細胞內部。微生物細胞中質粒或轉座子上的抗性基因編碼的金屬解毒酶能催化金屬發生氧化、還原、甲基化、去甲基化等反應，將高毒性金屬轉化為低毒的形態。例如，有機汞化合物首先被有機汞裂解酶降解為Hg2+，然后被汞還原酶還原為單質汞。假單胞菌（Pseudomonadsp.）分泌的鉻酸還原酶可將Cr(Ⅵ)還原為低毒、溶解度更小的Cr(Ⅲ)[19]。Roux 等[20]的研究表明，羅爾斯通氏菌（Ralstonia metallidurans）CH34 可以還原Se(Ⅳ)為低毒的單質硒，在胞內沉積。

1.2 生物降解有機污染物

微生物能夠以有機污染物作為碳源或能源，將其分解為低毒或無毒的小分子化合物，如簡單醇或酸、CO2、H2O 等，同時釋放能量滿足自身生長需求。涉及的酶催化反應包括氧化還原、基團轉移、水解作用、氨化、乙酰化、酯化、縮合、雙鍵斷裂及鹵原子轉移等[25]，表3列舉了若干典型案例。

表3 生物降解有機污染物典型案例

有機污染物可通過胞內酶和胞外酶被降解，其降解機制如圖3所示。如真菌分泌的木質素降解酶系可將多環芳烴氧化降解，植物根系釋放到土壤中的酶也可以直接參與污染物的降解[35]，如脫鹵酶、硝基還原酶、過氧化物酶、漆酶和腈水解酶等可分別降解三氯乙烯、2,4,6-三硝基甲苯（TNT）、多環芳烴、多氯聯苯等多種持久性有機污染物[36-37]。植物還可以主動吸收有機污染物，通過木質化將有機物分解為木質素儲存在組織內，或通過體內細胞的一系列酶促反應將污染物徹底礦化為CO2和H2O。在胞內降解過程中，污染物先通過主動運輸、被動擴散、促進擴散、基團移位、胞飲作用進入細胞，然后被胞內酶降解[38]。細菌和酵母等產生生物表面活性劑可以提高疏水性有機物的生物可利用度。Hua 等[39]考察了E.cloacaeTU 所分泌的胞外多糖對石油烴類物質的水溶性和生物降解速率的促進作用，證明了胞外多糖可乳化十六烷烴，同時增強表面的疏水性并提高其表面zeta電位，使電荷趨于中性，有助于提高十六烷烴的生物可利用度，并顯著提高了十六烷烴的礦化速度。

圖3 功能微生物對有機污染物的降解利用機制

1.3 生物轉化秸稈類廢棄物

在廢棄生物質中，秸稈是一類來源廣泛、儲量豐富、價格低廉的可再生資源，我國年產作物類秸稈約9億噸[40]。秸稈的干物質一般由灰分、粗蛋白和非氮化合物組成，粗蛋白包括蛋白質和其他含氮化合物，非氮化合物包括纖維素、半纖維素、木聚糖醛酸和木質素等，其中纖維素（30%～35%）、半纖維素（20%～30%）、木質素（20%～25%）所占比重較大，是秸稈的主要支撐組織，很難被微生物分解[41]。秸稈轉化的本質為借助微生物的酶解作用高效分解纖維素、半纖維素、木質素的過程。秸稈助腐菌能夠進化出不同降解纖維素、半纖維素和木質素的功能，從而達到降解秸稈的目的，其助腐降解如圖4所示。

圖4 纖維素酶系和木質素酶系介導的秸稈助腐菌降解秸稈

目前采用秸稈助腐菌主要包括細菌、真菌和放線菌三類，其中真菌分泌的酶系降解秸稈的能力最強[42]。真菌通過分泌到胞外的游離纖維素酶系水解和氧化降解纖維素；細菌通過纖維素多酶復合體如纖維小體更加徹底地降解纖維素。纖維素的水解主要通過內切纖維素酶、外切纖維素酶和β-1,4-葡聚糖苷酶的協同作用實現[43]。纖維素酶的纖維連接區（CBD）與纖維素結合，然后利用催化域水解纖維素[44]。半纖維素是木聚糖、甘露糖等單體形成的多糖，以木聚糖為主，降解機理與纖維素類似。β-1,4-內切木聚糖酶、β-1,4-外切木聚糖酶和β-木糖苷酶分別作用于木聚糖的內部非還原性末端和低聚糖，前兩者以木聚糖為最小的水解單位，降解為低聚糖，后者將低聚糖進一步降解為單糖[44]。微生物通過降解秸稈中的纖維素和半纖維素產生還原性糖，來維持自身的生長繁殖。微生物降解木質素的過程主要依靠胞外酶進行。已發現的木質素降解酶主要有木質素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase）[45]。木質素在木質素降解酶的作用下發生側鏈氧化，解聚為低分子化合物，并生成大量的木質素基本結構單元。木質素單體多為甲氧基芳香族分子，甲氧基的存在限制了木質素的后續降解效果。在木質素單體的進一步降解之前，微生物分泌相關的酶使木質素單體去甲基化后形成的愈創木酚、丁香酚等酚類化合物是典型的生物質腐殖酸的主要成分，對于提高土壤肥力、抑制土壤鈍化具有重要作用[46]。付丹妮等[47]從常年水稻種植土壤中篩選出1株能高效降解秸稈的黑曲霉CKB，在常溫正常土壤條件下，秸稈經該菌降解35天后，失重率可達49%。

2 生物修復技術研究進展

已有的實驗室研究和工程實踐表明，降解微生物篩選與定殖和修復過程強化是提高土壤生物修復過程效率并降低其成本的關鍵，土壤微生態分析技術服務于土壤生物修復過程監測和修復效果評估，下面具體介紹這三方面的研究進展。

2.1 降解菌高效篩選和構建技術

傳統的篩選方法是選擇培養基法和液相富集法，過程中打亂了土壤體系，破壞了微生物間的相互作用，篩選微生物的菌群多樣性降低，且成本高、周期長[48-49]。本文作者研究團隊[13-14,47,50-53]建立了土壤環流誘導馴化方法，在盡可能接近于自然狀態下篩選分離土壤中微生物，成功篩選到多株石油烴、百菌清、二氯喹啉酸降解、秸稈腐化、重金屬鈍化等有機物降解的功能微生物。根際土壤微生物比非根際土壤中的微生物活性高、數量多，在土壤中數量是非根系土壤的10～100 倍。根際圈微生物篩選通過篩選具有降解污染物能力并能夠利用植物分泌物生長的微生物強化根際圈修復，是一種能有效篩選功能微生物的方法。Zuzolo 等[54]采用內生菌根的高羊茅體系篩選具有6株高效降解石油烴的菌根菌，設計了菌根菌-生物刺激-植物修復的耦合修復。基于自動化和儀器分析技術的高通量篩選平臺突破了人工篩選在效率、穩定性等方面的限制，成為菌種選育的重要方法。其中液滴微流控是一種將反應體系微型化的技術，可以實現在微體積、大小均一的液滴對單細胞進行培養、反應、檢測和篩選[55]。Chen等[56]將自制的微流控芯片和單細胞培養技術聯合成功用于咪唑啉酮降解菌的富集和篩選，從混菌中篩選得到了156株有降解能力的菌株，混菌和單菌都能在7天內完成對咪唑啉酮不同程度的降解。花秀夫等[39]利用低溫等離子體誘變技術得到耐鹽陰溝腸桿菌E.cloacaeTU，能適應質量分數7.5%NaCl 的高鹽環境，對石油烴的降解效率是野生菌的2.5倍。

2.2 生物修復過程強化技術

土壤結構密實性和空間不均一性和吸附性能限制了外源微生物在土壤中的遷移，導致微生物不能充分接觸污染物，制約生物修復效果[57]。生物刺激是通過土壤中添加營養物質、電子受體等促進污染物降解微生物的生長，通過添加生物表面活性劑或生物質等提高污染物的生物可利用性。所采用生物表面活性劑包括鼠李糖脂、皂角苷、烷基多苷、槐糖脂、海藻寡糖等[58]。生物強化是通過向污染土壤中加入降解微生物來提高土壤修復速率，如張坤等[62]采用土壤中添加麥秸和微生物制劑的方法，破壞污染土壤毛細結構，從而抑制返鹽并富集石油烴污染物，通過添加石油烴降解微生物加速修復，并通過場地實驗室證實了該方法的實用性。在實際應用中常將生物刺激技術和生物強化技術結合起來加速生物修復的過程，見表4。

表4 生物修復過程強化技術

2.3 土壤微生態分析技術

土壤微生物是土壤體系物質轉化的生物反應器。土壤中絕大部分微生物是不能培養的，可培養的微生物占總數的0.1%～1%。目前分離出的微生物基本上都是之前已經報道過的種屬，不能培養的菌株在污染土壤中發揮的代謝功能難以被評估[65]。微生態分析技術作為一種有效的生物監控手段，直接反映了微生物菌株定植、菌群的動態變化等，是修復過程監測和結果評估的科學工具，也為修復過程優化提供重要依據[66]。宏基因組學可以研究降解過程的微生物基因，在DNA水平上研究微生物群落結構，并獲得與之相關的特定微生物群落的基因豐度。宏轉錄組學通過分離提取微生物群落中的RNA 提供基因活性方面的信息，來確定活躍微生物的代謝功能[67]。宏蛋白質組學則是以與微生物生理生化活動直接相關的蛋白質為研究對象，通過對差異蛋白質進行鑒定，可以甄選出與微生物生理活動密切相關的基因，進而闡明微生物的基因組功能[68]。Zhou等[69]利用宏轉錄組學研究汞污染的稻田，發現該地微生物群落中相對豐度較低，但能夠降解甲基汞的主要微生物是Catenulisporaceae、Frankiaceae、Mycobacteriaceae和Thermomonosporaceae。Chen 等[70]采用穩定同位素探針-多組學-單細胞分析方法，發現一株未被報道過的不能培養α-變形菌門UBA11222降解聯苯的機制，而在某些多環芳烴污染土壤中不能培養的固氮菌是群落中的活躍組分并能有效降解聯苯，提出在這些土壤中，更有效的生物修復方法可能是添加硝酸鹽的自然衰減。基于多組學的微生態分析技術能根據固有細菌和富集培養菌株的差異，設計有針對性的生物修復策略，為生物修復過程提供科學的指導。

3 污染土壤生物修復工程實踐

3.1 加油站修復

加油站是國內外石化行業土壤和地下水污染重點防治對象之一。加油站地下輸油管線或地下儲油罐泄漏的主要污染物為石油烴、苯系物、二氯甲烷、甲基叔丁基醚（MTBE）、萘、鉛等，其中石油烴、苯系物可隨地下水擴散100m 以上，MTBE由于水溶性大、難降解等原因擴散范圍可達數百米[71]。據統計，使用15年以上的地下儲油罐，70%會出現泄漏[72]。國外發達國家幾乎所有石油類場地修復均優先采用自然衰減，但是加油站的活動較頻繁，需配套其他可以強化自然衰減的技術，以實現場地的有效修復[73]。崔長征等[74-75]針對大港加油站石油烴、苯系物超標的污染情況，采用多相抽提-強化脫附-生物修復接力修復技術體系集成，通過加壓和微泡注入降解菌液修復后，苯和石油烴及其他檢測污染物濃度均低于管制值。

3.2 廢棄化工場地修復

化工場地可能含有各種污染物，如汞、鎘、鉻、鉛、砷、鎳等重金屬，以及苯系物、氯代烴、石油烴、農藥、多氯聯苯、硝基化合物等有機物。土壤中的污染物大多處于“老化”狀態，吸附于土壤顆粒，尤其是細粒土壤表面，或滲入土壤顆粒內部，甚至嵌于土壤晶格中，其遷移擴散能力相對較低，修復難度較大。而且廢棄化工場地有較高的利用價值，允許的修復時間有限，通常為幾周或幾個月，要求采用快速方法進行修復。根據廢棄化工場地的適應性不同，國內采用的技術主要包括安全填埋、焚燒制磚、固化、淋洗、穩定化等。而生物修復目前主要用于礦山和農田土壤修復，用于廢棄化工場地修復的案例很少見。因此亟待建立起生物修復與其他技術耦合的方法，實現更為安全、高效、綠色的適合廢棄化工場地的修復技術。清華大學李廣賀課題組[76]以植物二月蘭種植聯合Kocuriasp.P5降解菌劑，2014 年在武漢原農藥廠進行實驗，加速修復被有機氯農藥污染的土壤。

3.3 廢棄生物質降解與資源化

秸稈類廢物的有效處置和資源化利用對于我國農業發展和環境保護具有重要意義。利用微生物的產酶降解特性和生物降解過程，在最優條件下對作物秸稈進行發酵降解，進而實現資源化利用是秸稈就地轉化的關鍵。清華大學盧滇楠等[47,50,77]構建了多種高效微生物降解菌劑，2016 年在安徽蚌埠完成了面積達10畝（1畝=666.7m2）的玉米秸稈還田試驗，耕地的玉米增產了50～60kg/畝；2019 年在山東山亭進行了4400 畝大田實驗，加菌腐熟后馬鈴薯莖葉直接還田后，顯著改善了土壤的理化性質，已納入當地農業企業的常規農業操作中。

4 污染土壤生物修復技術研究和應用展望

盡管我國近年來在污染土壤生物修復基礎研究、技術開發和場地實驗方面取得了長足進步，但從全面推進土壤生物修復技術應用的角度，還存在如下問題需要研究和突破。

（1）綜合運用微生物基因組學和代謝組學技術，全面揭示土壤中微生物降解污染物的微生物反應網絡，為生物刺激和生物強化提供指導和幫助，從而加快污染物降解，同時為污染土壤修復的評估提供科學依據。

（2）發展高效降解微生物篩選和復合菌劑構建技術。土壤是由固相、液相、氣相組成的多相復雜體系，土壤中污染物往往也具有多樣性，需要不同的降解微生物共同發揮作用。采用常規的液相富集法很難篩出高效混合菌劑，土壤環流篩選技術提供了一種高效途徑，在此技術上結合菌種誘變有望進一步提高降解菌劑效能。

（3）生物修復過程集成與強化。不同地域土壤地質不同，土壤使用歷程對其結構也具有重要的影響作用，在實際修復過程中，需考慮土壤地質結構、使用歷程和污染過程特性，因地制宜，將生物修復技術和化學及物理修復技術集成應用，以提高工程修復效率，降低成本。

（4）隨著我國現代農業產業發展，對于農業作物產量和品質的要求不斷提高，結合當前雙碳目標要求，特別需要加強廢棄農業生物質的就地轉化，促進耕地土壤保育，為高品質農業發展保駕護航。