ABR產酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥富集PHAs產生菌

汪晨祥，秦永麗，蔣永榮，葛仕佳，鄭國權，孫振舉

（1 桂林電子科技大學生命與環境科學學院，廣西 桂林 541004；2 西湖大學工學院，浙江 杭州 310030）

傳統塑料具有耐化學性和熱穩定性，在日常生活和工業中得到廣泛應用。然而，傳統塑料難以生物降解，造成一系列環境污染問題。因此尋找在物理化學性能上與傳統塑料相似并能生物降解的新型材料成為研究熱點[1-2]。聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHAs）是一類生物合成的高分子聚酯的統稱，PHAs 不僅擁有與聚乙烯、聚丙烯等石油化工產品相似的熱塑性與力學性能，而且具有生物可降解性、生物相容性等特征[3]，是一種可代替傳統塑料的理想材料[4]。

目前，利用純菌發酵生產PHAs 的原料成本較高，使其工業化應用中受到限制[5-6]。與此同時，硫酸鹽有機廢水是亟待解決的環境污染源之一[7]。該類廢水厭氧處理過程中產生大量中間產物——小分子的混合有機酸，如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和乳酸等[8]，是PHAs產生菌合成PHAs的良好原料[9]。王愛杰等[10]的研究表明，產酸作用和硫酸鹽還原作用可以同時進行，且具有顯著優越性。近年來，本文作者課題組利用五隔室厭氧折流板反應器（anaerobic baffled reactor，ABR）處理硫酸鹽有機廢水（以蔗糖為碳源）進行了大量研究[8,11-12]。前期研究表明，在ABR 第1、第2 隔室，產酸菌（acid producing bacteria，APB）將蔗糖降解為丁酸、丙酸、乳酸和乙酸等揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs），而硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）則利用其中的某些VFAs（如乳酸、丙酸、丁酸等）還原硫酸鹽的同時產生大量的乙酸，以作為第4、第5 隔室產甲烷菌的優良底物。上述第1、第2隔室稱為產酸-硫酸鹽還原相，第4、第5隔室為產甲烷相。值得注意的是，硫酸鹽有機廢水中的COD/SO42-比值會直接影響產酸-硫酸鹽還原相微生物代謝，改變該相中VFAs 的組分和含量[13]，從而影響PHAs 產生菌的富集和PHAs 的形成[14]。目前尚未見不同COD/SO42-比值條件下產酸-硫酸鹽還原相PHAs產生菌富集的相關研究。

本研究在ABR 處理硫酸鹽有機廢水成功啟動并形成生物相分離特性的基礎上，繼續運行該反應器，以第1、第2隔室產酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥為研究對象，考察了進水COD/SO42-比值對顆粒污泥中PHAs產生菌合成PHAs的影響，并分析產酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥中PHAs的合成機理。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

采用的五隔室ABR總容積為77L，有效容積為62L[15]。反應器分為5 個隔室，每一隔室由上、下流室組成，上、下流室體積比為3∶1。折流板底部邊緣通往上流室的折角為向上45°的導流板，便于將水送至上流室的中心，使泥水充分混合接觸，維持較高的顆粒污泥濃度。反應器每個上流室上部安裝了三相分離器，頂部設置導氣口。反應器通過蠕動泵控制進水流量，采用保溫回流管包裹反應器外壁控制反應器溫度（33℃±1℃）。

1.2 實驗方法

在開展本研究前已歷時157 天成功啟動ABR，此時進水COD 濃度為4000mg/L，進水SO42-濃度為250mg/L，COD/SO42-比值為16.0，水力停留時間（hydraulic retention time，HRT）為24h，對COD 和SO42-的平均去除率穩定在95%以上，出水VFAs 濃度低于200mg/L，顆粒污泥性能良好。此時反應器已形成良好的生物相分離特性，其中第1、第2 隔室為產酸-硫酸鹽還原相。本研究在此成功啟動的ABR基礎上繼續運行，保持COD濃度和HRT不變，通過逐漸提高進水SO42-濃度調節進水COD/SO42-比值，以考察COD/SO42-比值對產酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥中PHAs產生菌富集的影響。反應器的運行控制按照進水SO42-濃度不同分為3個階段：第1階段（158～215天）進水SO42-濃度為320mg/L，COD/SO42-比值為12.5；第2 階段（216～261 天）進水SO42-濃度升高為430mg/L，COD/SO42-比值為9.3；第3 階段（262～342 天） 進 水SO42-濃 度 升 高 為1000mg/L，COD/SO42-比值為4.0。每個階段的運行達到穩定狀態后即進入下一運行階段。

1.3 分析項目及測定方法

1.3.1 常規指標及電鏡分析

常規指標及測試方法根據《水和廢水監測分析方法（第四版）》[16]以及《廢水的厭氧生物處理》[17]：COD，重鉻酸鉀法；SO42-，重量法；VFAs含量與組分，氣相色譜法[18]；顆粒污泥中PHAs 含量，氣相色譜法[19]；PHAs 產生菌形態，透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）[20]

1.3.2 熒光原位雜交

顆粒污泥經固定、包埋、冷凍切片、裝片脫水后進行原位雜交，雜交后洗脫，在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。使用探針為：①EUB338 （5′-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′）[21]用于檢測真細菌；②PHACGNF（5′-CCYRGATCAACAAGTTCTAC-3′）[22]

用于檢測Ⅰ型和Ⅱ型PHAs聚合酶；③BmphaC015F（5′-CGTGCAAGAGTGGGAAAAAT-3′）[22]用于檢測Ⅳ型PHAs 聚合酶，使用熒光素AMCA（藍）對EUB338標記，熒光素Texas Red（紅）對PHACGNF和BmphaC015F 標記。探針由上海生工合成制備（熒光染料接在5′端）。

2 結果與分析

2.1 反應器產酸-硫酸鹽還原相的處理效能

2.1.1 不同COD/SO42-比值下COD和SO42-去除情況

隨著進水SO42-濃度逐步提高，進水COD/SO42-比值由12.5 逐漸降低為9.3 和4.0，考察COD/SO42-比值的變化對反應器運行的影響。反應器第1、第2隔室的COD和SO42-平均去除率如圖1所示。由圖可知，隨進水COD/SO42-比值的降低，第1 隔室COD 及SO42-的平均去除率有逐漸降低的趨勢，進水COD/SO42-比值為12.5、9.3 和4.0 時，第1 隔室COD 的平均去除率分別為25%、24%、20%[圖1(a)]，第1 隔室SO42-的平均去除率分別為91%、86%、67%[圖1(b)]；而第2隔室的COD及SO42-的平均去除率明顯低于第1 隔室，隨進水COD/SO42-比值的降低，第2 隔室COD 平均去除率變化不大，分別為6%、6%、5%[圖1(a)]，第2 隔室SO42-的平均去除率分別為6%、10%、22%，有逐漸升高趨勢[圖1(b)]。綜上可見，隨著進水COD/SO42-比值不斷降低，第1 隔室的COD 和SO42-的平均去除率均逐漸降低，第2 隔室COD 的平均去除率相對穩定但SO42-的平均去除率不斷上升，這種現象表明在反應器產酸-硫酸鹽還原相中COD和SO42-的去除呈現沿程后移的現象。同時，第1、第2隔室總的COD 和SO42-的平均去除率均有降低的趨勢，進水COD/SO42-比值為12.5、9.3和4.0時，總的COD平均去除率分別為31%、30%和26%，總的SO42-平均去除率分別是97%、96%和89%。王愛杰等[10]以糖蜜廢水為碳源運行產酸脫硫反應器，在COD/SO42-比值為5.0、3.0、4.2、2.0時，COD的平均去除率在28%～33%，SO42-的平均去除率在81%～92%，其結果與本研究相似。

圖1 不同進水COD/SO42-比值下COD和SO42-平均去除率

2.1.2 不同COD/SO42-比值下VFAs濃度及組分變化

不同進水COD/SO42-比值下反應器產酸-硫酸鹽還原相中VFAs 濃度及組分變化情況見表1。由表可知，第1、第2隔室VFAs濃度隨著進水COD/SO42-比值降低不斷升高，當進水COD/SO42-比值為12.5、9.3和4.0時，第1隔室VFAs 濃度分別為1423mg/L、1631mg/L 和1848mg/L；第2 隔室VFAs 濃度分別為1289mg/L、1451mg/L和2065mg/L。

表1 不同COD/SO42-值VFAs濃度及占比

從整體看，不同COD/SO42-比值下第1和第2隔室中VFAs 組分均以乙酸和丁酸為主。與此同時，進水COD/SO42-比值的下降對乙酸、丁酸和丙酸等的占比產生了影響。當進水COD/SO42-比值由12.5降為9.3時，第1、第2隔室的VFAs組分變化不大，第1 隔室偶數碳VFAs 如乙酸和丁酸的占比分別為30%和50%左右，奇數碳VFAs 如丙酸和乳酸占比分別為15%和10%左右；第2隔室乙酸和丁酸的占比分別為70%和20%左右，丙酸占比為10%左右，乳酸未檢出。然而，當進水COD/SO42-比值降為4.0時，第1、第2隔室的VFAs組分發生較大變化，第1隔室乙酸和丁酸的占比分別為22%和54%左右，丙酸和乳酸占比分別為11%和13%左右；第2隔室乙酸和丁酸的占比分別為34%和45%，丙酸占比為9%，并且在第2 隔室檢測出乳酸，占比為12%。任南琪等[23]以糖蜜廢水作為有機碳源運行的產酸脫硫反應器中，酸性末端產物中乙酸始終占據主導地位，占50%～82%，這種代謝類型被稱為乙酸型代謝。在本研究中，隨著進水COD/SO42-比值的下降，第1 隔室的代謝類型始終為丁酸型代謝；當進水COD/SO42-比值為12.5 和9.3 時，第2 隔室的代謝類型為乙酸型代謝，當比值降為4.0 時，第2 隔室逐漸轉為丁酸型代謝。

2.2 不同COD/SO42-比值條件下PHAs的積累

在不同進水COD/SO42-比值條件下，產酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥中PHAs所占細胞干重的含量變化如圖2 所示。由圖可知，進水COD/SO42-比值為12.5時，第1、第2隔室顆粒污泥中PHAs質量分數分別為38%和19%；當進水COD/SO42-比值降為9.3時，第1、第2隔室顆粒污泥中的PHAs質量分數分別為27%和35%，由此可見第1 隔室的PHAs 含量在減少，第2隔室的PHAs含量則在增加且含量超過第1隔室；當進水COD/SO42-比值降為4.0時，第1、第2 隔室顆粒污泥中的PHAs 質量分數分別降為15%和29%。王娜等[4]利用序批式反應器以剩余污泥水解液為底物合成PHAs，反應器中PHAs 最高質量分數接近13%。Tamang等[24]以廚余廢棄油脂為底物富集PHAs 產生菌合成PHAs，最高質量分數為38%。由此可見，利用硫酸鹽有機廢水厭氧處理的產酸-硫酸鹽還原相合成PHA具有一定潛力。

圖2 不同進水COD/SO42-比值顆粒污泥中的PHAs含量變化情況

綜上可知，隨著進水COD/SO42-比值逐漸降低，第1 隔室顆粒污泥中PHAs 的含量逐漸降低，第2隔室顆粒污泥中PHAs的含量先上升后下降，顆粒污泥PHAs 的高含量隔室由第1 隔室后移至第2 隔室。由前期研究可知，進水COD/SO42-比值的變化會影響ABR 的代謝相和系統穩定性，隨著COD/SO42-比值降低，反應器產酸、硫酸鹽還原、產甲烷相后移[12]，這與2.1節中第1、第2隔室的COD、SO42-去除變化和VFAs 濃度變化相符。此外，隨著進水COD/SO42-比值逐漸降低，第2 隔室VFAs 中偶數碳VFAs（乙酸和丁酸）占比先升高后降低，其中乙酸占比同樣先上升后降低，而奇數碳VFAs（丙酸和乳酸）占比先降低后升高（表1），有研究表明大多數天然PHAs產生菌先利用偶數碳VFAs（乙酸和丁酸），其次是奇數碳VFAs（丙酸、乳酸）[25-26]，同時乙酸馴化的活性污泥比用丙酸、丁酸馴化的活性污泥能更有效地貯存PHAs[27-28]，Jia 等[29]的研究也發現在含有3種VFAs為碳源的系統中，PHAs產生菌對VFAs的利用率為：乙酸＞丁酸＞丙酸。綜上可知，在產酸-硫酸鹽還原中，通過調控進水COD/SO42-比值，進而調節VFAs 的組分是富集PHAs 產生菌合成PHAs的關鍵。

2.3 顆粒污泥中PHAs及其產生菌形態分析

為了更清楚地了解污泥內部的微生物形態，對第215 天（COD/SO42-比 值 為12.5）、第261 天（COD/SO42-比值為9.3）、第342 天（COD/SO42-比值為4.0）時第1、第2 隔室的顆粒污泥進行TEM 觀察，如圖3～圖5 所示。由圖可見PHAs 產生菌的形態及菌體細胞內大量聚集的顆粒狀PHAs，該顆粒狀PHAs 與Nygaard 等[30]研究觀察結果相似。進水COD/SO42-比值為12.5 時，觀察到第1 隔室的PHAs產生菌細胞內存在大量顆粒狀PHAs，第2 隔室中部分細胞內存在少量的顆粒狀PHAs（圖3）；當進水COD/SO42-比值為9.3 時，第1 隔室中存在顆粒結構的細胞數量減少，第2 隔室PHAs 產生菌個體明顯變大，并且出現多種形態的細胞，細胞體內顆粒狀結構顯著增多（圖4）；在進水COD/SO42-比值降為4.0 時，兩個隔室顆粒污泥中微生物形態變小，僅有少量細胞內可以觀察到PHAs顆粒結構（圖5）。這與第1、第2隔室顆粒污泥中PHAs的含量變化相一致，見圖2。同時，對第261天第1、第2隔室的顆粒污泥進行了FISH分析，結果如圖6所示。由圖可知，該階段PHAs產生菌在顆粒污泥中廣泛分布。有研究表明，PHAs 產生菌能在顆粒污泥的各個位置生長[31]，與本研究FISH觀察到的現象相符。

圖3 進水COD/SO42-比值為12.5時顆粒污泥TEM圖

圖4 進水COD/SO42-比值為9.3時顆粒污泥TEM圖

圖5 進水COD/SO42-比值為4.0時顆粒污泥TEM圖

圖6 進水COD/SO42-比值為9.3時顆粒污泥FISH圖

結合2.1 節、2.2 節可知，進水COD/SO42-比值的改變影響了VFAs 組分，進而對PHAs 產生菌的數量、個體形態和顆粒狀PHAs 的積累有一定影響。由表1 可知，當進水COD/SO42-比值由12.5 降至9.3，第1、第2隔室的乙酸濃度均有所上升，此時兩個隔室內PHAs產生菌數量顯著增多，個體形態明顯變大；然而隨著進水COD/SO42-比值降為4.0，第1、第2隔室中乙酸的濃度及占比較COD/SO42-比值為9.3 時有所降低，此時PHAs 產生菌形態變小，積累的顆粒結構也變少，因為一般來說相比于碳鏈較長的脂肪酸如丙酸、丁酸，鏈長較短的乙酸更有利于微生物的生長[32]。并且隨著進水SO42-濃度逐漸升高，反應器內由硫酸鹽還原產生的硫化物含量不斷增加，對微生物產生一定毒性作用，同時SRB具有一定硫酸鹽和硫化物的耐受性，可以正常生長繁殖[33]。分析認為，在產酸-硫酸鹽還原相中，保持進水COD/SO42-比值在合適的范圍，有助于PHAs 產生菌生長繁殖與PHAs 的積累；且PHAs 產生菌個體大、顆粒狀PHAs 聚集多的污泥PHAs 含量也高。

2.4 產酸-硫酸鹽還原相PHAs合成途徑分析

由液相VFAs 組分及固相顆粒污泥微生物中PHAs 積累狀況推測，產酸-硫酸鹽還原相中存在如圖7 所示的生物鏈式協同代謝模式。由圖7 可知，硫酸鹽有機廢水中的蔗糖主要被水解菌和APB轉化為三碳以上VFAs（乳酸、丙酸、丁酸等），這些三碳以上VFAs 可以被脂肪酸型SRB（fatty-acid utilized-SRB，FSRB）利用轉化為乙酸的同時還原硫酸鹽，而乙酸進一步被乙酸型SRB（acetic-acid utilized-SRB，ASRB）利用還原硫酸鹽生成二氧化碳。其中APB、FSRB 和ASRB 均可利用各階段產生的VFAs 合成PHAs，本文作者課題組[8]前期高通量測序的結果也佐證了這一點，16S rRNA高通量測序結果表明，在COD/SO42-比值為6.9時，ABR第1、第2隔室的優勢菌為APB與SRB，如窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）為APB，有研究表明其具有合成PHA的能力[34]；Widdel等[35]首次在SRB中觀察到PHAs的積累，Hai等[36]發現多種SRB如脫硫球菌屬（Desulfococcus）、脫硫桿菌屬（Desulfobacterium）等具有利用VFAs 合成PHAs 的能力。綜上，在產酸-硫酸鹽還原相中，存在APB-FSRB-ASRB 生物鏈式協同代謝模式，其中APB、FSRB 和ASRB 可利用VFAs各組分合成PHAs并貯存于菌體內。

圖7 產酸-硫酸鹽還原相中PHAs合成途徑

3 結論

（1）在ABR產酸-硫酸鹽還原相中，進水COD/SO42-比值會影響COD 與SO42-的去除、VFAs 的濃度和組成以及反應器的代謝類型。隨著進水COD/SO42-比值由12.5 降低至4.0，COD 與SO42-的去除沿程后移；反應器第1隔室保持丁酸型代謝類型，第2隔室由乙酸型代謝轉為丁酸型代謝類型。

（2）通過調控進水COD/SO42-比值，進而改變液相中VFAs 的組分，是產酸-硫酸鹽還原相中富集PHAs產生菌和提高PHAs 產量的關鍵。隨著COD/SO42-比值降低，顆粒污泥PHAs含量由第1隔室高于第2隔室轉變為第2 隔室明顯高于第1 隔室，其中COD/SO42-比值9.3 時，產酸-硫酸鹽還原相顆粒污泥PHAs 合成效果最好。TEM 和FISH 觀察結果表明，顆粒污泥中PHAs 含量較高時，PHAs 產生菌大量富集，細胞體內顆粒狀PHAs數量較多。

（3）在ABR反應器產酸-硫酸鹽還原相中，存在APB-FSRB-ASRB的生物鏈式協同代謝模式，同時APB、FSRB 和ASRB 利用多種VFAs 合成并積累PHAs于菌體內。