UPLC-MS/MS法同時測定蛋白飲料和液體調味品中36種防腐劑

魏宇濤,溫泉,唐維英,黃璐瑤,余曉琴,杜鋼,李澍才*,李航*

1(四川省食品檢驗研究院,四川 成都,611731)2(國家市場監管重點實驗室(白酒監管技術),四川 成都,611731) 3(四川省藥品檢驗研究院,四川 成都,611731)

隨著人們生活水平的不斷提高,消費者對食品品質有了更高的要求,越來越關注食品中防腐劑的使用,尤其是一些宣稱“綠色”、“零添加”或者“純天然”等食品更是深得廣大消費者喜愛[1]。防腐劑作為食品生產加工過程中常用的添加劑,其廣泛用于食品、藥品、生物標本等方面[2-5],但是一些不法生產者為謀取利益非法濫用和虛假宣傳,對人體健康構成潛在危害[6]。

蛋白飲料、液體調味品是人們日常生活中不可或缺的食品,其由于含有大量的蛋白質、水體基質,更容易滋生細菌引起腐敗變質。在GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中列入可使用的防腐劑大約有30多種,而日常監督抽檢中的項目不到10種。目前針對防腐劑的高通量檢測技術研究,主要集中在藥品方面[7-10]。而食品中相關研究較少且研究都是針對單一化合物或者多類添加劑,其檢測的化合物和涉及的食品基質有限[6,11-15]。目前現有國家標準和方法針對防腐劑檢測都存在目標化合物單一,前處理方法復雜等問題[11],缺乏能夠同時檢測多種防腐劑的技術方法,也沒有將不允許在食品中使用的多種防腐劑納入檢測范圍,尤其在監管此類“零添加”產品時,檢測能力明顯不足。因此急需建立一套防腐劑的高通量篩查技術,以解決此類產品的檢測痛點問題,本文應用超高效液相色譜-串聯質譜建立了能夠同時檢測蛋白飲料和液體調味品中36種防腐劑的方法,該方法靈敏、快速、準確度高且是現有文獻報道中能同時檢測最多種類防腐劑的方法,對加強食品中防腐劑的監測監管力度具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀、Agilent 6495三重四極桿質譜儀,美國Agilent公司;X3R高速離心機,美國Thermo Fisher Scientific公司;IRMsci超聲儀,德國IRM Technology GmbH公司;IKA MS3渦旋混合器,德國IKA公司。

甲酸、乙腈、甲醇、乙酸銨(均為色譜純),美國Thermo Fisher Scientific公司;氨水、磷酸、NaCl(均為色譜純),成都科隆化學品有限公司;實驗用水為Milli-Q超純水。

實驗樣品:醋、醬油、蛋白飲料、其他液體調味品[醬汁、料酒、調味汁(料)],市售或網購。

1.2 標準溶液

1.2.1 標準品

混合標準品1:苯甲酸、山梨酸、納他霉素、脫氫乙酸、鄰苯基苯酚混合標準儲備液,質量濃度均為1 000 μg/mL,北京曼哈格生物科技有限公司。

混合標準品2:肉桂酸、4-氯-3,5-二甲基苯酚(對氯間二甲酚)混合標準儲備液,質量濃度均為1 000 μg/mL,天津阿爾塔科技有限公司。

混合標準品3:4-羥基苯甲酸、三氯卡班、4-氯-3-甲基苯酚(對氯間甲酚)、芐氯酚、溴氯芬、4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯、4-羥基苯甲酸丙酯、4-羥基苯甲酸丁酯、4-羥基苯甲酸異丙酯、4-羥基苯甲酸異丁酯、2,4-二氯苯氧乙酸、苯氧乙酸、三氯生、水楊酸、2-溴-2-硝基-1,3丙二醇(布羅波爾)、甲基異噻唑啉酮、甲基氯異噻唑啉酮、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、氯咪巴唑、芐索氯銨、十四烷基二甲基芐基氯化銨、十六烷基二甲基芐基氯化銨、4-羥基苯甲酸戊酯、十二烷基二甲基芐基氯化銨、4-羥基苯甲酸苯酯、4-羥基苯甲酸芐酯、噻苯咪唑、月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽混合標準儲備液,質量濃度均為100 μg/mL,北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2.2 標準溶液配制

標準溶液的配制:根據各防腐劑的質譜響應不同,配制各分析物不同濃度的混合標準溶液。分別準確吸取混合標準品1溶液0.025 mL、混合標準品2溶液0.01 mL以及混合標準品3溶液0.05 mL,置于同一10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻后,作為混合標準工作溶液中間液。

1.3 樣品分析檢測

1.3.1 樣品前處理

稱取1 g混合均勻的樣品(精確至0.001 g),置于50 mL離心管中(醋類樣品先用體積分數為10%氨水調節pH至中性,與其他基質pH保持一致,防止pH變化使化合物保留時間發生變化)加入5 mL飽和NaCl溶液(用磷酸調節pH=3),渦旋混勻1 min使樣品在飽和NaCl水溶液中充分分散,再準確加入20 mL乙腈-甲醇(9∶1,體積比)(含體積分數為0.2%甲酸)渦旋混勻5 min,超聲提取15 min,置于高速離心機中9 000 r/min離心5 min,取上層有機相過0.22 μm濾膜,濾液用于液相色譜-串聯質譜儀分析。

1.3.2 色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×3.0 mm,1.8 μm);柱溫35 ℃:進樣量5 μL;流動相A為5 mmol/L乙酸銨,B為甲醇。流速0.3 mL/min;流動相梯度洗脫程序見表1。

1.3.3 質譜條件

離子源:電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI);掃描方式:正、負離子掃描;檢測方式動態多反應監測(dynamic multiple reaction monitoring,DMRM);毛細管電壓3.0 kV;干燥氣溫度250 ℃;干燥氣流量11 L/min;霧化氣壓力45 psi;鞘氣溫度300 ℃;鞘氣流量11 L/min。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution procedure ofmobile phase

2 結果與分析

2.1 實驗條件的考察

2.1.1 儀器方法的建立和優化

實驗中考察了ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μm)、ACE EXCEL C18柱(75 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Hypersil GOLDC18柱(100 mm×3.0 mm,1.9 μm)和Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×3.0 mm,1.8 μm)4種不同品牌色譜柱對36種防腐劑的分離情況,結合化合物峰形、分離度以及系統壓力,最終選擇Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×3.0 mm,1.8 μm)。同時比較了甲醇-乙酸銨、甲醇-甲酸銨和乙腈-乙酸銨3種流動相體系對36種防腐劑的影響,結果表明甲醇-乙酸銨作為流動相時,系統壓力較乙腈更低,目標分析物分離度和峰形相對較好,同時進一步優化了乙酸銨的濃度,最終選擇甲醇-5 mmol/L乙酸銨作為流動相。選擇采用ESI+和ESI-模式對36種防腐劑進行了一級質譜全掃描和子離子掃描分析,篩選出36種目標分析物的碎片離子。由于碎片離子較多,傳統的多反應掃描模式可能會使目標分析物碎片離子的色譜峰采集點不夠,影響峰形和質譜響應。采用DMRM能利用保留時間和保留時間窗口2個參數,可以實現對目標分析物進行精確掃描,保證定性定量的準確性。36種防腐劑總離子流圖見圖1。

圖1 36種防腐劑的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of 36 preservatives

2.1.2 基質效應(matrix effect, ME)考察

由于36種防腐劑化合物性質差異較大,大多為酸性化合物,還有兩性化合物和弱堿性化合物,且基質之間性質也差異較大,本研究采用斜率法考察了化合物的ME,即ME=基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率。若ME=1,則表示不存在基質效應;ME>1,為增強效應;ME<1為抑制效應。由表2可知,不同樣品基質中一些化合物的ME不一致,為了兼顧多種防腐劑同時檢測,因此實驗中采用基質標準曲線以抵消基質干擾、保證結果的準確性。

表2 不同樣品基質中36種目標分析物的基質效應Table 2 The matrix effect of 36 compounds in different sample matrices

續表2

2.1.3 提取條件的優化

研究中考察了不同提取溶劑、混合比例、不同甲酸濃度對目標化合物提取效率的影響,采用甲醇或者乙腈作為提取溶劑時,甲基異噻唑啉酮、苯甲酸、噻苯咪唑峰形較差,由于乙腈具有沉淀蛋白的作用,而低比例乙腈會影響甲基異噻唑啉酮峰形,故綜合考慮采用乙腈-甲醇(9∶1,體積比)作為提取溶劑,進一步考察了不同甲酸濃度對提取效果的影響,結果如圖2所示,考慮到提取效果、色譜柱耐受性和化合物峰形,最終采用0.2%(體積分數)甲酸。

圖2 甲酸濃度對目標分析物的影響Fig.2 Effect of the formic acid concentrations on compounds

2.1.4 凈化方式的考察

由于液體調味品中基質較復雜且一些基質含鹽量很高,會影響目標化合物的離子化效率以及質譜檢測的靈敏度,實驗中采用空白基質加標回收率方式考察EMR小柱(Agilent,Captiva EMR-Lipid,600 mg,6 mL)、PRiME HLB小柱(Waters Oasis PRiME HLB,200 mg,6 mL)、QuEChERS(乙二胺-N-丙基硅烷+C18+硫酸鎂+碳黑,Agela和Sepax)、飽和NaCl溶液(pH=3)4種凈化方式,結果如圖3所示,實驗表明飽和NaCl溶液整體效果最好,且前處理方便快速。飽和NaCl溶液在高有機相環境中具有鹽析的作用,使基質中的鹽和一些蛋白質等雜質留在水相中,起到分層凈化的作用。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍與定量限

分別稱取3份不同基質的空白樣品,按照前處理方法得到空白基質溶液。配制36種目標化合物質量濃度為1～250 ng/mL的系列混合基質標準溶液進行測定,以目標組分的峰面積y對相應的質量濃度x(ng/mL)繪制標準曲線,其相關系數R2均大于0.999。以信噪比(S/N)≥10作為方法的定量限,其線性方程和定量限見表3。

2.2.2 方法回收率與精密度

在蛋白飲料、醬油和醋的空白樣品中分別添加低、中、高3個濃度的目標分析物,每個添加水平重復測定6次,計算平均加標回收率和精密度,結果見表4。目標分析物的回收率為75%～119%;相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)為0.90%～9.8%。

圖3 凈化方式對目標分析物的影響Fig.3 Effect of the purification methods on compounds

表3 36種目標分析物的質譜參數、線性關系和定量限Table 3 MS/MS parameters,linear relationships,and limits of quantification of 36 compounds

續表3

表4 36種目標分析物的加標回收率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of 36 compounds(n=6)

2.3 實際樣品測定

采用本文建立的方法,對從市場購買的50批樣品(醋10批、醬油10批、蛋白飲料20批、其他液體調味品10批)進行檢測,其中1批蛋白飲料和1批醋分別檢出肉桂酸(0.000 17、0.001 3 g/kg),2批蛋白飲料、2批醋和2批醬油中分別檢出4-羥基苯甲酸(0.000 009、0.000 18、0.005 2、0.002 3、0.003 0、0.002 7 g/kg);2批醋和1批液體調味品分別檢出4-羥基苯甲酸乙酯,1批液體調味品中檢出脫氫乙酸,8批醬油、6批醋和9批其他液體調味品分別檢出苯甲酸和山梨酸;其余樣品中未檢出相關防腐劑化合物。

3 結論

本實驗建立的蛋白飲料、液體調味品中36種防腐劑的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法,尤其覆蓋一些新型和不常見防腐劑的高通量定性定量檢測方法。前處理方法采用提取和凈化相結合的方式,能有效減少基質干擾,建立的檢測方法靈敏、快速,準確度高,操作簡便、檢測成本較低,可極大提高多種防腐劑的定性定量檢測效率,對監測食品中防腐劑使用情況具有重要的意義。