LncRNA DSCAM-AS1調節miR-150-5p/BRAF軸對甲狀腺癌細胞惡性生物學行為的影響

彭云 溫美玲 呂云霞 陳萬志 何春 俞建平 丁振羅

1贛州市人民醫院甲狀腺外科（江西贛州 341000）；2南昌大學第二附屬醫院甲狀腺外科（南昌 330000）

甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）是內分泌系統常見的惡性腫瘤，近年來其發病率和死亡率均呈上升趨勢［1-2］。目前手術、放射性核素和內分泌治療，雖然顯著提高患者生存率，但仍有部分患者會復發并發生遠處轉移［3］。此外，TC 發生和發展的機制尚未完全闡明，因此，深入研究TC 發生發展的分子機制可能有助于發現潛在的治療靶點，對改善患者生存具有重要意義。lncRNA 對多種癌癥的生物學進程具有調控作用［4］。研究發現，DSCAM-AS1 在肝細胞癌［5］、子宮內膜癌［6］和骨肉瘤組織和細胞［7］中異常高表達，并能促進這些癌癥的發生發展。經生物信息學分析顯示，LncRNA DSCAM-AS1、BRAF 與miR-150-5p 存在靶向關系，miR-150-5p 在多數腫瘤中發揮抑癌基因作用。研究［8］顯示，miR-150-5p 通過靶向調控EZH2 表達，抑制細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導凋亡，減弱TC的進展。BRAF 參與TC 的發展，其基因突變與TC患者的甲狀腺外浸潤、淋巴結轉移和TNM 分期、復發轉移等密切相關［9］。推測LncRNA DSCAM-AS1可能通過調節miR-150-5p/BRAF 軸影響TC 的發生發展。因此，本研究在體內體外驗證LncRNA DSCAM-AS1 對TC 發生發展的影響，以期為TC 的靶向治療提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 人正常甲狀腺上皮細胞TEC 及人TC 細胞系SW579、TPC-1、BCPAP 購于美國ATCC。6 周齡SPF 級BALB/c 裸鼠購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK（豫）2022-0001，體質量15 ～ 20 g。

1.2 主要試劑與儀器 MTT 試劑盒購于江蘇麥格公司；RNA 提取、反轉錄、EdU apollo 488 in vitro 試劑盒購于北京Solarbio；qRT-PCR 試劑盒購于江西艾博公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（RG029S）上海碧云天生物技術有限公司；兔源一抗vimentin、E-cadherin、BRAF、Ki67、GAPDH 及HRP 標記的羊抗兔二抗購于美國Abcam 公司；多功能酶標儀（LD-96A）山東萊恩德智能科技有限公司；實時熒光定量PCR 儀（CFX96 Touch）上海艾研生物科技有限公司；光學顯微鏡（CX31）日本奧林巴斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞轉染及分組 將TEC、TPC-1、SW579、BCPAP 接種至DMEM 培養基進行傳代培養，培養48 h 后，檢測細胞DSCAM-AS1 表達水平。

取對數生長期的SW579 細胞，按照1.2 × 106個接種于6 孔板中，使用轉染試劑盒進行轉染，根據質粒將細胞分為si-NC 組、si-DSCAM-AS1 組、si-DSCAM-AS1+NC inhibitor 組、si-DSCAM-AS1+miR-150-5p inhibitor 組、miR-NC 組、miR-150-5p mimics組、miR-150-5p mimics+pcDNA 組、miR-150-5p mim?ics+BRAF 組，轉染48 h 后檢驗轉染效率并進行后續實驗。

1.3.2 DSCAM?AS1 在SW579 細胞定位檢測 使用細胞核/胞漿分離試劑盒分離細胞質與細胞核，收集大約5 × 106個SW579 細胞，500×g離心5 min，取細胞沉淀，加入預冷的PBS洗滌2次、離心棄上清、在細胞沉淀加入預冷的提取液，冰上靜置30 min、1 200 ×g離心5 min，上清為胞漿組分、沉淀為細胞核組分。qRT-PCR 法檢測DSCAM-AS1 表達。

1.3.3 FISH 與pull down 實驗 SW579 細胞經組織固定液固定15 min、脫水后，加入10 μL 雜交緩沖液與1 μL 的Cy3 標記的DSCAM-AS1 熒光探針，46 ℃恒溫箱，雜交1.5 h，DAPI 溶液復染細胞核15 min，PBS 清洗、晾干后，共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

將生物素化的miR-150-5p-wt/mut探針與SW579細胞裂解物4 ℃下孵育過夜，以生物素標記的無意義RNA 序列作為陰性對照（NC），加入裂解液提取RNA，qRT-PCR 檢測相對RNA 富集。

1.3.4 雙熒光素酶活性檢測 分別構建含有DSCAM-AS1 與BRAF 野生型（wt）、突變型（mut）表達載體，將突變位點克隆至PmirGLO 載體，將DSCAM-AS1-wt、DSCAM-AS1-mut、BRAF-wt、BRAFmut 分別與miR-NC、miR-150-5p mimics 共轉染SW579 細胞48 h，熒光素酶報告分析系統檢測相對熒光素酶活性。

1.3.5 DSCAM?AS1、miR?150?5p 表達檢測 采用qRT-PCR 法檢測DSCAM-AS1、miR-150-5p 表達水平，根據試劑盒說明書進行PCR 擴增，以GAPDH、U6 為內參，采用2-ΔΔCt方法計算DSCAM-AS1、miR-150-5p 相對表達。DSCAM-AS1 上游引物：5′-GT?GACAGCAAGACTCCCT-3′和下游引物5′-GATCC?GTCGTCCATCTGT-3′；miR-150-5p上游引物5′-ACT?GTCTCCCAACCCTTGTA-3′和下游引物5′-GTG?CAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH上游引物5′-GGAGC?GAGATCCCTCCAAAAT-3′和下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.6 細胞增殖檢測 各組轉染后的SW579 細胞接種于96 孔板中，每孔加入100 μL 的EdU 溶液，孵育2 h，PBS 洗滌，經固定通透后，加入100 μL的1×Apollo 染液反應，染色30 min，DAPI 復染細胞核，熒光顯微鏡下觀察并拍照，計算Edu 陽性細胞率。

另取轉染后的各組SW579 細胞按照800 ～1 000 個細胞接種于6 孔板中，連續培養14 d，固定后用0.5%結晶紫溶液染色觀察集落形成數。

1.3.7 細胞遷移與侵襲實驗 轉染后的SW579 細胞生長至對數期時，使用涂有Matrigel 基質膠的Transwell 小室進行侵襲實驗，遷移實驗未涂有Matrigel 基質膠，各組細胞取200 μL（2 × 105）細胞懸液加入上室，下室加入600 μL 含10% FBS 的DMEM 培養基，培養24 h，固定染色，顯微鏡下隨機選取5 個視野計算穿膜細胞數。

1.3.8 Western blot法BRAF、E?cadherin、vimentin蛋白檢測 BRAF、E?cadherin、vimentin 及GAPDH一抗稀釋液按照1∶1 500 稀釋，HRP 標記的二抗按照1∶1 000 稀釋，實驗結束后，以GAPDH 為內參，采用Image J 軟件分析各蛋白表達。

1.3.9 體內腫瘤形成實驗 6 周齡BALB/c 裸鼠適應性飼養1 周后，隨機分為si-DSCAM-AS1 組、si-NC 組，每組8 只，通過皮下注射200 μL（5 × 106）si-DSCAM-AS1 或si-NC 轉染的SW579 細胞，每周測量移植瘤體積，28 d 后，處死小鼠分離腫瘤，測量腫瘤質量與體積，qRT-PCR 檢測移植瘤組織中LncRNA DSCAM-AS1、miR-150-5p 表達，免疫組化法檢測移植瘤組織BRAF、Ki-67 蛋白表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料以（±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK?q檢驗。P< 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DSCAM?AS1 在細胞中的表達 與TEC 細胞比較，DSCAM-AS1 在SW579、TPC-1、BCPAP 表達水平顯著升高（F= 123.50，P< 0.05），且DSCAM-AS1在SW579 細胞中表達水平最高，選擇SW579 細胞進行后續實驗，見圖1。

圖1 DSCAM-AS1 在細胞中的表達Fig.1 Expression of DSCAM-AS1 in cells

2.2 DSCAM?AS1靶向調控miR?150?5p表達 核/細胞質分離實驗與FISH 實驗表明，DSCAM-AS1主要分布在細胞質中（圖2A、B）。經starBase 在線分析顯示，DSCAM-AS1 與miR-150-5p 有結合位點（圖2C），下拉實驗證明，生物素標記的miR-150-5p-wt 比NC 及miR-150-5p-mut 探針捕獲更多的DSCAM-AS1（圖2D）。雙熒光素酶實驗顯示，DSCAMAS-wt 與miR-150-5p mimics 共轉染SW579 細胞后，與miR-NC 比較，相對熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）（圖2E）。qRT-PCR 結果顯示，在SW579 細胞中抑制DSCAM-AS1 表達可顯著升高miR-150-5p 表達水平（F= 116.437，P< 0.05），而抑制miR-150-5p表達對DSCAM-AS1 表達無顯著影響（P> 0.05）（圖2F）。

圖2 DSCAM-AS1 靶向調控miR-150-5p 表達Fig.2 DSCAM-AS1 targeted regulation of miR-150-5p expression

2.3 DSCAM?AS1靶向調節miR?150?5p對SW579細胞惡性行為的影響 與si-NC組比較，si-DSCAMAS1 組SW579 細胞Edu 陽性率、集落形成數、遷移與侵襲細胞數及vimentin 蛋白表達水平顯著降低，E-cadherin 蛋白表達水平顯著升高，與si-DSCAMAS1+NC inhibitor 組比較，si-DSCAM-AS1+miR-150-5p inhibitor 組SW579 細胞Edu 陽性率、集落形成數、遷移與侵襲細胞數及vimentin 蛋白表達水平顯著升高，E-cadherin 蛋白表達水平顯著降低（F=171.543、39.669、59.968、41.767、169.227、158.783，P< 0.05）（圖3）。

圖3 DSCAM-AS1 靶向調節miR-150-5p 對SW579 細胞惡性行為的影響Fig.3 The effect of DSCAM-AS1 on the malignant behavior of SW579 cells by targeting miR-150-5p

2.4 miR?150?5p 與BRAF 靶向關系驗證 經star?Base 在線分析顯示，miR-150-5p 與BRAF 基因有靶向結合位點（圖4A）；下拉實驗證明，miR-150-5p 與BRAF 結合（圖4B）；雙熒光素酶實驗結果顯示，與BRAF-wt+miR-NC 共轉染比較，BRAF-wt+miR-150-5p mimics 共轉染SW579 細胞熒光素酶活性顯著降低（P< 0.05）（圖4C）。qRT-PCR 結果顯示，在SW579細胞中過表達miR-150-5p可顯著下調BRAF表達水平（t= 16.267，P< 0.05）（圖4D、E）。

圖4 miR-150-5p 與BRAF 靶向關系驗證Fig.4 Verification of the targeting relationship between miR-150-5p and BRAF

2.5 miR-150-5p 靶向調節BRAF 對SW579 細胞惡性行為的影響 與miR-NC 組比較，miR-150-5p mimics 組SW579 細胞Edu 陽性率、集落形成數、遷移與侵襲細胞數及vimentin 表達水平顯著降低，E-cadherin 表達水平顯著升高，與miR-150-5p mim?ics+pcDNA 組比較，miR-150-5p mimics+BRAF 組SW579 細胞Edu 陽性率、集落形成數、遷移與侵襲細胞及vimentin表達水平數顯著升高（P< 0.05），E-cadherin表達水平顯著降低（F= 176.776、58.926、32.248、39.609、122.911、182.620，P< 0.05），見圖5。

2.6 體內抑制LncRNA DSCAM?AS1 表達抑制TC 腫瘤生長 si-DSCAM-AS1 組小鼠移植瘤體積與重量顯著低于si-NC 組（t= 12.912，P< 0.05）；si-DSCAM-AS1 移植瘤中LncRNA DSCAM-AS1 表達水平顯著降低，miR-150-5p 表達水平顯著升高（t= 17.379、12.211，P< 0.05）；si-DSCAM-AS1 組移植瘤中，BRAF、Ki-67 陽性率顯著降低（t=14.933、20.252，P< 0.05），見圖6。

圖6 LncRNA DSCAM-AS1 對裸鼠移植瘤生長的影響Fig.6 Effect of LncRNA DSCAM-AS1 on the growth of transplanted tumor in nude mice

3 討論

TC 的發生機制復雜，涉及遺傳、環境和表觀遺傳改變等因素［10］。盡管在檢測和治療技術方面取得了進步，但仍有部分TC 患者會出現腫瘤轉移和復發，這凸顯了開發更有效療法的重要性［11］。

據多項報道［12-13］顯示，LncRNAs 的異常表達可導致TC 的調節異常，與腫瘤的惡性進展有關，如LncRNA NORAD、LncRNA XIST 在TC 組織和細胞中異常高表達，通過調控miR-451、miR-34a/MET/PI3K/AKT調節TC細胞增殖和腫瘤生長。研究［5-7，14］發現，LncRNA DSCAM-AS1 在肝細胞癌、子宮內膜癌、骨肉瘤和結腸癌等多種腫瘤中發揮致癌功能，抑制LncRNA DSCAM-AS1 表達可顯著抑制腫瘤細胞增殖、遷移與侵襲。本研究發現，LncRNA DSCAM-AS1 在TC 組織和SW579、TPC-1、BCPAP 細胞中高表達，抑制LncRNA DSCAM-AS1 表達可顯著抑制TC 細胞增殖、遷移、侵襲及EMT，表明LncRNA DSCAM-AS1 在TC 中發揮癌基因的作用。

LncRNA 可作為競爭性內源RNA 或miRNA"海綿"來調節腫瘤中關鍵基因，從而發揮腫瘤抑制或腫瘤促進功能［15］。本研究顯示，LncRNA DSCAMAS1 主要分布在細胞質中，表明LncRNA DSCAMAS1 在TC 細胞中發揮CeRNA 的作用。此外生物信息學分析、pull down 及雙熒光素酶報告實驗證實miR-150-5p 可與LncRNA DSCAM-AS1 靶向結合。miR-150-5p 被證明是一種腫瘤抑制因子，miR-150-5p 過表達抑制結直腸癌［16］、非小細胞肺癌［17］細胞的增殖、遷移、侵襲和腫瘤生長。在TC中，miR-150-5p 作為LncRNA-MIAT 的下游分子，發揮抑癌基因的作用［8］。本研究顯示，過表達miR-150-5p 可抑制TC 細胞增殖、遷移、侵襲及EMT，LncRNA DSCAM-AS1 負向調控miR-150-5p 表達，促進TC 的惡性生物學行為。

miRNA 通過與靶mRNA 內的互補序列進行堿基配對，在基因表達的轉錄后調控中發揮作用［18］。本研究發現BRAF 是miR-150-5p 的靶點基因，miR-150-5p 可靶向調節BRAF 表達影響SW579 細胞的增殖、遷移及侵襲。BRAF 在包括TC 在內的多種腫瘤中發揮促癌作用，BRAF 是MAPK 信號通路的一部分，在BRAF 基因第15 中外顯子的突變（BRAFV600），造成MAPK 通路持續活化，從而導致參與細胞增殖的基因轉錄，促進腫瘤發生、細胞增殖和轉移［19-21］。BRAFV600E突變與TC 復發及相關死亡率顯著相關，沉默BRAF 基因表達顯著抑制體外和體內的癌細胞侵襲和腫瘤生長［22-23］。然而，BRAF 如何影響TC 進展的分子機制尚未完全闡明［24］。

本研究證實，miR-150-5p 與BRAF 存在靶向關系，且在SW579 細胞過表達miR-150-5p 可顯著降低BRAF 表達水平，而過表達BRAF 可逆轉過表達miR-150-5p 對SW579 細胞增殖、遷移、侵襲及EMT的抑制作用。體內實驗結果表明，抑制LncRNA DSCAM-AS1 表達可顯著抑制移植瘤生長及BRAF表達，促進miR-150-5p表達。LncRNA DSCAM-AS1/miR-150-5p/BRAF 軸可能成為治療TC 的一種新的靶點。

綜上所述，LncRNA DSCAM-AS1 在TC 細胞中上調表達，抑制LncRNA DSCAM-AS1 表達可通過調節miR-150-5p/BRAF 信號軸，抑制TC 惡性進展。

【Author contributions】PENG Yun performed the experiments and wrote the article.WEN Meiling，YU Jianping and DING Zhenluo per?formed the experiments.LV Yunxia and CHEN Wanzhi revised the article.HE Chun designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.