品質源于設計：基于藥效物質的中藥品質調控
——海軍軍醫大學、上海中醫藥大學陳萬生教授團隊中藥品質調控研究思路與實踐總結

陳萬生教授團隊主要研究方向為基于藥效物質的中藥品質調控，針對高活性中藥藥效物質資源開發所面臨的“生物合成途徑不明”、“代謝調控效率低”兩個關鍵問題，創建了基于“基因-代謝物”關聯譜的中藥有效成分生源途徑高效解析技術，依托完整、快速、多樣化的中藥功能基因鑒定系統，多角度表征次生代謝調控網絡；同時通過開展基于真實世界證據的中藥質量標志物發現、基于結構基因的靶向調控和基于轉錄因子的全局調控成功提高了活性天然產物含量，為利用次生代謝工程調控中藥品質提供了成功范例。

一、創新學術思想的提出——基于藥效物質的中藥品質調控

中藥資源是中醫藥全產業鏈可持續健康發展的物質載體和戰略基石。中藥藥效物質不僅是中醫藥發揮臨床療效的基礎，更是現代創新藥物開發的源泉。中藥品質優劣追根溯源基于其有效成分。中藥所含有的獨特有效成分的類別及組成是其發揮確切臨床療效的物質基礎，也是中藥品質的物質內涵。中藥材質量低下或者不穩定常常導致臨床治療難以持續有效，“方靈藥不靈”帶來嚴重信任危機。藥材提質增效是中藥實現現代化和國際化的關鍵環節。“十四五”規劃綱要將“強化中藥質量監管，促進中藥質量提升”納入中醫藥傳承創新，使之成為國家戰略。

藥效物質的有無（真偽）多寡（優劣）是評價藥材質量的主要內容和制定質量標準的基本依據，其積累水平是遺傳背景和環境因素共同作用的結果。長期以來，中藥藥效物質基本依賴從藥用植物中直接提取分離，由于野生資源日益短缺，大宗藥材人工種植成為了主要解決途徑。當前藥材基地主要依據藥用植物的農藝性狀來制定人工種植技術體系，栽培品的種質選用與遺傳育種尚處于農藝性狀層面，基本沒有關注藥效物質的動態積累過程，受制于生源途徑認識的局限，對影響有效成分生物合成、積累的關鍵遺傳物質知之甚少，種植技術無法與藥材功效關聯，種子種苗大多依賴于野生種源。眾所周知，“野生”變“家種”不是簡單的移栽，藥用植物生長的生態環境發生了巨大改變，不可避免會導致種子種苗性狀發生改變，藥材品質會發生改變或退化，是當前亟需解決的產業發展重大技術難題。闡明有效成分生源途徑，是實現“品效關聯”的種質資源創制、異源獲取和建立中藥材生產全過程質量保證體系需要解決的核心關鍵科學問題，是提升藥材品質、確保中藥安全有效的前提和基礎。

鑒于此，團隊提出“基于藥效物質的中藥品質調控”的研究思路（圖1），通過闡明中藥活性物質天然形成機制，發現其物質內涵形成靶標，利用代謝工程調控藥效物質生物合成，實現中藥質量提升。以功能基因挖掘為起點，以生物合成途徑解析和調控為重點，以新品種培育和代謝途徑重構為落腳點，建立了基于藥效物質形成機制解析的中藥品質調控工程技術體系，并成功將其應用于培育高品質的中藥材創新種質，積極推廣科學栽培新技術，幫助建設規范化人工種植基地，為建立中藥材生產全過程質量保證體系和中藥資源可持續利用提供了全新策略。

二、研究方法策略及實踐總結

1、建立中藥活性天然產物生源途徑解析技術體系

中藥次生代謝物生源途徑由“代謝流、催化酶、調控網絡”三要素組成。對生源途徑認識的缺乏已經成為開展代謝調控，實現品質提升的最大障礙，嚴重制約了該領域的發展，亟需技術創新。團隊在充分考慮合成產物的化學多樣性，代謝網絡的復雜性和基因功能的特異性，構建了“多組學驅動的天然活性產物合成關鍵酶系的挖掘及機理解析”技術體系：①采用波譜色譜聯用技術實現化合物在線高效識別和定量分析，建立了普遍適用于多種中藥次生代謝物生源途徑由“代謝流、催化酶、調控網絡”三要素組成。對生源途徑認識的缺乏已經成為開展代謝調控、實現品質提升的最大障礙，亟需技術創新。團隊在充分考慮合成產物的化學多樣性、代謝網絡的復雜性和基因功能的特異性，構建了“多組學驅動的天然活性產物合成關鍵酶系的挖掘及機理解析”技術體系：①采用穩態同位素失蹤、波譜色譜聯用等技術實現化合物在線高效識別和定量分析，建立了普遍適用于多種結構類型代謝產物的高效快速檢測平臺，準確表征代謝流化學輪廓（J.Plant Biol.2016;ACS Chem Biol.2013）；②高通量測序快速獲得中藥基因組、轉錄組和代謝組數據，執行基因組組裝注釋和代謝物指認（PLoS ONE.2015;BMC Gemomics.2014, 2013）；③結合文獻和代謝流中化合物時空關系推導生源（Gene.2016;Biotechnol Appl Biochem.2017）；④開展功能基因組學研究，克隆鑒定途徑基因和調控基因（Plant Physiol Bioch.2020, 2018;Front Plant Sci.2019; 2018）；⑤基于酶動力學和結構生物學挖掘催化酶活性位點，為理性、精準改造生源途徑提供理論依據及候選靶點（Front Plant Sci.2021;Sci Rep.2016）；⑥采用比較基因組學技術發掘基因組中蘊藏的基因簇、調節位點共享等重要信息準確預測基因功能，有效解決缺失基因問題（Phytochemistry.2018;Chin J Nat Med.2016）（圖2）。該技術體系以高質量組學數據庫為依托，以目標產物化學結構特征和關鍵限速酶催化模式為基礎，以在活性位點環境中進行分子組裝為核心，組合優化多種測序組裝注釋方案，聯合使用功能元件挖掘和高通量功能驗證等干濕結合方案，提高基因功能注釋和代謝網絡重構的質量和效率，完整解析合成途徑及其調控機理。該方法注重從源頭上挖掘具有自主知識產權的基因元件，普遍適用于中藥基因發現及功能研究。

圖2 基于整合組學大數據快速挖掘鑒定關鍵基因及代謝途徑解析技術體系

（1）構建活性天然產物代謝途徑的基因調控網絡

高等植物次生代謝過程受到眾多基因的調控，這些基因又相互作用形成了一個復雜網絡。既往研究發現，中藥活性成分的積累具有組織器官特異性，如青蒿素特異性積累于腺毛、丹酚酸和丹參酮積累于根、西紅花苷積累于花柱、直鐵線蓮寧B 積累于根等。因此，團隊提出，中藥材的品質調控應與藥效物質積累、組織器官發育進行關聯，中藥材生產要兼顧質量和產量，即開展代謝工程需要平衡代謝特質與農藝性狀，這對調控網絡的解析提出了更高的要求。團隊借鑒模式植物研究策略，基于同一代謝通路下的基因共表達這一原理，針對轉錄組/代謝組數據采用WGCNA分析每個基因的表達模式，將不同基因劃入各自所在的表達模式網絡中進行共表達分析；結合啟動子序列分析，預測目標調控網絡中的關鍵轉錄因子和目標轉錄因子的下游調控基因；基于網絡中已知功能基因推測同網絡中其他功能未知基因功能；在建立高質量組學數據庫的基礎上通過生化和遺傳學手段分析基因敲除突變體表型，明確基因的生物學功能及調控模式；尋找并鑒定互作蛋白，闡明轉錄因子自身調控機制及其生物學意義，構建基因調控網絡（圖3）， 實現了生物信息學、分子生物學和化學生物學的交叉融合。

圖3 構建活性成分生物合成基因調控網絡及研究實踐

首次關聯青蒿素合成與腺毛發育繪制“發育-代謝”互作網絡：分泌型腺毛是黃花蒿重要的次生代謝物合成和儲藏器官。腺毛發育和青蒿素合成受到由轉錄因子構成的復雜精細網絡所調控。前人研究多集中在青蒿素生物合成途徑中的轉錄因子，因此發現腺毛發育調控因子并創建完整分子網絡圖譜是此方向上的新進展。基于組學數據及共表達網絡分析，獲得了在分泌型腺毛中表達的 R2R3MYB（New Phytologist.2019）和AP2/ERF（Mol Plant.2015）轉錄因子AaTAR1/2。過表達植株葉片的分泌型腺毛密度和青蒿素含量均顯著提高，抑制植株中則顯著降低，表明 TAR1/2正調控黃花蒿分泌型腺毛發育。通過RNA-Seq與ChIP-Seq分析，全面解析了TAR1/2 下游調控網絡，篩選鑒定到調控腺毛發育的關鍵轉錄因子MYB23、青蒿素合成關鍵轉錄因子WRKY 和bHLH、催化酶HMGR、DXS、CYP71AV1、DBR2、ADS、CYP71AV1 等多個互作蛋白。此外，TAR2 還可以正調控PAL、C4H、CHS、F3H、DFR 等黃酮途徑基因，促進黃酮合成。該研究以黃花蒿為起點，揭示分泌型腺毛發育起始的分子機理，解析了TAR1/2在腺毛發育和青蒿素合成等生物學過程中的核心調控作用，并以此構建了整合腺毛發育和儲藏物代謝的基因調控網絡，為認識其它植物多細胞腺毛奠定了基礎，更為基于“發育-代謝”互作網絡開發腺毛細胞工廠提供了理論支撐。

建立苯丙素代謝網絡響應植物激素的綜合框架：作為一種重要的植物激素，茉莉酸（Jasmonate，JA）信號調控了植物生長和防御過程之間的資源分配，通過上調次生代謝水平應對病蟲侵害或其他逆境脅迫。植物如何通過茉莉酸信號通路精確調控基因表達及蛋白修飾等過程感知外界刺激，目前仍不清楚。團隊比較了茉莉酸誘導下5 個菘藍發根株系不同處理時期的轉錄組和代謝譜，通過共表達網絡分析從差異表達的71 個基因及246 個轉錄因子中進一步獲得57個與木脂素代謝基因高度相關的轉錄因子，預測到168對具有調控關系的基因對。實驗驗證4 對調控基因對關系；繼而整合代謝組數據提出了JA 擾動的重編程促進木脂素代謝的調控機制（Plant Biotechnol J.2016）；JA 處理丹參發根后，RNA-seq 確認大多數直接由MYC2 靶向的丹酚酸合成基因上調轉錄，進一步結合實驗表明SmMYC2a/b共同調控CMK，CPS，TPS，PAL，RAS6 和CYP98A14 促進酚酸合成（Sci Rep.2016;Biotechnol Appl Biochem.2017）。上述研究深入描述了轉錄調控網絡從響應JA 發生重排到實際映射于代謝表型的生理過程和規律，表明JA信號傳導和苯丙素途徑之間存在多個串擾點，證明了JA響應過程中轉錄交叉調節對于植物感知和代謝正確反應的重要性。

（2）化學與生物學相融合高效發掘苯丙素途徑關鍵催化酶編碼基因

通過對中藥材源植物基因組和轉錄組的分析發現，催化酶往往以多基因家族形式存在。 基于序列同源性預測功能相似性策略篩選候選基因存在鑒定工作量大，突變體可能無表型的問題。團隊成員在組學數據注釋和元件挖掘基礎上，覆蓋“器官-組織-亞細胞”水平，關聯原位轉錄組/原位代謝組進一步縮小候選基因范圍，進而采用經典的生化遺傳方法驗證基因功能、表達模式、催化特征、催化機理，快速發現真正行使催化功能的限速酶，創建次生代謝具有物種特異性的個性化標簽，為后續調控提供精準靶標。

明確了菘藍木脂素途徑多基因家族成員的催化功能和表達特征：借鑒模式植物研究策略解析菘藍和丹參基因組/轉錄組/代謝組數據，基于種間基因功能同源性的比較共表達分析和“基因-代謝物”關聯譜，高效發掘苯丙素途徑催化酶并開展基因克隆、表達及功能研究。結合生化遺傳證據首次明確了IiPLR1 是PLRs 基因家族中唯一可以連續催化松脂醇先后生成落葉松脂素和開環異落葉松脂素的關鍵酶（Nat Commun.2021），DIR（Acta Pharm Sin B.2023）和4CL3（J Exp.Bot.2015）在木脂素合成網絡中起主效作用，為開展基于落葉松脂素生物合成的菘藍品質改良及合成生物學研究提供了明確的遺傳操作靶標。

首次提出并證明了“漆酶負責催化迷迭香酸生成丹酚酸B”這一假說：針對丹酚酸生物合成途徑最后存在的“黑盒”，根據化學結構反應類型預測，并通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術和前體飼喂實驗證實了迷迭香酸合酶（Phytochemistry.2018）和漆酶（Front Plant Sci.2021）的功能。首次完整解析了丹參酚酸類成分的生源途徑和合成特征，準確指出了中藥材源植物與模式植物中同類化合物合成方式上的差異(ACS Chem.Biol.2013）。這是第一個由中國學者闡明的中藥有效成分生源途徑，丹參酚酸B也成為目前少數幾個生源途徑清晰的植物來源天然產物之一（圖4）。

圖4 苯丙素類成分（板藍根木脂素和丹參酚酸）生源途徑解析

2、成功創建以提高目標化合物含量為目標的次生代謝調控平臺

有效成分生源途徑的成功解析，為開展代謝調控打下了堅實的基礎。團隊針對野生植株中活性目標產物含量低的關鍵問題“因材施法”，開發了基于“激活-阻斷-重構（Boost-Block-Build）”的多種代謝工程策略，包括：關鍵酶過表達突破速率限制步驟、阻斷代謝旁路、構建代謝捷徑、基于結構生物學的蛋白質工程、操縱轉錄因子和信號傳導通路全局調控（圖5），獲得丹參酚酸B、落葉松脂素和青蒿素穩定高產株系，轉基因黃花蒿已進入中間實驗安全評價階段，為活性天然產物的定向調控和定量合成提供了成功范例。

圖5 以提高目標化合物含量為目標的次生代謝調控平臺

（1）實現代謝途徑的靶向調控

激活二萜代謝途徑創制高抗高涵黃花蒿：二萜類化合物是黃花蒿抗逆物質基礎，具有結構和功能的多樣性。基于轉錄組和基因組以及利用生化、遺傳方法對黃花蒿二萜生物合成途徑進行了全面解析，揭示了class II 和class I二萜合酶普遍存在單純依賴于蛋白結構特征，而非催化功能的相互作用；通過構建不同的二萜代謝高表達植株，控制代謝流方向，發現二萜類物質賦予黃花蒿顯著的抗微生物脅迫活性。首次明確了活性赤霉素GA4 和GA1，而不是GA3 對分泌性腺毛的正調控作用，終結了過去近20 年關于赤霉素是否調控黃花蒿分泌型腺毛的爭論。結合二萜合酶的雙重功能，成功構建了同時提高分泌型腺毛密度和青蒿素含量以及高抗生物脅迫的黃花蒿優良株系，完美緩解了產量和抗性之間存在trade off效應這一困擾農業生產的難題（New Phytologist.2021）。

（2）基于“信號分子-轉錄因子-結構基因”互作網絡的整體調控

操縱WRKY 轉錄因子創制高產高抗高涵菘藍：團隊前期利用秋水仙素誘導染色體加倍獲得了產量高、抗性增強、木脂素積累量高的同源四倍體菘藍，但其優良性狀的遺傳機制不清楚。通過基因芯片篩選出四倍體菘藍中表達明顯高于二倍體的轉錄因子WRKY34，猜測其可能作為控制數量性狀的主要因素。分析過表達和RNAi毛狀根表明WRKY34 能顯著提高根生物量、耐鹽性、抗旱性及落葉松脂素含量。比較轉錄組和代謝組數據發現過表達WRKY34能全面擾動碳、淀粉和蔗糖代謝，引導代謝流從初生代謝向次生代謝流動，對苯丙素生物合成具有深遠影響。轉基因株系中落葉松脂素含量與對照相比提高了8.3 倍，而生物量無顯著變化。WRKY34 與木脂素途徑關鍵催化酶4CL3相互作用，同時與壓力耐受調節因子NAC29相互作用，該基因的調控有利于提高菘藍產量、耐脅迫性和木脂素積累（Acta Pharm Sin B.2020）。首次提供了“轉錄因子調控初生/次生代謝臨界轉化”的功能性證據，揭示了四倍體和二倍體菘藍品差異顯著的遺傳機制，為開展以WRKY34為遺傳靶標的分子育種，培育抗病毒活性好、高產高抗的優質菘藍品系提供了理論支撐。

激活分泌型腺毛發育調控網絡促進青蒿素合成：黃花蒿分泌型腺毛的正常發育直接關系到青蒿素的合成、分泌、儲存及積累。通過代謝工程手段提高青蒿素產量、降低生產成本有重大意義，也是當前國際研究熱點。團隊成員以茉莉酸信號途徑為切入點，從青蒿素合成代謝轉錄調控和分泌型腺毛發育調控兩方面同時開展研究。轉基因黃花蒿植株分析發現，過量表達AP2/ERF 型轉因子TAR1，一方面促進了分泌型腺毛的起始，增加了葉片表面單位面積的腺毛密度，同時也激活了青蒿素生物合成途徑關鍵酶基因ADS、CYP71AV1 和DBR2 的表達，顯著提高了青蒿素及其前體化合物青蒿酸和二氫青蒿酸含量；相反，通過RNAi干擾TAR1 表達后腺毛發育和青蒿素合成則受到顯著抑制（Sci Bull.2016）。該研究顯示了以TAR1為核心的“發育-代謝”互作網絡兼具改良黃花蒿抗性和提升青蒿素含量的巨大潛力，該策略為進一步探索利用植物腺毛細胞工廠培育優質、高產黃花蒿品系開辟了新途徑。

基于信號通路和代謝通路cross-talk 提高青蒿素含量：次生代謝產物（有效成分）的產生是宿主對抗脅迫的重要手段，茉莉酸及其衍生物（JAs）作為信號分子能夠促進與植物防御機制有關特異性物質的合成。受這一植物科學領域前沿熱點啟發，團隊提出了一種新型的全局調控策略：通過對途徑A（其產物對未知途徑B 具有顯著生物學效應）的簡單遺傳改造實現對途徑B（復雜或者未知代謝途徑）的代謝調控。通過對多種不同遺傳背景黃花蒿表型鑒定發現，水楊酸（SA）均顯著提高青蒿素含量，而對產量無顯著負面影響。機理研究揭示SA信號途徑AaNPR1 和AaTGA6 互作促進AaTGA6 正調控AaERF1 的表達，進而轉錄激活青蒿素合成途徑（J Exp.Bot.2019）。支持了“改造JAs介導的信號轉導通路能夠全面提高目標產物合成途徑多個限速酶基因表達，促進相關代謝物積累”的假說，為非模式中藥源植物開展代謝調控創立了新的范例。

3、開發基于質量標志物的中藥材良種培育和科學栽培新技術

中藥材栽培本身受環境的影響較大，表現為嚴格的地域性、明顯的季節性、技術的多變性等特點。在明確中藥材品質內涵的基礎上，團隊立足于中藥材自然栽培過程中生境、種質以及管控措施間的內在關系，反向追溯自然生境中藥用植物活性成分合成的誘發、啟動和效應機制，并對藥用植物生境因子數據、表型數據以及內在響應基因、成分合成進行關聯和整合分析，獲取了關鍵生境下具有品質識別功能的標識性基因（Q-Marker）。在中藥不同發育時期、不同組織器官、不同栽培管控環節等栽培遷移生境中，從質量傳遞與溯源、成分特有性、成分有效性、成分可測性、成分可控性等方面對Q-Marker 的可靠性和穩定性進行充分評測和驗證，進而建基于質量標志物的中藥材現代農業生產模式。這為特定中藥精益栽培技術的遴選提供了參考，同時也為中藥育種親本資源的改良、個性化定制和加速育種流程提供了不可或缺的技術體系，保證了栽培管理過程的精確化與科學化，進而保障藥材質量穩定可控（圖6）。

圖6 基于質量標志物的中藥材良種培育和科學栽培技術推廣應用

（1）發掘鑒定10個丹參和菘藍品質相關質量標志物

通過開展田間種植試驗，構建“基因-化合物-表型”組織特異性、發育階段特異性等時空特征大樣本數據庫并開展關聯分析，評估目標基因作為品質相關質量標志物的可能性和可信度。團隊已發掘和驗證了丹參HPPR、RAS、CYP98A14、MYC2a（發明專利： ZL201410606226.6；ZL201510445685.5）和菘藍WRKY34、PLR1、4CL3、AP2/ERF049、 CPK1、SDD1（發明專利：ZL201610502516.5；ZL201510054313.X）等一批具有品質識別功能（指示木脂素、丹酚酸 B等有效成分積累水平和植株器官發育水平）的中藥材品質關聯分子標記應用于中藥材生產。在“育苗”階段，基于表達水平開展分子輔助育種，挑選品質相關基因穩定高表達種質，淘汰先天不足者；在“移栽-種植-施肥-采收”等各環節，基于基因表達特征調整相應外在條件誘導Marker基因高表達，實現藥材生產全過程監控與干預；針對下游成藥制劑對于藥材需求的不同要求開展定向調控與分子輔助育種。以丹參為例，目前企業渴求的是“高產+高質量”的組合性狀（如高產+高丹酚酸B；高產+高總丹參酮）。由于主產區雨水偏多，根部腐爛在平原地區較為普遍。對積水的耐澇性是抗性選擇的一個方向。另外，丹參在主產區的品質退化問題對產業界也是一個困擾。山東丹參質量比5年前明顯下降，條形越來越細，醇浸出物合格率越來越低。依托具有種屬特異性的精準代謝工程策略和高效穩定基因編輯系統的開發，與上藥華宇藥材公司山東平邑丹參基地合作，成功創制高產高抗高內涵的理想丹參種苗（ZL201910870392.X），獲得水溶性酚酸類成分含量高、脂溶性丹參酮類成分含量高和外觀品相好的三類原藥材以分別滿足供應綠谷注射用丹參多酚酸鹽、青春寶丹參注射液和雷允上等飲片企業的不同要求，真正實現了藥材生產的“按需調控”。據此形成的中藥材“種苗選育、品質預判、科學栽培、快速揀選”技術體系具有特異性高、調控效果顯著、易于實施等優點。

（2）成功創制5個遺傳穩定的菘藍、丹參、黃花蒿優良株系

四倍體板藍根良種廣泛應用于黑龍江大慶等超25 萬畝板藍根種植產區；基于Q-marker 的丹參分子輔助育種和育苗、栽培、采收全程管理關鍵技術在天士力陜西商洛種植基地和上藥華宇藥材公司、上海綠谷制藥有限公司山東平邑丹參種植基地成功轉化落地；在科技部重大專項子課題“高產青蒿素的黃花蒿優良品系代謝工程育種研究”資助下，3個轉基因黃花蒿品系（TAR1、TAR2和SPL2）已經通過農業部轉基因生物安全評價初審和基地實地考察，正式進入中間實驗安全評價階段。以上成果的推廣充分體現了生物工程技術服務于傳統中藥材種植領域所創造的巨大經濟效益和社會效益。“基于藥效物質形成機制的中藥品質調控技術體系及應用”獲教育部科技進步一等獎。

4、創制高效生產天然產物的合成生物學平臺

中藥活性成分獲取面臨藥用植物栽培環境地域限制、藥材有效成分含量低、提取困難等現實問題。利用合成生物學方法異源重建并改造代謝途徑，構建微生物細胞工廠，發酵生產具有明確藥理活性的單體成分，是極具潛力的研究策略和創新型生產模式，在減少自然資源依賴、維護環境友好、實現大規模生產和發現高活性新化學分子實體等方面具有重大科學價值。而張磊教授率領團隊成員長期圍繞“中藥資源保障與質量提升”重大戰略需求，以創新中藥資源研發鏈為導向，選擇藥效作用明確、活性成分清楚、質量標準完善的藥用植物品種，開展以提高特定化合物含量為目標的優異種質創制和中藥活性成分合成生物學生產（圖7），以“重建輔因子生物合成、提升胞內/細胞器內輔因子水平、平衡輔因子穩態以及提高輔因子活性形式”等四類輔因子改造策略用以提升天然產物生物合成效率（iScience., 2020, 23: 100879），推動中藥材品質提升和資源高效可持續利用。

（1）構建高產苯丙素前體的酵母細胞工廠

目前許多復雜天然產物（如燈盞乙素、水飛薊賓、青蒿酸、香紫蘇醇、蒂巴因、莨菪堿等）已在實驗室實現微生物全合成。由于代謝途徑復雜和催化酶專一性差等原因，異源合成復雜苯丙素還存在諸多困難，需要以高效合成咖啡酸（CaA）和阿魏酸（FA）為前提。目前研究主要集中在酶工程和途徑優化上而忽略了輔因子的作用。團隊成員以釀酒酵母為底盤構建CaA/FA 生物合成途徑，對NADPH 循環、FADH2亞細胞器重定位和SAM 周轉速率進行調控，通過批式補料發酵，CA 和FA 的滴度分別達到5.7 g/L 和3.8 g/L，為后續經由長途徑異源合成復雜苯丙素類天然產物（如基于CaA的丹參酚酸，基于FA的直鐵線蓮寧B和鬼臼毒素等）提供了有力保障（Nat Chem.Biol,2022, 18: 520-529）。

（2）構建高產西紅花酸的酵母細胞工廠

西紅花花柱高度富集了西紅花酸及其糖苷衍生物西紅花苷、藏花醛等二萜類化合物，具有良好的抗氧化、抗炎、抗癌，抗抑郁等功效。因其自然資源稀缺且市場需求巨大，具有異源合成的迫切需求。關于西紅花苷合成的確切基因和柱頭特異性積累的潛在機制知之甚少。對西紅花不同發育階段的柱頭進行深入的轉錄組和動態代謝組學分析，預測并驗證了參與西紅花醛和西紅花苷合成基因，發現乙醛脫氫酶（CsALDH3）是關鍵限速酶。將西紅花基因組中成簇存在的II 型二萜合酶CPS1 和3 個I 型二萜合EKL1/2/3 與CsALDH3 共轉化釀酒酵母，西紅花酸產量得到顯著提升（J Exp.Bot., 2019, 70: 4819）。

三、成果業績

近20年以來，陳萬生教授團隊先后主持國家科技部重點研發計劃、國家自然科學基金重點項目、國家科技重大專項等國家級課題等80 余項基金課題的研究（表1）；在Nature Communications、Nature Chemical Biology、Acta Pharmaceutica Sinica B、Trends in Plant Science、Natural Product Reports、New Phytologist、Plant Biotechnology Journal、Journal of Integrative Plant Biology 等國際知名學術期刊發表SCI 收錄論文160 余篇（表2），他引10000 余次；獲國家發明專利授權55 項，申請國際專利1 項；獲4 個新藥臨床試驗批文；獲國家科技進步二等獎2 項、教育部科技進步一等獎1項。

表1 團隊2013年以來承擔的主要科研項目

團隊成功培育出板藍根（四倍體）優良品系，1996年獲批為國家科技部“國家科技成果重點推廣計劃”。經過二十多年技術引導、無償推廣，四倍體菘藍現已成為國內重要板藍根產區的主導品系，僅大慶種植產區栽培面積就達25萬畝，年產值超過6億元，占全國板藍根總產量80%以上。該品系成為亳州、荷花池等藥材市場銷售的板藍根藥材的主要來源。

與此同時，以四倍體板藍根優良品系的遺傳機制研究為理論基礎，形成了高效的科學栽培管理技術體系。遵循中藥品質形成的內涵機制，以決定其品質的關鍵基因為調控靶點，為藥材種植量身定制分子標記與生長干預措施。具有特異性高、調控效果顯著、易于施行等優點，在一定程度上實現了藥材種植的精準控制。板藍根種植相關技術廣泛應用于黑龍江大慶等全國各地多個板藍根種植產區，丹參栽培管理關鍵技術長期應用于上海綠谷制藥有限公司山東丹參種植基地。該成果的推廣在極大程度上解決了中藥材有效成分過低或含量不穩定，藥材差異品質大，產量不穩定等關鍵問題，充分體現了中藥品質調控創新驅動經濟發展的科學價值。

四、研究團隊和技術平臺

陳萬生教授團隊由15 名研究人員組成，其中教授2 名、研究員1 名、副教授4 名、副研究員3 人、講師3 名、助理研究員2人；團隊成員入選省部級以上人才計劃14人次，包括國家杰出青年科學基金獲得者2名、國家優秀青年科學基金獲得者1 名、教育部青年長江學者1 名、青年岐黃學者1 名、教育部新世紀優秀人才3 人、上海市優秀學科帶頭人3人、上海市曙光學者1名等（圖8）。

圖8 陳萬生教授團隊成員

團隊依托的海軍軍醫大學藥學院擁有生藥學國家重點學科、全軍特殊環境藥物研究重點實驗室、上海市中藥代謝產物研究重點實驗室、上海活性天然產物制備工程技術研究中心等技術平臺；同時，所依托的上海中醫藥大學中藥研究所擁有國家中醫藥管理局中藥新資源與品質評價重點研究室、國家藥品監督管理局中藥質量控制重點實驗室、中藥標準化教育部重點實驗室、上海市復方中藥重點實驗室以及“中藥品質評價與技術標準創新研究及其應用”教育部創新團隊等研究平臺，為團隊開展科學研究提供重要技術支撐（圖9）。團隊圍繞“基于藥效物質的中藥品質調控”這一方向成功建立了植物多組學聯合分析平臺，植物、大腸桿菌和釀酒酵母基因編輯平臺，蛋白質表達純化和功能鑒定平臺等。同時基于以上平臺成功開展了植物活性木脂素（丹參酚酸和菘藍直鐵線連寧B）和萜類（青蒿素和西紅花苷）等重要天然產物的合成途徑解析和代謝工程研究，在探索運用代謝工程技術提高中藥材源植物有效成分含量或異源合成天然產物等方面做了大量原創性工作，積累了豐富經驗。同時，團隊擁有完善的設備平臺，包括分子生物學實驗平臺（PCR 儀，qPCR 儀，核酸電泳儀，蛋白電泳儀，nanodrop 等）；代謝分析設備（LC-MS/MS，UHPLC-TOF/MS，GC-MS 和 MALDI FT-ICR MS 等）；蛋白質晶體制備平臺（4℃層析柜，高速離心機，FPLC，4℃及20℃晶體培養箱等）；微生物培養、改造和發酵平臺（控溫搖床，超凈工作臺和小型平行發酵罐等）。另外，團隊所在院系擁有600 兆核磁共振儀、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等現代大型儀器設備，以及植物氣候室和實驗大田等植物培養等必要條件，支持中藥品質影響因素的發現和中藥優異種質資源創制。

圖9 中藥資源技術平臺保障