異補(bǔ)骨脂素介導(dǎo)BMP2/Runx2/Osx信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的研究＊

張有為，黃 晨，黃廷銳，唐德志＊＊

（1.陜西省寶雞市中心醫(yī)院 寶雞 721008；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032）

雌激素缺乏是絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥（PMOP）的首要病因。對PMOP 的預(yù)防可采用雌激素替代療法，但長期服用雌激素可明顯增加患者發(fā)生癌癥的危險(xiǎn)性[1-2]。因此，尋找一種既有效又安全的雌激素類藥物是當(dāng)前本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。大量文獻(xiàn)報(bào)道，植物雌激素可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制骨吸收，誘導(dǎo)骨形成[3-6]。異補(bǔ)骨脂素屬于呋喃香豆素類化合物，為植物雌激素之一[7]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，異補(bǔ)骨脂素具有促進(jìn)骨代謝的作用，但其機(jī)制尚不清楚[8-9]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討異補(bǔ)骨脂素對成骨細(xì)胞增殖和分化的影響，并利用BMP2 體外條件性基因敲除技術(shù)從基因和蛋白的水平揭示其作用機(jī)理，為異補(bǔ)骨脂素用于臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供全面、可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

前成骨細(xì)胞株OCT1 細(xì)胞和BMP2loxp/loxp小鼠由美國羅切斯特大學(xué)骨科系陳棣教授饋贈(zèng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

異補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品由上海藥品檢疫局購買，純度達(dá)到95%以上；BMP2 純化蛋白由浙江華東基因技術(shù)研究所購買，純度超過90%。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

胎牛血清（PAA 公司），a-MEM 干粉培養(yǎng)基（CALBIOCHEM 公司），0.25%含EDTA 的胰蛋白酶（PAA 公司），青-鏈霉素（PAA 公司），G-418 抗體（CALBIOCHEM 公司），二甲基亞砜DMSO（SIGMA 公司），MTT（SIGMA 公司），TRIZOL（晶美生物），Quant Reverse Transcriptase 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIANGEN 公司），高質(zhì)純化DNA膠回收試劑盒（GENMEN公司），兔抗鼠Runx2 單克隆抗體，兔抗鼠Osx 單克隆抗體，兔抗鼠β-actin 單克隆抗體和羊抗兔HRP 多克隆抗體（Cell signaling 公司），Ad-GFP 和Ad-Cre 腺病毒（上海吉?jiǎng)P生物公司）等。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱（熱能公司），SW-CJ-2FD超凈工作臺（AIRTECH 公司），倒置相差顯微鏡（Olympus 公司），倒置相差顯微鏡（Olympus 公司），AF100 制冰機(jī)（SCOTMAN 公司），高速離心機(jī)（Eppendorf公司），MK-Ⅲ型酶標(biāo)儀（Dynex 公司），DU 800/VIS 紫外分光光度計(jì)（Beckonman 公司），Rotor Gene 3000 熒光PCR 儀（基因公司），Odyssey遠(yuǎn)紅外掃描儀（LI-COR公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)

取出裝有OCT1細(xì)胞的凍存管，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞活性復(fù)蘇，計(jì)數(shù)細(xì)胞，按1×105·mL-1的密度接種于無菌培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日更換1 次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3-4 天換1 次液。細(xì)胞培養(yǎng)液采用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青-鏈霉素和300 μg·mL-1的G-418抗體的a-MEM培養(yǎng)基。

1.2.2 分組方法

①正常對照組，普通培養(yǎng)液；②異補(bǔ)骨脂素低劑量組，濃度為10 μg·mL-1；③異補(bǔ)骨脂素中劑量組，濃度為30 μg·mL-1；④異補(bǔ)骨脂素高劑量組，濃度為60 μg·mL-1；⑤陽性對照組，BMP2純化蛋白50 ng·mL-1。

1.2.3 MTT法觀察細(xì)胞增殖情況

取經(jīng)常規(guī)胰蛋白酶消化后的傳代細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104·mL-1左右。將細(xì)胞移入一塊96孔培養(yǎng)板中，每孔200 mL，然后放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后，更換無血清培養(yǎng)液，使細(xì)胞生長同步化。于第2 天吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，按上述分組方法分別給藥，每組8個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL含藥無血清細(xì)胞培養(yǎng)液。之后，再放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板進(jìn)行MTT 法檢測。先往每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg·mL-1），放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，棄去上清液，每孔加入DMSO 180 μL，充分震搖混勻，使結(jié)晶完全溶解，立即上酶標(biāo)儀測定OD 值，波長為490 nm，以同時(shí)做的單純培養(yǎng)液為空白對照孔。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)

細(xì)胞加藥培養(yǎng)48 h 后取出，分別倒盡培養(yǎng)液，采用TRIzol法提取細(xì)胞總mRNA。提取后用紫外分光光度計(jì)選擇波長260 nm 和280 nm 檢測樣本OD 值（即光吸收值），以超純水作為空白對照調(diào)零，測得樣本A260/A280 比值在1.8-2.0，證明RNA 抽提成功，并用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測總RNA 的完整性。逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行進(jìn)行兩步法擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增儀中95℃ 10 min，再擴(kuò)增（95℃變性20 s，62℃退火5 s，72℃復(fù)性25 s）40 個(gè) 循環(huán)，72℃延 伸10 min。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線后，用Rotor Gene6.0 軟件自動(dòng)進(jìn)行絕對定量分析，以每一樣體所含目的基因的拷貝數(shù)和其β-actin 內(nèi)參基因的拷貝數(shù)的比值表示目的基因的表達(dá)量。其引物序列及參照物β-actin 引物序列由大連寶生物公司合成，引物序列見表1。

表1 Real time RT-PCR檢測所檢測的基因引物序列

1.2.5 Western blot檢測

細(xì)胞加藥培養(yǎng)48 h 后取出，分別倒盡培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，提取蛋白并定量。將每組蛋白溶液調(diào)整至相同濃度，經(jīng)煮沸變性后，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉封閉1 h，振蕩漂洗干凈后，分別加入兔抗鼠BMP2、Osx 和β-actin 單克隆一抗，4℃過夜。次日取出，振蕩漂洗干凈后，加入羊抗兔HRP 多克隆二抗，孵育1 h，振蕩漂洗干凈后，在Odessey 遠(yuǎn)紅外掃描儀上檢測蛋白條帶，保存圖像。

1.2.6 BMP2體外條件性敲除實(shí)驗(yàn)

從出生3 天的BMP2loxp/loxp小鼠中分離原代顱骨成骨細(xì)胞，然后以1×106個(gè)·mL-1的密度接種到六孔培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)。利用A d-GFP 或Ad-Cre（病毒滴度：4×108pfu·mL-1）感染2 天后，用或不用異補(bǔ)骨脂素（最佳濃度）分別干預(yù)48 h，部分細(xì)胞用來抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Real-time PCR 反應(yīng)檢測BMP2、Runx2 和Osterix（Osx）等基因表達(dá)，操作方法和步驟同前所述。部分細(xì)胞用10%福爾馬林固定，加入含0.5 mg·mL-1對硝基苯磷酸的AMP 緩沖液（0.5 mol·L-1甲基二戊烷，2-丙胺醇，2 mmol·L-1氯化鎂，pH=10.3）染色30 min，直到顏色變化以檢測堿性磷酸酶活性。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)數(shù)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。借助SPSS 11.0 軟件包，多樣本之間進(jìn)行One-Way ANOVA 分析，兩兩樣本之間進(jìn)行t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察，在給藥培養(yǎng)48 h 后，各組細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)與正常組相比均無明顯異常。見圖1。

圖1 大體觀察（×10）

2.2 MTT法檢測結(jié)果

在給藥培養(yǎng)48 h后（見表2），異補(bǔ)骨脂素能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，但以低劑量（10 μg·mL-1）組最明顯（P＜0.05），而中劑量（30 μg·mL-1）組和高劑量（60 μg·mL-1）組作用不明顯（P＞0.05）；陽性對照組BMP2 純化蛋白亦能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖（P＜0.05）。

表2 成骨細(xì)胞增殖情況

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果

結(jié)果顯示（見表3），異補(bǔ)骨脂素能促進(jìn)成骨細(xì)胞BMP2 mRNA 的表達(dá)，以低劑量組（10 μg·mL-1）最明顯（P＜0.05），中劑量組（30 μg·mL-1）次之（P＜0.05）；陽性對照組BMP2 純化蛋白亦可以顯著增加成骨細(xì)胞BMP2 mRNA 的表達(dá)（P＜0.05）。異補(bǔ)骨脂素低劑量（10 μg·mL-1）和 中 劑 量（30 μg·mL-1）能 明 顯 促 進(jìn)成骨細(xì)胞Runx2 mRNA 的表達(dá)（P＜0.05），而高劑量（60 μg·mL-1）組成骨細(xì)胞Runx2 mRNA 表達(dá)量比正常對照組偏低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽性對照組BMP2 純化蛋白亦可以顯著增加成骨細(xì)胞BMP2 mRNA 的表達(dá)（P＜0.05）。異補(bǔ)骨脂素低劑量組（10 μg·mL-1）和中劑量組（30 μg·mL-1）能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞Osx mRNA 的表達(dá)（P＜0.05），而高劑量（60 μg·mL-1）組成骨細(xì)胞Osx mRNA 表達(dá)量比正常對照組偏低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽性對照組BMP2純化蛋白亦可以顯著增加成骨細(xì)胞BMP2 mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。

2.4 Western blot檢測結(jié)果

結(jié)果顯示（見圖2），異補(bǔ)骨脂素低劑量（10 μg·mL-1）和中劑量（30 μg·mL-1）能增加成骨細(xì)胞中Runx2蛋白的表達(dá)，分別提高了2.18倍和1.25倍；陽性對照BMP2 純化蛋白也能增加成骨細(xì)胞中Runx2 蛋白的表達(dá)，提高了2.75倍。

圖2 各組Runx2、Osx蛋白表達(dá)量的比較

異 補(bǔ) 骨 脂 素 低 劑 量（10 μg·mL-1）、中 劑 量（30 μg·mL-1）和高劑量（60 μg·mL-1）均可提高Osx 蛋白的表達(dá)量，分別提高了2.03 倍、1.79 倍和1.88 倍；陽性對照BMP2 純化蛋白也能增加成骨細(xì)胞中Osx 蛋白的表達(dá)，提高了3.08倍。

2.5 BMP-2體外條件性敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步研究異補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的作用機(jī)理，從Bmp2loxp/loxp小鼠中分離培養(yǎng)顱蓋骨成骨細(xì)胞，用Ad-Cre 慢病毒體外將BMP2 基因敲除（Ad-GFP做為野生型對照）。Real-time PCR 反應(yīng)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)Ad-Cre 慢病毒干預(yù)后成骨細(xì)胞中BMP2 的表達(dá)顯著降低，BMP2 基因敲除效率達(dá)80%以上，說明BMP2基因敲除成功，如圖3所示。之后分別給予最佳濃度（10 μg·mL-1）的異補(bǔ)骨脂素干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異補(bǔ)骨脂素可明顯促進(jìn)Ad-GFP 處理的野生型對照組成骨細(xì)胞中Runx2（圖4）和Osx（圖5）基因的表達(dá)，分別提高了7.2倍和5.9倍。但這種作用在BMP2缺失的成骨細(xì)胞中部分消失，僅僅提高了4.6 倍和3.2 倍。通過堿性磷酸酶（ALP）染色，發(fā)現(xiàn)異補(bǔ)骨脂素可明顯促進(jìn)Ad-GFP 處理的野生型對照組成骨細(xì)胞中ALP 染色強(qiáng)表達(dá)，而這種作用在BMP2 缺失的成骨細(xì)胞中部分減弱（圖6）。上述結(jié)果均表明異補(bǔ)骨脂素促進(jìn)成骨細(xì)胞分化具有BMP2部分依賴性。

圖3 BMP2基因敲除效率

圖4 異補(bǔ)骨脂素促進(jìn)Runx2基因表達(dá)部分依賴于BMP2

圖5 異補(bǔ)骨脂素促進(jìn)Osx基因表達(dá)部分依賴于BMP2

圖6 異補(bǔ)骨脂素促進(jìn)ALP表達(dá)部分依賴于BMP2

3 討論

成骨細(xì)胞在骨代謝的體外研究中非常重要，為研究具有刺激骨形成藥物及作用機(jī)理提供重要的細(xì)胞模型。動(dòng)物成骨細(xì)胞一般來源于胎鼠或新生鼠的顱骨，這些細(xì)胞所處的分化時(shí)期不同，性質(zhì)不完全相同[10]。本實(shí)驗(yàn)中，選用的OCT1細(xì)胞株是從過表達(dá)骨鈣素轉(zhuǎn)基因小鼠的顱蓋骨中分離獲得的成骨細(xì)胞，生長旺盛、性質(zhì)穩(wěn)定，可以大量滿足實(shí)驗(yàn)研究的需要[11]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主骨生髓，一旦腎氣衰微，腎精不足，則會發(fā)生骨質(zhì)疏松，正如《素問·痿論》中所說“骨枯髓減，發(fā)為骨痿”。腎中精氣宜充不宜虧，治療骨質(zhì)疏松癥以補(bǔ)腎益精為主，代表方劑如腎氣丸、左歸丸、右歸丸等，藥物有仙靈脾、補(bǔ)骨脂、熟地、骨碎補(bǔ)、杜仲、枸杞、牛膝等[12-13]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，這些補(bǔ)腎方藥可以提高成骨細(xì)胞的增殖率、增加ALP 活性，因而促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成功能[14-17]。但對于這些補(bǔ)腎方藥中的具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的有效組分尚缺乏系統(tǒng)的研究。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂中的有效組分異補(bǔ)骨脂素能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，并以10 μg·mL-1濃度作用最強(qiáng)。

1965 年，Urist[18]發(fā)現(xiàn)在脫鈣的骨基質(zhì)中存在著一種特殊的蛋白質(zhì)，能誘導(dǎo)異位成骨，后來就被命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）。迄今為止發(fā)現(xiàn)了20 多種BMP，除BMP1 外，其他BMPs均屬于TGF-β 超家族成員，可通過旁分泌和自分泌的形式誘導(dǎo)骨、軟骨及與骨有關(guān)的結(jié)締組織的形成，還能誘導(dǎo)骨源和非骨源性細(xì)胞的成骨分化[19]。在成骨細(xì)胞中，BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對骨形成起至關(guān)重要的作用。BMP2被認(rèn)為是TGF-β超家族中活性最高且能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子，其高表達(dá)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[20-21]。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，異補(bǔ)骨脂素能促進(jìn)BMP2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)成骨，并以低劑量（10 μg·mL-1）及中劑量（30 μg·mL-1）作用較強(qiáng)，而高劑量（30 μg·mL-1）作用較弱。

Runx2屬于Runt結(jié)構(gòu)域基因家族成員，是與BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游分子Smad1 和Smad5 相互作用，從而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化[22-24]。在沒有BMP2 作用時(shí)，Runx2 單獨(dú)表達(dá)雖然能抑制成肌細(xì)胞分化，但不能上調(diào)骨鈣素的表達(dá)，而在BMP2 作用下，過表達(dá)Runx2 誘導(dǎo)產(chǎn)生的骨鈣素水平高于BMP-2 的單獨(dú)作用，說明BMP2 和Runx2 具有協(xié)同作用。以上結(jié)果均表明Runx2 在BMP-2 激活成骨的信號途徑中起了非常重要的作用[25-26]。Runx2 是成骨細(xì)胞分化所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可協(xié)同其下游的Osx 調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，從而影響成骨細(xì)胞分化[27-28]。通過本實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)異補(bǔ)骨脂素可以誘導(dǎo)Runx2 mRNA 和Osx mRNA 的高表達(dá)，并以低劑量（10 μg·mL-1）和中劑量（30 μg·mL-1）作用最強(qiáng)。

條件性基因敲除（Conditional gene knockout）是指為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法[29]。實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)。目前廣泛應(yīng)用方法就是利用Cre/LoxP 重組酶系統(tǒng)來研究小鼠特定組織器官或特定細(xì)胞中靶基因滅活所導(dǎo)致的表型。Cre 重組酶是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能識別并介導(dǎo)兩個(gè)LoxP 位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使LoxP 位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組[30]。如果將“LoxP Floxed”小鼠的細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒介導(dǎo)的Cre 重組酶，可產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式修飾的條件性敲除細(xì)胞，這是一種體外條件性基因敲除方法。在“LoxP Floxed”小鼠或細(xì)胞，正常情況下同野生型的一樣，只有遇到Cre 重組酶時(shí)才會導(dǎo)致靶基因的突變[31]。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證異補(bǔ)骨脂素通過介導(dǎo)BMP2 增加Runx2 和Osx 表達(dá)而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的作用機(jī)理，從BMP2loxp/loxp小鼠中分離培養(yǎng)顱蓋骨成骨細(xì)胞，用Ad-Cre 慢病毒體外將BMP2 基因敲除，然后給予低劑量（10 μg·mL-1）異補(bǔ)骨脂素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)異補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)的Runx2 和Osx 高表達(dá)呈BMP2 的依賴性。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次證明了異補(bǔ)骨脂素通過促進(jìn)BMP2/Runx2/Osx 信號通路的激活，從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。