大黃酸抑制線粒體分裂和EMT減緩乳腺癌細胞遷移＊

李小波，謝 艷，陳金霞，婁興鳳，苗春龍，范 慶，鄭衍芳

（1.遵義醫科大學珠海校區診斷學教研室 珠海 519000；2.遵義醫科大學珠海校區生物工程系 珠海 519000；3.遵義醫科大學珠海校區數理教研室 珠海 519000；4.遵義醫科大學珠海校區生理學教研室 珠海 519000）

2020 年全球乳腺癌（Breast cancer，BC）新發病例高達226 萬例，超過了肺癌的220 萬例，成為全球第一大癌[1]。乳腺癌是全世界女性中最常見的癌癥，在我國女性乳腺癌的發病率逐年增高，其發病率位居女性腫瘤的第1 位，每年有超過30 萬的新發患者，其死亡率為女性腫瘤第4位[2-3]。約90%以上的癌癥相關死亡是由轉移引起的。診斷為遠處轉移的乳腺癌患者中僅有27%存活5 年。因此，抑制癌癥轉移的驅動因素至關重要，對提高生存率有重大意義。

癌癥轉移是一個多步驟的過程，涉及腫瘤與微環境之間的相互作用。轉移進展的初始步驟是癌細胞轉化為具有遷移和侵襲細胞的特征，稱為上皮-間充質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）。線粒體是細胞的能量工廠，產生ATP 供能。線粒體在細胞骨架上不斷融合、分裂和移動，形成線粒體網絡。融合由有絲分裂融合蛋白1（Mitofusi1，Mfn1）、有絲分裂融合蛋白2（Mitofusi2，Mfn2）等催化，而分裂由動力相關蛋白（Dynamin-related protein1，Drp1）和線粒體分裂 蛋白1（Mitochondrial fission protein 1，Fis1）等調控[4-6]。線粒體分裂可以促進EMT，研究表明線粒體分裂形成片段，以便在細胞前沿運輸和積累，產生更多的ATP，促進癌細胞遷移和轉移[7]。與乳腺細胞MCF-10A 相比，乳腺癌細胞MDA-MB-231 高表達Drp1，低表達Mfn2[8]。三陰性乳腺癌細胞相較低轉移性的非三陰性乳腺癌細胞Drp1 升高更明顯。敲除Drp1 可抑制乳腺癌細胞遷移，同時敲除MFN2/1減緩這種作用[9]。

大黃酸（Rhein）化學名為4，5-二羥基2-羧酸蒽醌，屬單蒽核類1，8-二羥基蒽醌衍生物，主要分布于中藥大黃、何首烏等。現代研究表明，大黃酸可通過影響Stat/Snail、PI3K/AKT 信號通路，抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲[10-11]。大黃酸可導致線粒體膜電位升高，產生更多的ROS，促進癌細胞凋亡[12]。然而，目前尚不明確大黃酸是否通過影響線粒體動力學失調和EMT，從而抑制乳腺癌轉移。本研究使用MDA-MB-231乳腺癌細胞，檢測大黃酸是否通過調控線粒體動力學和EMT，從而減緩癌細胞遷移。探索大黃酸對乳腺癌的作用機制，提高大黃酸對乳腺癌的應用開發前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株來源

人乳腺癌癌細胞MDA-MB-231（貨號：HYC3553）購自和元生物技術有限公司。

1.1.2 藥物和試劑

BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0010）購自中國上海碧云天生物技術有限公司；一抗：Mfn2（批號：PB0264）；Vimentin（批號：PB9359）；E-cadherin（批號：BA0475）、β-actin（批號：BM0627）、羊抗兔 IgG（HRP）二抗（批號：BA1054）購自武漢博士德公司。Drp1（批號：ab56788）購于美國Abcam 公司。大黃酸（批號：DD002901，HPLC≥98%）購自成都德思特公司，CCK-8試劑盒（貨號：K0301）購自MedChem Express公司。

1.1.3 儀器

SW-CJ-2F 潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；HF90 型CO2培養箱（上海力申科學儀器有限公司）；3K15型高速冷凍離心機（湘儀實驗室儀器開發有限公司）；M5 02868型多功能酶標儀（廣東省農墾集團進出口有限公司）；IX71型熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯）；Mini-PROTEAN 蛋白電泳系統（美國Bio-Rad公司）；HT7700透射電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 CCK8實驗

將對數生長期細胞細胞接種于96孔板，每組3個復孔。加入不同濃度梯度的大黃酸繼續培養24 h后，每孔避光加10 μL CCK8溶液，37℃中繼續培養2 h。酶標儀下檢測波長為490 nm處的吸光度（A）值，計算細胞存活率。根據實驗結果選擇效果明顯的濃度進行后續實驗。

1.2.2 克隆形成實驗

取700個cells/孔接種于6孔板，保證每個細胞均分散成單個細胞，分別加入100 μmol·L-1、200 μmol·L-1的大黃酸，并設置0 μmol·L-1大黃酸為對照組，連續培養7天。PBS輕洗兩次，每孔加入1 mL的4%多聚甲醛，室溫固定30 min。用0.1%結晶紫染色10 min，棄掉染液，用ddH2O清洗2-3次，晾干后觀察克隆數，拍照并統計克隆形成數。克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%

1.2.3 劃痕實驗

6孔板底部外側用黑色標記筆均勻劃三條橫線，將每孔三等分。待細胞密度大約為90%時，用200 μL槍頭輕輕均勻劃豎線劃痕，使其與標記的橫線垂直。PBS洗2遍去除懸浮的細胞后在倒置顯微鏡下拍攝此時劃痕寬度，記為0 h。重新加入100 μmol·L-1、200 μmol·L-1的大黃酸，并設置0 μmol·L-1大黃酸為對照組，繼續細胞培養箱中培養。在加藥24 h記錄細胞劃痕寬度變化。

1.2.4 透射電鏡觀察線粒體形態

將對數生長期細胞接種至6孔板，培養24 h后添加200 μmol·L-1大黃酸處理24 h，并設置0 μmol·L-1大黃酸為對照組，培養24 h后棄去培養液，加入電鏡固定液4℃固定4 h，細胞低速離心提取細胞，1%瓊脂糖包裹，1%的鋨酸0.1 mol·L-1磷酸緩沖液PB固定2 h。梯度乙醇脫水、滲透、包埋。切80 nm超薄切片，鈾鉛雙染色，切片室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察拍片。

1.2.5 免疫印跡法檢測相關蛋白的表達

將對數生長期細胞接種至6孔板，培養24 h后，加入100 μmol·L-1、200 μmol·L-1大黃酸處理24 h，并設置0 μmol·L-1大黃酸為對照組，培養完成后PBS 緩沖液清洗2 次，加入適量RIPA 裂解液，離心10 min，取上清，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加20 μL蛋白上樣在10% SDS-PAGE 中電泳，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，將膜浸在封閉液中低速搖勻封閉2 h，膜取出直接放入一抗中，4℃封閉過夜；PBST洗膜，5 min 10次；膜轉入二抗中，室溫孵育2 h；PBST洗膜，5 min 10次；用化學發光法（ECL）顯影。

1.3 統計方法

本實驗數據的統計分析采用SPSS 21.0 和GraphPadPrism 8.0 軟件，結果以均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較用SNK-q檢驗，分析各組糖酵解酶表達的差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度大黃酸對MDA-MB-231細胞生長的影響

采用CCK8 實驗，檢測不同濃度梯度的大黃酸（0 μmol·L-1、12.5 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1）作 用24 h后MDA-MB-231 細胞活力。如圖1 所示，較高濃度大黃酸產生抑制細胞生長作用。在100 μmol·L-1和200 μmol·L-1時可以顯著抑制細胞活性（P＜0.01），因此后續實驗選擇這兩個劑量為給藥濃度，給藥時間為24 h（圖1）。

圖1 大黃酸對MDA-MB-231細胞活力的影響

2.2 細胞克隆實驗

克隆實驗可以表達細胞增殖的情況，結果顯示大黃酸處理后7天，與對照組比較，大黃酸組細胞克隆數量明顯減少（P＜0.05），200 μmol·L-1劑量抑制效果更明顯。說明大黃酸可以劑量依賴性的抑制乳腺癌細胞的生長（圖2）。

圖2 大黃酸對MDA-MB-231細胞增殖的影響

2.3 細胞遷移實驗

細胞遷移能力變化采用劃痕實驗進行評估，遷移的距離代表了細胞的遷移能力。結果顯示大黃酸作用MDA-MB-231 細胞24 h 后，與對照組相比，大黃酸組劃痕較寬，細胞遷移距離小；大黃酸高濃度組，較低濃度組細胞遷移距離小，表明大黃酸對MDA-MB-231細胞的遷移能力有明顯濃度依賴抑制作用，差異均有統計學意義（圖3）。

圖3 大黃酸對MDA-MB-231細胞的遷移影響

2.4 大黃酸對線粒體形態的影響

為了進一步直觀研究大黃酸對乳腺癌癌細胞線粒體動力學的影響，運用透射電子顯微鏡觀測乳腺癌細胞內部的線粒體形態和分布。結果如圖4 顯示，對照組乳腺癌細胞的胞質中出現許多氣泡樣的空泡，線粒體過度分裂，線粒體呈碎片化，分布在細胞膜旁和細胞前沿，大黃酸治療后，線粒體數目減少，多分布在細胞質內。這可能是大黃酸影響線粒體動力學途徑，抑制乳腺癌細胞遷移的潛在原因。

圖4 大黃酸處理后乳腺癌細胞超微結構變化

2.5 大 黃 酸 對MDA-MB-231 細 胞Drp1、Mfn2、Ecadherin、Vimentin蛋白表達的影響

免疫印跡法結果（圖5）顯示，大黃酸作用于乳腺癌癌細胞24 h 后，與對照組0 μmol·L-1大黃酸組比較，乳腺癌細胞Drp1、Vimentin蛋白表達量較對照組顯著降低（P＜0.05），Mfn2、E-cadherin蛋白升高。與100 μmol·L-1大黃酸組比較，200 μmol·L-1大黃酸組效果更顯著（P＜0.05）（圖5）。

圖5 大黃酸對MDA-MB-231細胞中Drp1、Mfn2、E-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響

3 討論

中醫藥具有幾千年的歷史，積累了豐富的臨床實踐經驗，乳腺癌屬“乳巖”。中醫認為乳癖的發生是由于情志不暢、久郁傷肝、肝氣郁滯、痰凝血瘀所致，進一步發展氣滯陰虛，毒瘀互結從而形成乳巖。治則多為祛瘀散毒等。現代藥理學發現，大量的中藥提取物可有效防治腫瘤，而在傳統醫學中，這些植物常用于治療炎癥、淤血、癥瘕積聚等，大黃酸是一種從大黃、何首烏等中藥中提取的蒽醌。越來越多的研究表明，大黃酸可以在體外和體內抑制乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌等，其機制與調節癌細胞中多種信號通路和抑制癌基因活性和表達有關，比如可以通過抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲，阻止血管生成而減緩癌癥的進展[13-14]。最新研究表明大黃酸可以聯合化療藥物，增強化療藥物的效果。Wang 等[15]將阿霉素和大黃酸聯合制備為納米顆粒，兩者聯合治療通過抑制NF-κB 和MMP-9 的表達，不僅有效抑制原發性腫瘤生長，而且在體外和體內均顯著抑制腫瘤轉移，并更加安全。本研究結果證實大黃酸抑制乳腺癌細胞增殖可呈劑量依賴性，并可減緩乳腺癌細胞遷移。

乳腺癌轉移級聯是由癌細胞擴散到周圍組織引起的，涉及癌細胞和微環境交互的多個步驟。癌細胞利用EMT 過程獲得侵襲性和干細胞性是啟始步驟。EMT 是一個進化保守的可逆生物過程，導致從上皮表型向間充質表型的轉換。形態學上，EMT 表現為細胞失去極性、粘附性和緊密接觸，導致細胞脫離基底膜，同時大量的細胞骨架重排，將上皮細胞的形態改變為成纖維細胞樣的紡錘形細胞，使其具有更大的運動潛能，從而侵入周圍組織使其遷移到遠處。本研究發現大黃酸可以降低間質標志蛋白Vimentin 表達，升高上皮標志蛋白E-cadherin表達。說明大黃酸可以抑制乳腺癌細胞的上皮細胞轉分化。EMT 具有很大的可塑性即可以逆轉，這個過程叫做間充質-上皮轉化（Mesenchymal-epithelial transition，MET）。遷移后，細胞可以通過MET 在新位置形成腫瘤。所以EMT 不僅有助于癌細胞的侵襲和轉移，而且增強癌細胞的耐受性和存活率，使它們能夠在遠處形成新的腫瘤[16]。因此大黃酸抑制腫瘤細胞EMT，阻止細胞可塑性的瞬時動態過程有助于阻斷轉移級聯反應，防止癌細胞擴散和轉移性生長[17]。

線粒體是一種動態變化的細胞器，在細胞生命過程中融合和分裂，要么呈長橢圓形，要么以形成網絡的細長分支的形態出現，在正常細胞內，通過相關蛋白調節，實現分裂-融合動力學平衡，穩定線粒體形態及在細胞中的分布，從而維持線粒體能力代謝，機體的正常生理功能[18]。但在癌癥發生發展過程中，線粒體的動力學失衡，乳腺腫瘤中線粒體過度分裂，融合減退，線粒體呈碎片化，且在細胞內分布異常，線粒體在細胞前沿運輸和積累，在那里促進ATP 的局部產生，這對于板狀足形成、細胞遷移和轉移形成至關重要[19]，促進乳腺腫瘤生長和轉移[4]。研究證實大黃酸可以降低Drp1 蛋白表達，升高Mfn2 蛋白表達，抑制線粒體分裂和影響線粒體在細胞內的分布。

Drp1 是與線立體分裂密切相關的蛋白，屬于動力學GTPase超家族。在胞質和線粒體外膜上均有分布，大部分分布在胞質中，線粒體外膜上的Drp1位于線粒體分裂部位，通過不斷溢縮促使線粒體膜分裂。乳腺癌患者高表達Drp1，抑制Drp1表達可以顯著減低線粒體自噬，代謝重編程，說明Drp1 在調節乳腺癌細胞代謝和生存中起重要作用[8]。線粒體分裂增加和線粒體網絡缺失被描述為致瘤轉化和癌癥侵襲性增加的特征，與非轉移性癌細胞相比，轉移性癌細胞中驅動線粒體裂變的Drp1明顯上調。癌癥進展過程中，線粒體需要作為單個單位，脫離緊密的網絡組織在細胞內移動。在EMT 過程中，細胞膜下線粒體的積聚是促進絲狀足和板狀足形成的必要條件。研究發現通過敲低Drp1，可促進乳腺癌細胞融合，抑制線粒體在細胞核和遷移細胞前沿之間的前定位，減緩細胞的侵襲和轉移程度[7]。大黃酸降低Drp1表達，抑制線粒體分裂，使細胞運動性和侵襲能力明顯受損，促進EMT 從而推動癌細胞轉移。

Mfn2 定位于線粒體外膜，調控線粒體的融合，維持線粒體形態的動態平衡。同時屬于GTPase超家族，N 端為保守的GTP 酶結構域，C 端為螺旋-螺旋結構。融合過程中，其C端與線粒體外膜結合，形成反式同源或異源的寡聚復合體，介導線粒體外膜的融合。有研究證實剔除Mfn基因可使線粒體融合效率下降，導致線粒體片段化及線粒體的移動能力減弱。在乳腺癌患者中發現低表達Mfn2 的預后劣于高表達的患者，敲除Mfn2基因的MCF7細胞生長快，集落形成迅速，腫瘤的浸潤性強，Mfn2可能是通過mTORC2/AKT通徑調節腫瘤細胞的凋亡，增殖[20-21]。本研究證實，對于三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231，大黃酸升高Mfn2 蛋白表達，調節線粒體功能和細胞增殖，但大黃酸如何通過信號通路調節乳腺癌細胞的線粒體功能，尚需進一步研究。

綜上所述，大黃酸可以降低Drp1 水平，升高Mfn2蛋白表達水平，從而減少線粒體分裂；降低間質標志蛋白Vimentin 表達，增高上皮標志蛋白E-cadherin，從而抑制上皮細胞轉分化。研究表明，大黃酸多靶點降低乳腺癌細胞增殖和遷移的能力，抑制乳腺癌的發展，具有較好的基礎研究前景和臨床應用價值。