基于腸道菌群探討醒腦開竅針刺法對腦卒中大鼠突觸可塑性的影響＊

譚春鳳，徐 瓊，王 波，黃建福，鄭全成

（三亞市中醫院 三亞 572019）

腦卒中是導致人類死亡或殘疾的重大疾病之一，老齡化和高體質量指數等風險因素的累積導致全球范圍內終生腦卒中風險增加[1]。缺血性腦卒中后腦實質受損，伴隨復雜的神經炎癥和全身性免疫反應[2]。幸存者多存在感覺運動和認知功能損害，神經可塑性對于神經功能的恢復和患者的康復至關重要[3]。研究顯示，頭穴叢刺法可促進腦缺血大鼠突觸形態的重塑，改善神經功能[4]。大腦和腸道通過神經元網絡連接，形成復雜的腸-腦軸，現有證據表明，缺血性卒中可導致腸道菌群嚴重受損，而腸道菌群失衡可反過來引起病人神經炎癥，造成神經行為缺損和疾病結果惡化[5-7]。通過重塑腸道菌群結構，恢復腸道微環境，可能減輕大腦中炎癥，恢復突觸可塑性[8-9]，從而改善腦卒中的結局。龐青民等[10]證實，醒腦開竅針刺（Xingnao Kaiqiao acupuncture，AC）法可以改善興奮性神經遞質的代謝，減輕腦卒中造成的神經行為問題。然而其減輕腦卒中大鼠神經行為問題的作用是否與腸道菌群相關，同時，對突觸可塑性的影響均不清楚。因此，本研究采用醒腦開竅針刺法干預腦卒中大鼠，觀察其對大鼠腸道菌群及突觸可塑性的影響，以探討其改善腦卒中后神經行為問題的機制。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF 級45 只SD 大鼠，體質量200-230 g，雄性，購自北京維通利華公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。大鼠在溫濕度恒定、12 h/12 h光/暗周期的動物房中飼養，攝水攝食均自由，實驗操作遵守三亞市中醫院動物倫理委員會規定。

1.2 主要試劑和儀器

環球牌0.18 mm×7 mm 針灸針（蘇州針灸用品公司）；華佗牌電針治療儀（蘇州醫療用品廠）；生長相關蛋白43（Growth-associated protein 43，GAP-43）、突觸素（Synaptophysin，SYN）、腦源性神經營養因子（Brainderived neurotrophic factor，BDNF）、白介素（IL）-1β、GAPDH、羊抗兔IgG二抗（Abcam公司）；高爾基染色試劑盒（FD Neuro Technologies 公司）；糞便DNA 試劑盒（天根生化科技公司）；Quant-iT? dsDNA 分析試劑盒（Invitrogen 公司）；光學顯微鏡（Leica 公司）；電泳轉膜儀器（BioRad 公司）；超薄切片機（LKB Produkter AB 公司）、透射電鏡（Transmission electron microscopy，TEM）（日本HITACHI公司），等。

2 方法

2.1 缺血性腦卒中模型建立

SD 大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，固定（仰臥位）在手術板上。在頸部正中切口，分離肌肉和結締組織，暴露左頸總動脈（Common carotid artery，CCA）和內、外動脈（Internal、External CA，ICA、ECA），用手術線將CCA 的近心端系緊，遠心端僅輕輕系上（需保證栓線可正常插入）。在離ICA和CCA 分叉4 mm 處切“V”形口，經ICA 將圓頭尼龍線（直徑：0.28 mm）徐徐推入約18 mm，遇阻停止，造成腦中動脈閉塞，實現腦缺血。120 min 后緩緩抽出尼龍線，認真縫合傷口。造模成功標準：大鼠清醒后，Zea Longa 評分[11]為1-3 分。假手術（sham，S）組僅分離暴露動脈，不進行腦動脈閉塞。

2.2 分組和治療

造模成功的腦缺血大鼠隨機分為模型（model，M）組和AC 組，各15 只。取15 只大鼠（S 組）進行假手術操作。造模后，AC 組參照文獻[10]進行AC 干預，每天1次，連續7天。具體為：首先在雙側“內關”穴（大鼠前肢內測距腕橫紋上側3-4 mm 尺橈骨縫之間）直刺進針，捻轉提泄手法施針1 min，并留針30 min，連接電針儀刺激（波形：疏密波，強度：3 mA，頻率：2 Hz）；隨后在“水溝”穴（鼻中隔下方）向上進針3 mm，雀啄手法施針10 次，并留針30 min，連接電針儀刺激（波形：疏密波，強度：3 mA，頻率：2 Hz）。

2.3 神經功能評估方法

末次治療后，采用Zea Longa 評分評估S 組、M 組和AC 組（n=12）大鼠神經功能。分數越高意味著損傷越重。

2.4 TEM觀察突觸結構

末次治療后，每組各3只大鼠通過頸靜脈灌注4%多聚甲醛，10 min 后分離缺血半影帶（Ischemic penumbra，IP）皮層組織，切為1 mm×1 mm×1 mm 小塊，在2.5%戊二醛中固定24 h。隨后，經1%四氧化鋨固定、PBS 沖洗、乙醇和丙酮分級脫水等處理后，用超薄切片機制備IP 皮層組織超薄切片（約60 nm），并用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛分別染色10 min。在TEM 下觀察切片并拍照。

2.5 樣本采集

評分后，對各組大鼠麻醉，在超凈臺中用腹部壓迫法收集新鮮糞便（n=12），置于-80℃保存，用于提取腸道微生物群的DNA。隨后，6只大鼠迅速取腦，分離IP 皮層組織，置于A+B 混合液（高爾基染色試劑盒）中，用于高爾基染色觀察；余下6只大鼠的IP皮層組織保存在-80℃，用于Western blot。

2.6 高爾基染色

取A+B 混合液中的IP 皮層組織，6 h 后，更換新鮮A+B 混合液，持續浸泡14 天，隨后將IP 皮層組織移至試劑盒的C液中，4℃下避光保存3天（每24 h更換1次C液）。將上述組織浸沒在15%甘油+20%蔗糖混合液中，4℃下放置24 h。用冰凍切片機制備常規切片（約100 μm），經乙醇分級脫水、二甲苯透明后封片。在普通顯微鏡下觀察切片并拍照。用Image J 軟件分析二級樹突上的樹突棘密度。

2.7 Western blot檢測

在RIPA 裂解液中裂解IP 皮層組織，提取總蛋白，并使用BCA 測定法測定濃度。將等量（20 μg）蛋白上樣到SDS-PAGE 凝膠上并通過電泳分離，隨后將蛋白轉移（半干法）到PVDF 膜上。將膜在5%脫脂奶粉中封閉，并在4℃下與一抗（GAPDH、BDNF、SYN、GAP-43、IL-1β、TNF-α）孵育，次日加入二抗來檢測抗體標記，使用ECL 發光液使蛋白可視化，在蛋白凝膠成像儀上拍照并分析。

2.8 ELISA檢測

取-80℃的IP 皮層組織在磷酸緩沖液中勻漿，取離心后的上清，按照ELISA 試劑盒步驟檢測IP 皮層組織中IL-1β、TNF-α及IL-17含量。

2.9 微生物群DNA測序及分析

用糞便DNA 試劑盒提取大鼠腸道微生物群的總DNA。使用對應于V3-V4 區域的引物（正向：5’-GTG CCAGCMGCCGCGGTAA-3’；反向：5’-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3’）擴增16S rDNA，使用Invitrogen的Quant-iT? dsDNA 分析試劑盒對擴增產物定量。隨后對擴增產物使用NEB next?Ultra? II DNA Library Prep Kit for Illumina 試劑盒（New England BioLab 公司）制備文庫并進行質檢，然后使用Illumina MiSeq測序平臺進行2 × 150 bp 雙向全基因組測序（由北京奧維森科技公司完成）。對測序所得優質序列數據進行OTUs 聚類分析，并基于OUTs 結果對菌群結構（包括多樣性和差異性等）進行分析。

2.10 統計學處理

運用GraphPad Prism 8.0 軟件分析數據。實驗數據用平均數±標準差（±s）描述，用單因素方差分析行多組間比較，用SNK-q檢驗行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 AC對大鼠神經損傷程度的影響

M 組神經功能評分較S 組高（P＜0.05）；AC 組神經功能評分較M組低（P＜0.05），見圖1。

圖1 三組神經損傷評分的比較

3.2 AC對大鼠IP皮層組織突觸形態結構的影響

S 組樹突棘密度為（16.53±2.91）個·10 μm-1，突觸形態規則。相比于S 組，M 組樹突棘密度[（7.15±1.43）個·10 μm-1]降低（P＜0.05）；突觸囊泡數量較少、形態不規則，前膜、后膜及間隙邊界模糊，間隙寬度變寬，突觸后致密帶（Postsynaptic densities，PSD）變薄。相比于M 組，AC 組樹突棘密度[（12.86±2.75）個·10 μm-1]增加（P＜0.05）；突觸囊泡數量和后致密帶厚度均有所增加，前膜、后膜及間隙邊界趨于規則，見圖2。

圖2 三組大鼠突觸形態結構觀察

3.3 AC對大鼠IP皮層組織BDNF、SYN、GAP-43蛋白表達的影響

相比于S 組，M 組BDNF、SYN、GAP-43 蛋白水平增高（P＜0.05）；相比于M 組，AC 組BDNF、SYN、GAP-43蛋白水平進一步增高（P＜0.05），見圖3、表1。

表1 三組BDNF、SYN、GAP-43蛋白水平比較（±s，n=6）

表1 三組BDNF、SYN、GAP-43蛋白水平比較（±s，n=6）

注：與S組比較，#P＜0.05；與M組比較，※P＜0.05。（下表同）

GAP-43/GAPDH 0.97±0.12 1.50±0.20#2.16±0.29※組別S M AC BDNF/GAPDH 1.18±0.13 1.47±0.25#2.57±0.32※SYN/GAPDH 0.72±0.15 1.18±0.19#1.86±0.31※

圖3 Western blot檢測BDNF、SYN、GAP-43蛋白水平

3.4 AC對大鼠大腦炎癥的影響

相比于S 組，M 組IP 皮層組織IL-1β、TNF-α 及IL-17 含量增高（P＜0.05）；相比于M 組，AC 組IP 皮層組 織IL-1β、TNF-α 及IL-17 含 量 降 低（P＜0.05），見表2。

表2 三組IL-1β、TNF-α及IL-17含量比較（±s，n=6）

組別S M AC IL-1β（μg·mL-1）15.90±2.14 46.28±4.49#26.45±3.26※TNF-α（μg·mL-1）12.63±2.25 35.46±3.85#20.75±3.61※IL-17（μg·mL-1）10.86±1.97 29.41±4.28#18.07±3.39※

3.5 AC對大鼠腸道菌群的影響

3.5.1 菌群多樣性分析

經 分 析，相 比 于S 組，M 組Shannon、Chao1 和Observed species 指數降低（P＜0.05），即菌群多樣性和數 量 減 少；相 比 于M 組，AC 組Shannon、Chao1 和Observed species 指數升高（P＜0.05），即菌群多樣性和數量增加。3組Goods coverage指數均＞99%，表明本研究的測序覆蓋率增高。見表3。

表3 三組Shannon、Chao1、Observed species及Goods coverage指數比較（±s，n=6）

組別S M AC Shannon 5.37±0.42 4.21±0.53#5.29±0.36※Chao1 335.80±20.51 246.70±25.43#315.40±18.67※Observed species 291.58±24.18 205.76±31.62#278.44±27.35※Goods coverage 0.99±0.00 0.99±0.00 0.99±0.00

3.5.2 菌門相對豐度的差異性分析

經分析，S 組、M 組、AC 組大鼠的腸道菌群歸屬于10個菌門、24個菌目和118 個菌屬。在門水平上，3組大鼠腸道優勢菌群為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，三者相對豐度總和在S 組、M 組、AC 組中分別占比為96.45%、93.49%、95.51%。除此之外，豐度排名前5的還包括疣微菌門和放線菌門。相比于S 組，M 組擬桿菌門相對豐度較低，而F/B 比率增高（P＜0.05）；相比于M 組，AC 組擬桿菌門相對豐度升高，而F/B 比率降低（P＜0.05），見圖4、表4。

表4 三組菌門相對豐度的比較（±s，n=6）

表4 三組菌門相對豐度的比較（±s，n=6）

組別S M AC Firmicutes 38.59±13.42 53.82±19.64 47.61±13.50 Bacteroidetes 49.04±9.51 29.54±7.96#38.05±8.43※Proteobacteria 8.82±1.56 10.13±2.95 9.85±1.73 Verrucomicrobia 1.49±0.38 2.16±0.93 1.85±0.62 Actinobacteria 0.97±0.38 1.03±0.57 0.78±0.29 F/B 0.79±0.18 1.82±0.24#1.25±0.21※

圖4 三組大鼠優勢門菌群的相對豐度

3.5.3 菌屬相對豐度的差異性分析

在屬水平上，3 組大鼠腸道優勢菌群主要歸屬于27 個屬。相比于S 組，M 組擬桿菌屬（bacteroides）、理研菌屬（Rikenella）、埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia Shigella）、罕見小球菌屬（Subdoligranulum）、瘤胃球菌_NK4A214 屬（Ruminococcaceae_NK4A214）、瘤胃球菌_UCG-005 屬、瘤胃球菌_1 屬（Ruminococcus_1）、布勞特氏菌屬（Blautia）、艾克曼菌屬（Akkermansia）、Marvinbryantia、糞球菌 屬（Coprococcus）、鏈球菌屬（streptococcus）相 對 豐 度 增 高（P＜0.05），乳桿菌屬（Lactobacillus）、Lachnospiraceae_UCG-006、瘤胃球菌_UCG-014 屬、Candidatus Saccharimonas、Lachnospiraceae_NK4A136、普氏沃氏菌_1屬（Prevotella_1）、羅斯菌屬屬（Roseburia）、普 氏 沃 氏 菌_9 屬（Prevotella_9）、Prevotellaceae_UCG-001、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、雙歧桿菌屬（bifidobacteria）、Eubacterium_xylanophilum相對豐度較低（P＜0.05）。相比于M 組，AC 組理研菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬、艾克曼菌屬相對豐度較低（P＜0.05），糞球菌屬、乳桿菌屬、瘤胃球菌_NK4A214屬、瘤胃球菌_1 屬、普氏沃氏菌_9 屬、Candidatus Saccharimonas、雙歧桿菌屬相對豐度增高（P＜0.05），鏈球菌屬、擬桿菌屬等相對豐度亦呈向S 組回調的趨勢（P＞0.05），見圖5、表5。

表5 三組大鼠優勢屬菌群相對豐度的比較（±s，n=6）

表5 三組大鼠優勢屬菌群相對豐度的比較（±s，n=6）

Genus Lactobacillus Romboutsia Ruminococcaceae_NK4A214 Prevotella_9 Ruminococcus_1 Turicibacter Lachnospiraceae_UCG-006 Lachnospiraceae_NK4A136 Phascolarctobacterium Roseburia Prevotella_1 bacteroides Ruminococcaceae_UCG-014 Ruminococcaceae_UCG-005 Ruminiclostridium_5 Akkermansia Escherichia Shigella Eubacterium_xylanophilum Blautia Coprococcus Prevotellaceae_UCG-001 Marvinbryantia Subdoligranulum Rikenella bifidobacteria streptococcus Candidatus Saccharimonas S M 11.93±2.76 11.04±3.90 7.81±2.03 5.47±1.55 1.98±0.47 4.61±1.82 3.87±1.05 7.83±1.65 3.16±1.24 2.59±0.94 2.13±0.40 3.72±0.61 1.65±0.68 0.53±0.14 1.38±0.29 1.29±0.45 0.63±0.19 1.38±0.26 0.58±0.17 0.16±0.03 0.42±0.14 0.03±0.01 0.02±0.01 0.42±0.13 13.57±0.68 0.02±0.01 3.62±0.19 7.08±1.94#2.87±1.06#10.28±1.59#1.28±0.16#3.65±0.62#4.58±1.37 0.16±0.05#1.27±0.18#2.81±0.95 0.63±0.24#0.86±0.25#13.04±2.87#0.81±0.29#1.55±0.42#1.45±0.31 2.43±0.82#14.05±2.13#0.09±0.03#16.35±3.12#0.97±0.32#0.15±0.05#0.45±0.12#0.93±0.26#1.35±0.41#1.06±0.24#0.15±0.06#0.81±0.22#AC 10.15±1.86※3.81±1.37 12.46±1.85※3.96±1.04※5.73±0.81※5.07±1.93 0.19±0.07 1.46±0.21 2.73±0.91 0.72±0.35 0.91±0.18 10.61±3.15 0.93±0.41 1.47±0.36 1.47±0.39 1.97±0.36※4.81±1.06※0.12±0.05 13.28±4.06 1.16±0.27※0.18±0.06 0.46±0.18 0.89±0.25 0.97±0.25※8.63±1.05※0.13±0.05 1.35±0.27※

圖5 三組大鼠優勢屬菌群的相對豐度

4 討論

缺血性腦卒中是腦血管疾病中最常見的類型，血流的中斷會導致腦內部分神經元快速死亡，形成缺血梗塞區，并引起周圍區域（IP）發生血流減少、神經元萎縮、突觸功能減弱等改變[12]。神經可塑性可重建未受損神經元之間的連接，是IP 中的重要修復過程，因此其可能是缺血性腦卒中的治療靶點[13]。突觸可塑性包括形態結構和功能兩方面，其中形態結構是突觸功能和可塑性的基礎[14-15]。本研究中，M 組大鼠的PSD 變薄，突觸間隙寬度變寬，而這些變化會減弱傳遞效率并抑制突觸功能可塑性，從而導致功能缺陷[14]。醒腦開竅針刺法干預后，大鼠突觸囊泡數量和PSD 厚度均有所增加，邊界趨于規則，提示醒腦開竅針刺法可以恢復PSD 厚度，改善突觸形態結構。疾病發生后，大腦會啟動一系列自發修復，包括重要生長因子（BDNF）的表達、突觸和樹突的生長、軸突重塑等，且可以通過治療來促進[16]。SYN 為突觸發生的經典標志物，其表達水平可反映腦內突觸的密度，缺血性損傷時，SYN 水平顯著降低，隨著大腦自我修復的啟動，其水平逐漸增高[17]。GAP-43 在軸突生長期和突觸形成早期特異表達，可作為軸突生長和再生的分子標記[18]。正常大鼠腦中僅存在少量GAP-43 表達，但在缺血發生后IPGAP-43 表達顯著升高[19]。本研究中，M 組IPBDNF、SYN、GAP-43 蛋白水平明顯高于S 組，反映了大腦的自我修復。而醒腦開竅針刺法干預進一步提高了IPBDNF、SYN、GAP-43 蛋白水平，提示干預后大鼠的突觸可塑性更高，結合突觸形態結構的改善，有利于突觸傳遞效率的提高，這可能是醒腦開竅針刺法促進腦卒中大鼠神經功能改善的機制。

腸道菌群通過調節糖脂代謝、炎癥和免疫反應，在腦卒中的神經病理生理學中起重要作用[20]。本研究發現，腦卒中大鼠腸道菌群多樣性下降、數量減少，且菌群構成明顯不同。而給予醒腦開竅針刺后，腸道菌群的多樣性顯著升高，數量顯著增多，且菌群構成向S組回調。表明醒腦開竅針刺法可促進腦卒中大鼠腸道菌群構成向正常回調。研究顯示，F/B 比率增加是機體衰老和生態失調的標志，且F/B 比率增高會加重腦卒中小鼠的全身炎癥和神經損傷程度[21]。本研究中，M 組IP 皮層組織IL-1β、TNF-α、IL-17 含量增高，擬桿菌門相對豐度顯著降低，F/B 比率增高，而醒腦開竅針刺后，IL-1β、TNF-α、IL-17 含量降低，擬桿菌門相對豐度顯著增高，F/B 比率降低，提示醒腦開竅針刺可以通過調節擬桿菌門相對豐度，降低F/B 比率，進而減輕腦卒中大鼠炎癥反應。

在胃腸道中存在多種條件致病菌，能夠引起腸道炎癥，其一旦突破腸道屏障，甚至可能引起全身性炎癥[22]。在炎癥性腸病小鼠的糞便中[23]，埃希氏菌-志賀氏菌屬和艾克曼菌屬相對豐度增高，IL-6、IL-18 等促炎因子含量同步增加，而外源性給予雙歧桿菌可減輕腸道炎癥。Candidatus Saccharimonas在急性胰腺炎大鼠糞便中相對豐度降低，可能通過釋放抗菌肽抑制腸道炎癥反應[24]。Butara等[25]觀察到，理研菌屬的富集與較輕的結腸炎有關，可能具有啟動和擴大腸道炎癥的作用。同時研究發現，腦缺血猴的糞便中后擬桿菌屬相對豐度增加，乳桿菌屬減少，伴隨血漿脂多糖和IFNγ、IL-6炎癥因子水平升高[26]。在本研究中，腦卒中大鼠腸道中乳桿菌屬、Candidatus Saccharimonas相對豐度降低，埃希氏菌-志賀氏菌屬、理研菌屬、艾克曼菌屬、擬桿菌屬相對豐度升高，促炎菌群與抗炎菌群失調，導致腸道處于炎癥微環境。醒腦開竅針刺后，理研菌屬等促炎菌屬相對豐度下降，Candidatus Saccharimonas等抗炎菌屬相對豐度回升，有利于腸道微環境恢復健康狀態，而腸道微環境可通過腸-腦軸影響大腦微環境，推測醒腦開竅針刺法可能通過作用于腸道菌群，調節腸道微環境，降低腦卒中大鼠大腦中的炎癥反應。

糞球菌屬、艾克曼菌屬、瘤胃球菌屬等還可產生丁酸、乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸（SCFA）代謝物，而SCFA 可穿透血腦屏障，促進神經營養因子合成、減輕神經炎癥、調控腦內神經元的存活、增加突觸的可塑性，最終改善腦卒中引起的神經功能缺陷[27]。本研究中，M 組大鼠瘤胃球菌_NK4A214 屬、糞球菌屬、艾克曼菌屬等產生SCFA 的菌群增多，可能是機體應對腦卒中的自我保護機制。不同的是醒腦開竅針刺后瘤胃球菌_NK4A214 屬和糞球菌屬相對豐度繼續增高，艾克曼菌屬相對豐度則下降，可能與艾克曼菌屬不僅產生丁酸鹽還產生炎癥因子有關。另外，雙歧桿菌屬、乳桿菌屬為重要的益生菌，雙歧桿菌、乳桿菌補充劑已被證明可以改善認知功能和神經炎癥[28]。本研究在腦卒中大鼠糞便中檢測到，乳酸菌屬相對豐度降低，醒腦開竅針刺后其相對豐度顯著升高。以上結果提示醒腦開竅針刺法可能通過改變腸道菌群構成，調節機體腦內炎癥反應等，改善腦卒中大鼠神經功能。

綜上所述，醒腦開竅針刺法可恢復有益菌屬相對豐度，降低有害菌屬相對豐度，減輕大腦炎癥并可改善突觸可塑性，減輕腦卒中大鼠神經功能損傷。但是腸道菌群還可產生多種代謝物，其改善突觸可塑性的具體機制仍待研究。