補(bǔ)土雅解方治療抗生素相關(guān)性腹瀉的作用機(jī)制＊

肖 湉，于興志，楊麗萍，段小花

（云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650500）

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，近年來抗生素在我國醫(yī)院中使用率已位居世界第一，超出國際平均水平的30%以上，且有近三成家庭自備抗生素但大多數(shù)未遵照說明書進(jìn)行服藥[1-2]。濫用抗生素將會(huì)引起腹瀉、過敏、二重感染、肝腎損傷等不良反應(yīng)[3]，其中抗生素相關(guān)性腹瀉（Antibiotic-associated Diarrhea，AAD）是由于抗生素濫用導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)腸道菌群失調(diào)從而出現(xiàn)以泄瀉為主要病證的常見并發(fā)癥[4]。AAD 不僅會(huì)損害腸道機(jī)械屏障、破壞免疫穩(wěn)態(tài)，還將影響腸道微生物的結(jié)構(gòu)組成[5-6]。導(dǎo)致患者短期內(nèi)輕則腹瀉、免疫力受損引發(fā)結(jié)腸炎、胃炎等炎癥疾病，重則誘發(fā)胃腸癌、全身感染危及生命[7]；亦有研究表明，兒童時(shí)期濫用抗生素將在往后生活中出現(xiàn)過敏、哮喘、肥胖等疾病，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[8-10]。因此，如何應(yīng)對(duì)抗生素濫用引發(fā)的不良反應(yīng)極為關(guān)鍵。

傣族人民在長期的生活實(shí)踐中總結(jié)并創(chuàng)立了傣醫(yī)學(xué)中最具特色的理論體系：“雅解”學(xué)說。在傣醫(yī)雅解理論指導(dǎo)下，“雅解方”通過調(diào)節(jié)人體四塔（風(fēng)、火、水、土）、五蘊(yùn)（色、識(shí)、受、想、行）功能，可用以解除食物毒性、藥物毒性、解除動(dòng)物叮咬中毒、解除熱毒等[11]。ADD 在傣醫(yī)理論中未有對(duì)應(yīng)病名，但其與雅解理論中失治誤治引發(fā)的巴塔維他都軟（土塔不足）而產(chǎn)生的藥物不良反應(yīng)具有相同的致病原理，主要是由于機(jī)體感受病邪或因體內(nèi)土塔失調(diào)而導(dǎo)致的臟腑功能異常，排泄功能紊亂[12-13]。“補(bǔ)土雅解方”是課題組在傣族地區(qū)長期進(jìn)行調(diào)查研究的過程中發(fā)現(xiàn)的傣族雅解經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過臨床實(shí)踐驗(yàn)證其對(duì)解抗生素引起的藥物毒有很好的臨床療效。該驗(yàn)方主要由民族藥組成，具有調(diào)補(bǔ)土塔、清火解毒、收斂止瀉的功效，但有關(guān)補(bǔ)土雅解方解抗生素藥物毒的作用及機(jī)制的文獻(xiàn)尚未報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以補(bǔ)土雅解方為研究對(duì)象，通過復(fù)制抗生素相關(guān)性腹瀉的模型，從腸道黏膜通透性、腸道菌群移位的角度評(píng)價(jià)補(bǔ)土雅解方對(duì)腸道黏膜完整性的保護(hù)作用，從補(bǔ)土雅解方改善腸道免疫屏障、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)失衡等方面深入研究傣族經(jīng)驗(yàn)方“補(bǔ)土雅解方”對(duì)腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用。以期為民族藥治療抗生素相關(guān)性腹瀉以及作用機(jī)制提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支撐，促進(jìn)民族醫(yī)藥的發(fā)展。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)健康Spraque-Dawley 雄性大鼠60 只，體質(zhì)量180±20 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（CXK（川）2018-24），實(shí)驗(yàn)條件和方法經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查合格，動(dòng)物倫理審查文件編號(hào)為：R-062022G092。每籠10 只飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)鑒甲樓動(dòng)物房內(nèi)，環(huán)境清潔，溫度22±2℃，濕度40%-60%，自由飲食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)至體質(zhì)量達(dá)到200±20 g時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器

補(bǔ)土雅解方藥材均由云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；鹽酸林可霉素（160304，購于成都錦華藥業(yè)有限公司）；培菲康（04720151125，購于上海信誼藥廠有限公司）；二胺氧化酶ELISA Kit、髓過氧化物酶ELISA Kit、脂多糖/內(nèi)毒素ELISA Kit、分泌型免疫球蛋白A ELISA Kit（CSB-E12634r、CSB-E08722r、CSBE14247r、CSB-E08412r，購于武漢華美生物工程有限公司）；胰蛋白胨大豆瓊脂購于北京索來寶科技有限公司。

2 方法

2.1 分組造模與給藥

60只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為6組，分別是空白組，模型組，陽性藥組，補(bǔ)土雅解方高、中、低劑量組。除空白組外，其余各組大鼠給予鹽酸林可霉素（5 g·kg-1·d-1）灌胃，連續(xù)7 天。直至大鼠毛色無光澤、體質(zhì)量下降、肛周泛紅且大便稀軟不成形，則提示造模成功。

造模成功后，陽性藥組給予培菲康（1 g·kg-1）。基于課題組前期研究，各藥物組給予補(bǔ)土雅解方高（40.5 g·kg-1）、中（20.25 g·kg-1）、低（10.125 g·kg-1）劑量灌胃。空白組與模型組給予同體積（1 mL·100 g-1）蒸餾水灌胃。連續(xù)給藥7天后取材并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2.2 樣本采集

取大鼠腹主動(dòng)脈血4-5 mL，4℃條件下，1000 r·min-1離心15 min。取上層血清分裝，-80℃冰箱保存。

大鼠解剖后，分離脾臟，剝離周圍組織，用PBS 清洗干凈，用吸水紙吸干液體，拍照，稱重，置于真空袋中，-80℃保存。

大鼠解剖后，剝離腸周圍的組織，拍照，置于真空袋中，-80℃保存。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 腸組織HE染色檢測(cè)

解剖大鼠腹部剝離腸周圍組織，于回盲部12 cm處取1.5 cm 腸組織，生理鹽水清理內(nèi)容物后用10%多聚甲醛溶液固定，24 h 后使用從低到高濃度乙醇及二甲苯進(jìn)行脫水處理，進(jìn)行石蠟包埋后切成5 μm石蠟切片。將石蠟切片使用二甲苯與從高到低濃度乙醇梯度脫蠟。室溫下蘇木精染色2 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，沖洗返藍(lán)。室溫下用伊紅染液染色1 min，用水洗去殘留染色液后。將切片用分級(jí)乙醇脫水，在二甲苯中透明，用中性樹膠密封，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2.3.2 血清相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

大鼠腹主動(dòng)脈取血5 mL，4℃，1000 r·min-1離心15 min。取上層血清分裝，使用相關(guān)ELISA 試劑盒檢測(cè)二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）、髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）、脂多糖/內(nèi)毒素（Lipopolysaccharide，LPS）含量。

2.3.3 腸道免疫屏障指標(biāo)檢測(cè)

解剖大鼠腹部剝離腸周圍組織，取100 mg 加1 mL PBS 充分冰浴勻漿。將勻漿液4℃，5000 r·min-1離心5 min。取上清液，使用相關(guān)ELISA試劑盒檢測(cè)檢測(cè)分泌型免疫球蛋白（Secretory immunoglobulin A，sIgA）水平。

2.3.4 大鼠腸道細(xì)菌移位檢測(cè)

取胰蛋白胨大豆瓊脂粉40 g加入蒸餾水，121℃高壓滅菌30 min，冷卻至30-40℃，制成平板。解剖大鼠后取出腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、肝臟，上述臟器各取100 mg 加1 mL 巰基乙酸肉湯充分冰浴勻漿。取100 μL 勻漿液均勻涂抹于胰蛋白胨大豆瓊脂平板上密封30 min，于37℃培養(yǎng)箱（5% CO2）中孵育48 h 后計(jì)算菌落數(shù)，每個(gè)樣重復(fù)3次。

2.3.5 腸道微生態(tài)環(huán)境檢測(cè)

給藥最后1 天，各組隨機(jī)抽取3 只大鼠，每只采集新鮮糞便1 粒，每組共3 粒。送于羅寧生物技術(shù)有限公司使用16S rDNA 的V4 高變區(qū)測(cè)序技術(shù)，利用OUT聚類與注釋、α 多樣性、NMDS 和樣品聚類分析對(duì)腸道微生態(tài)環(huán)境進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)土雅解方對(duì)AAD大鼠一般狀態(tài)的影響

鹽酸林可霉素灌胃7 天后，空白組大鼠精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量穩(wěn)定上升，飲食飲水量與糞便形態(tài)未出現(xiàn)異常。其余組別大鼠反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)暗淡，伴隨飲食量減少、飲水量增多、體質(zhì)量增長緩慢，且大鼠墊料較濕，盲腸內(nèi)糞便色淺且已不成形，腹瀉現(xiàn)象較明顯。經(jīng)過藥物治療后，各給藥組大鼠整體精神狀態(tài)明顯改善，飲食量飲水量逐漸恢復(fù)正常，體質(zhì)量增長加快，給藥結(jié)束后，盲腸內(nèi)糞便已成形，稀軟便基本恢復(fù)正常（見圖1）。

圖1 大鼠盲腸內(nèi)糞便形態(tài)

3.2 補(bǔ)土雅解方對(duì)AAD大鼠腸組織病理形態(tài)的影響

HE 染色結(jié)果顯示，空白組大鼠腸組織結(jié)構(gòu)完整未見異常；而模型組大鼠腸黏膜上皮組織明顯病變，水腫充血伴有細(xì)胞壞死，且結(jié)構(gòu)疏松腸絨毛出現(xiàn)斷裂；陽性藥組和補(bǔ)土雅解方高、中、低劑量組大鼠的腸黏膜上皮組織病變均有明顯改善，細(xì)胞排列趨于規(guī)則，絨毛形態(tài)修復(fù)良好分布均勻，其中高劑量組改善狀況最佳（見圖2）。

圖2 大鼠腸HE病理切片（×40）

3.3 補(bǔ)土雅解方對(duì)AAD 大鼠血清中DAO、MPO、LPS含量的影響

由表1 可知，模型組相比于正常組大鼠血清中DAO、MPO、LPS 含量顯著升高（P＜0.001，P＜0.01）；與模型組相比，經(jīng)過各組藥物治療后大鼠血清中DAO、MPO含量明顯降低（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）；各藥物治療組LPS 含量均有所下降，除補(bǔ)土雅解方高劑量組顯著下降外（P＜0.05），其余組別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 大鼠血清中DAO、MPO、LPS含量的變化（±s，n=8）

表1 大鼠血清中DAO、MPO、LPS含量的變化（±s，n=8）

注：與空白組相比，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

LPS含量（mlU·mL-1）1353.52±314.09 2089.36±678.33**1699.45±118.46 1508.56±153.40#1727.54±76.28 1765.40±129.47組別空白組模型組陽性藥組補(bǔ)土雅解方高劑量組補(bǔ)土雅解方中劑量組補(bǔ)土雅解方低劑量組DAO含量（mlU·mL-1）1519.33±191.78 2538.23±506.18***2030.84±360.61#1691.66±190.27##1712.19±334.85##1994.83±456.80#MPO含量（mlU·mL-1）345.06±133.23 715.82±105.26***444.90±165.07#353.27±85.57###396.57±152.62##492.07±144.20#

3.4 補(bǔ)土雅解方對(duì)AAD大鼠腸道細(xì)菌移位的影響

由表2可知，模型組與正常組大鼠相比淋巴結(jié)、脾臟、肝臟菌落數(shù)明顯上升（P＜0.001，P＜0.01），與模型組相比，經(jīng)過藥物治療后各組大鼠淋巴結(jié)、脾臟菌落數(shù)均有顯著下降（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）；各藥物治療組肝臟菌落數(shù)均有所降低，除補(bǔ)土雅解方高劑量組顯著下降外（P＜0.05），其余組別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 大鼠腸道細(xì)菌移位的菌落數(shù)變化（±s，n=8）

表2 大鼠腸道細(xì)菌移位的菌落數(shù)變化（±s，n=8）

注：與空白組相比，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

肝臟菌落數(shù)（CFU·mg-1）0.07±0.03 0.25±0.07**0.14±0.06 0.10±0.06#0.14±0.02 0.20±0.06組別空白組模型組陽性藥組補(bǔ)土雅解方高劑量組補(bǔ)土雅解方中劑量組補(bǔ)土雅解方低劑量組淋巴結(jié)菌落數(shù)（CFU·mg-1）0.21±0.06 3.46±1.33***0.28±0.03###0.25±0.01###0.37±0.02###0.61±0.10##脾臟菌落數(shù)（CFU·mg-1）0.10±0.03 0.37±0.06***0.19±0.06#0.13±0.06##0.18±0.05##0.19±0.09#

3.5 補(bǔ)土雅解方對(duì)AAD 大鼠小腸組織中sIgA 水平的影響

由表3 可知，模型組與正常組相比大鼠小腸組織中的sIgA 水平明顯下降（P＜0.001），經(jīng)過藥物治療后，陽性藥組和補(bǔ)土雅解方高、中劑量組sIgA 水平顯著上升（P＜0.01，P＜0.05）；補(bǔ)土雅解方低劑量組sIgA 水平回升但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 大鼠小腸組織中sIgA水平的變化（±s，n=8）

表3 大鼠小腸組織中sIgA水平的變化（±s，n=8）

注：與空白組相比，***P＜0.001；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組陽性藥組補(bǔ)土雅解方高劑量組補(bǔ)土雅解方中劑量組補(bǔ)土雅解方低劑量組sIgA含量（μg·mL-1）810.60±98.10 369.82±59.09***506.62±99.23#588.46±124.60##517.97±132.69#468.24±74.24

3.6 補(bǔ)土雅解方對(duì)AAD大鼠腸道微生態(tài)的影響

3.6.1 補(bǔ)土雅解方對(duì)AAD 大鼠腸道菌群α 多樣性指數(shù)的影響

由圖3 可知，與正常組相比，模型組大鼠PD、Chao1 指數(shù)下降表示大鼠腸道微生物群落豐度降低（P＜0.001），Shannon、Simpson 指數(shù)下降表示大鼠腸道微生物群落多樣性降低（P＜0.001）。經(jīng)過藥物治療后，各組大鼠腸道微生物群落的α 多樣性指數(shù)均有改善，其中補(bǔ)土雅解方高劑量組效果最佳（P＜0.001），中劑量組改善Chao1效果最為顯著（P＜0.001）。陽性藥組可有效改善Chao1、Simpson指數(shù)（P＜0.001，P＜0.01）。

圖3 PD（a）、Chao1（b）、Shannon（c）及Simpson（d）指數(shù)（±s，n=3）

3.6.2 補(bǔ)土雅解方對(duì)AAD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)圖4 中NMDS 與樣品聚類分析可知，正常組與模型組不屬于同一區(qū)域在坐標(biāo)軸上距離較遠(yuǎn)，且不屬于同一分支，提示兩組間菌群結(jié)構(gòu)差異較大。補(bǔ)土雅解方高、中劑量組在坐標(biāo)軸上與空白組距離相近，且屬于同一分支，提示兩個(gè)治療組與空白組間菌群結(jié)構(gòu)較為接近。

圖4 NMDS分析（a）和樣品聚類分析圖（b）

3.6.3 補(bǔ)土雅解方對(duì)AAD大鼠腸道菌群組成的影響

通過OUT 聚類與注釋分析，重抽樣后單個(gè)樣本含9653條序列，共2034個(gè)OTU。各個(gè)組別菌群分類在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）。與正常組相比，模型組Bacteroidetes 和Proteobacteria 菌群占比上升，F(xiàn)irmicutes/Bacteroidetes 比例有所下降。其中Firmicutes 菌群占比顯著下降（P＜0.01）。經(jīng)過藥物治療后，各組大鼠門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群占比和Firmicutes/Bacteroidetes 比例均有明顯改善，補(bǔ)土雅解方高、中劑量組Firmicutes 菌群比例明顯升高（P＜0.05）。詳見表4，圖5。

表4 大鼠糞便在門水平分類的優(yōu)勢(shì)菌群（±s，n=3）

表4 大鼠糞便在門水平分類的優(yōu)勢(shì)菌群（±s，n=3）

注：與空白相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05。

Firmicutes/Bacteroidetes 9.43±2.36 2.90±1.85 5.59±4.05 8.22±6.28 7.95±3.83 11.68±9.73組別空白組模型組陽性藥組補(bǔ)土雅解方高劑量組補(bǔ)土雅解方中劑量組補(bǔ)土雅解方低劑量組Firmicutes（%）81.82±4.02 51.10±13.77**67.29±15.80 77.90±7.93#74.51±5.06#60.74±2.48 Bacteroidetes（%）8.96±1.77 21.32±8.86 15.52±8.72 13.86±9.42 11.03±5.24 13.02±15.73 Proteobacteria（%）7.34±2.77 24.94±12.28 14.71±13.95 6.40±2.45 12.62±9.29 24.28±15.94

圖5 門水平物種相對(duì)豐度柱形圖（a）及屬水平物種相對(duì)豐度柱形圖（b）

各個(gè)組別菌群分類在屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群主要為厚壁菌門的乳酸菌屬（Lactobacillus），變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬、綠膿桿菌屬、腸桿菌屬(Sphingomonas、Pseudomonas、Enterobacter）。與正常組相比，模型組中Lactobacillus占比明顯下降（P＜0.01），Sphingomonas、Pseudomonas、Enterobacter占比升高。經(jīng)過藥物治療后，各組大鼠屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群占比均有明顯改善，其中補(bǔ)土雅解方高、中劑量組Lactobacillus占比顯著上升（P＜0.01、P＜0.05）。詳見表5，圖5。

表5 大鼠糞便在屬水平分類上的優(yōu)勢(shì)菌群（±s，n=3）

表5 大鼠糞便在屬水平分類上的優(yōu)勢(shì)菌群（±s，n=3）

注：與空白相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

Enterobacter（%）0.63±0.14 2.08±1.74 1.03±0.68 0.55±0.01 0.84±0.42 1.31±0.68組別空白組模型組陽性藥組補(bǔ)土雅解方高劑量組補(bǔ)土雅解方中劑量組補(bǔ)土雅解方低劑量組Lactobacillus（%）77.50±4.46 42.67±8.45**60.92±17.83 74.81±8.10##69.16±3.52#56.30±1.61 Sphingomonas（%）1.32±1.03 4.69±5.39 3.84±4.45 1.41±1.52 1.62±1.25 4.31±3.30 Pseudomonas（%）1.00±0.14 2.13±0.83 1.32±0.75 0.89±0.23 1.13±0.32 1.86±0.83

4 討論

ADD 是由于抗生素濫用使得腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)紊亂、屏障破壞，所引起的以腹瀉為主要癥狀的臨床常見并發(fā)癥[14]。傣醫(yī)由于先民聚居地域的特殊性，對(duì)“毒”有著深刻的認(rèn)識(shí)，且逐漸形成其特有的“雅解”理論[15]。傣醫(yī)認(rèn)為ADD 歸屬于“藥物毒”范疇，是由于藥物使用不當(dāng)致使四塔中土塔不足從而引發(fā)的藥物毒性相關(guān)疾病，服用雅解（解藥）可排除毒素，改善四塔五蘊(yùn)之平衡。土塔作為傣醫(yī)四塔中最重要的一塔，具有消化飲食物，化生氣血，滋養(yǎng)軀體，排泄糟粕的功能，其病變將協(xié)調(diào)體內(nèi)臟腑組織器官的功能障礙，進(jìn)而引起人體內(nèi)“四塔、五蘊(yùn)”的失衡[16]。西雙版納傣醫(yī)院制劑“雅解沙把”作為雅解方的代表藥方，已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可有效改善腸道菌群，用于治療解食物毒、過敏等等[17-21]。而補(bǔ)土雅解方在雅解沙巴的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥味加減，由大黃藤、竹葉蘭、姜味草、馬蹄香等組成，具有調(diào)補(bǔ)土塔，收斂止瀉的功效。補(bǔ)土雅解方是傣醫(yī)臨床診療疾病過程的記載和臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，在治療ADD 引起的腸道屏障受損上有很好的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。AAD 的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，其可能與腸道黏膜損傷引起的機(jī)械屏障破壞、腸壁內(nèi)的免疫細(xì)胞及腸腔中的免疫球蛋白形成的免疫屏障破壞、腸道內(nèi)正常的菌群結(jié)構(gòu)破壞引起的腸道菌群失調(diào)等有關(guān)[22]。因此，本研究通過鹽酸林可霉素灌胃復(fù)制AAD損傷大鼠模型，基于腸道微生物從機(jī)械屏障、免疫屏障以及微生物屏障3 個(gè)方面，明確補(bǔ)土雅解方對(duì)藥物的解毒作用，探討其初步作用機(jī)制。

抗生素的濫用不僅抑制腸道內(nèi)生理性細(xì)菌活性，其導(dǎo)致的毒副作用和變態(tài)反應(yīng)也將直接損傷腸道黏膜屏障，使腸道上皮細(xì)胞功能紊亂、通透性增加，誘發(fā)腹瀉等癥狀[23-24]。當(dāng)腸道內(nèi)糞便含水量增加時(shí)，將進(jìn)一步刺激腸道黏膜，加重腸道屏障受損[25]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ADD 大鼠腹瀉癥狀明顯，如飲水量增加、糞便顏色變淺且稀軟不成型。補(bǔ)土雅解方干預(yù)后大鼠飲水量明顯減少、糞便逐漸成形，給藥結(jié)束后已無明顯腹瀉癥狀。

機(jī)械屏障、免疫屏障、微生物屏障共同構(gòu)成的腸道屏障在防止病原體入侵機(jī)體中起到關(guān)鍵作用，可有效防止有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體內(nèi)循環(huán)造成損害[26]。通過灌胃鹽酸林可霉素復(fù)制模型，造模時(shí)間短、模型穩(wěn)定，其誘導(dǎo)的ADD 嚴(yán)重破壞了腸道機(jī)械屏障、免疫屏障、微生物屏障[27]。

然而，腸黏膜是否完好是評(píng)價(jià)腸道機(jī)械屏障受損的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，通過HE 染色結(jié)果可知在造模成功后腸黏膜組織嚴(yán)重受損，而經(jīng)過補(bǔ)土雅解方治療病理改變明顯改善。同時(shí)DAO、MPO、LPS等腸黏膜受損的血漿標(biāo)志物將因?yàn)槠琳鲜軗p而大量釋放進(jìn)入血液[28]。DAO 是一種高活性的胺類細(xì)胞內(nèi)酶，常存在于腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞中。當(dāng)黏膜屏障受損時(shí)，DAO被腸黏膜細(xì)胞間隙內(nèi)血管和淋巴管所吸收，導(dǎo)致血液中其含量急劇上升[29]。MPO 作為炎癥浸潤的重要標(biāo)志，黏膜完整性破壞后激發(fā)腸道內(nèi)炎癥造成其高表達(dá)，同時(shí)由于腸壁通透性增加使得大量MPO 進(jìn)入血液[30]。LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，其通過損傷的腸道屏障進(jìn)入血液，不僅將誘導(dǎo)腸壁炎癥，還可能造成內(nèi)毒素血癥[31]。同時(shí)，檢測(cè)LPS 不僅可以反映腸道黏膜屏障破壞程度，還能提示厭氧菌對(duì)腸道細(xì)菌移位的抑制作用減弱。腸道機(jī)械屏障完整性的破壞將使得腸腔內(nèi)的細(xì)菌越過腸黏膜屏障，進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)、門靜脈系統(tǒng)，繼而進(jìn)入體循環(huán)以及肝、脾、肺等遠(yuǎn)隔器官，這一過程稱為菌群移位[32]。腸道細(xì)菌移位是腸道黏膜功能障礙的突出表現(xiàn)，檢測(cè)腸道細(xì)菌移位可以反映腸黏膜的整體屏障功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組血液中的DAO、MPO、LPS含量明顯上升，腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、肝臟的菌落數(shù)量均顯著增多，提示ADD 造成腸道機(jī)械屏障嚴(yán)重受損。經(jīng)過補(bǔ)土雅解方治療后，其完整性明顯改善黏膜組織病變。

腸道免疫屏障是以腸道內(nèi)漿細(xì)胞sIgA 為主導(dǎo)的體液免疫，不僅能與病原體結(jié)合通過腸胃蠕動(dòng)等方式排出，還可中和腸內(nèi)毒素，雙重阻礙腸道黏膜與病原體的直接接觸[33]。sIgA 是維持腸黏膜表面內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要免疫防御因子[34]。作為防御致病菌在腸黏膜表面粘附定植的第一道防線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)土雅解方治療后可以升高sIgA 的含量，修復(fù)腸道黏膜損傷，保護(hù)腸道免疫屏障。

腸道微生物群由數(shù)百種細(xì)菌組成，是決定宿主健康狀況的重要因素。濫用或不當(dāng)使用抗生素可能會(huì)改變腸道微生物群的結(jié)構(gòu)，破壞微生物平衡，從而導(dǎo)致宿主潛在的臨床并發(fā)癥[35]。健康的腸道菌群有助于保護(hù)腸黏膜、預(yù)防病原體和調(diào)節(jié)宿主免疫力[36]。相反，腸道菌群失調(diào)直接或間接損害人體的生理和免疫功能，導(dǎo)致腹瀉等副作用[37]。Firmicutes是產(chǎn)生乳糖酶的主要門類，AAD 將使得乳糖酶活性顯著降低[38-39]。而Bacteroidetes和Proteobacteria中包含的細(xì)菌是常見的腸道相關(guān)微生物，具有相對(duì)較高的引起腹瀉疾病的風(fēng)險(xiǎn)，并且與炎性細(xì)胞因子呈負(fù)相關(guān)[40]。 Firmicutes/Bacteroidetes的比率通常用于評(píng)估患者的各種腸病，如腸易激綜合征、炎癥性腸病和代謝性疾病[41-42]。Lactobacillus被公認(rèn)為益生菌，可產(chǎn)生乳酸改善腸道環(huán)境，防止有害細(xì)菌的粘附和分泌乳糖酶分解乳糖[43]。有研究證實(shí)在抗生素腹瀉小鼠模型中Pseudomonas、Enterobacter乳糖酶基因表達(dá)顯著增加，是引起ADD 的重要病原體[44]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)土雅解方治療后在門水平上主要通過升高Firmicutes 豐度和Firmicutes/Bacteroidetes 比 值，同 時(shí) 降 低 Bacteroidetes 和Proteobacteria 豐度來調(diào)節(jié)ADD 大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)。在屬水平上，ADD大鼠Lactobacillus菌群比例明顯降低，Sphingomonas、Pseudomonas、Enterobacter菌群比例顯著升高，補(bǔ)土雅解方可有效糾正上述菌群比例失調(diào)現(xiàn)象。

綜上所述，補(bǔ)土雅解方對(duì)腸道三大屏障具有顯著保護(hù)作用，主要通過保護(hù)腸道黏膜屏障的完整性來調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，其具體機(jī)制與降低腸道黏膜通透性、減少腸道菌群移位、保護(hù)腸道免疫屏障、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性、改善腸道微生態(tài)紊亂有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以“雅解”理論為指導(dǎo)，進(jìn)一步明確其科學(xué)內(nèi)涵，豐富了傣醫(yī)的基礎(chǔ)理論，為民族藥新藥研究開發(fā)和臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。