電針對薄型子宮內膜模型大鼠蛻膜巨噬細胞M1/M2極化水平調節的效應研究＊

楊 濱，潘 妍，金純純，沈真如，席 瑾，程 潔，夏有兵，2＊＊

（1.南京中醫藥大學針灸推拿·養生康復學院 南京 210046；2.徐州醫科大學 徐州 221046）

妊娠期女性于排卵日子宮內膜厚度小于7 mm 可被定義為薄型子宮內膜[1-2]。薄型子宮內膜很大程度上影響胚胎著床的成功率，進而降低孕齡女性的妊娠率。研究表明，在接受輔助生殖技術的患者中，薄型子宮內膜的發生率約為5%[3]。甚至有的生殖中心會在子宮內膜厚度小于7 mm時建議取消移植[4]。

薄型子宮內膜嚴重影響子宮內膜蛻膜化的水平。子宮內膜蛻膜化是間質細胞、腺體、免疫細胞等為胚胎著床而進行的一系列生理變化，是胚胎成功著床的必要條件[5]。在蛻膜化過程中子宮內膜間質細胞以及卵巢顆粒細胞分泌大量IGFBP-1 并促進子宮內膜間質細胞有絲分裂[6-7]。因此IGFBP-1 被認作是蛻膜化的標志物。在上述生理變化中，免疫細胞的調節顯得尤為重要[8]，其中高表達小鼠含生長因子樣模體粘液樣激素樣受體（Mouse EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1，EMR1 又稱F4/80）與分化簇11b（Cluster of differentiation 11b，CD11b）標志物的巨噬細胞為免疫細胞中的第二大群體，發揮著不可替代的作用[9]。巨噬細胞根據其表型和功能可以分為經典激活（M1）和交替激活（M2）兩種亞型[10]。M1型巨噬細胞以高水平表達CD86 為主，過多的M1 型巨噬細胞能導致一系列不良的妊娠結局；而M2 型巨噬細胞則以表達CD206 為主，過多的M2 型巨噬細胞能促進蛻膜化的進行，有助于妊娠過程順利的進行[11-12]。電針療法已經成為輔助生殖領域中重要的一種治療手段[13]，與此同時電針療法也能有效地調節各個組織中巨噬細胞的極化水平，如肺泡組織[14]、關節滑囊[15]、氣管[16]、白色脂肪組織[17]等。雖然上述因素之間都有一定的相關性，但鮮有研究探索電針、薄型子宮內膜和蛻膜巨噬細胞極化三者之間的關系。本研究通過電針薄型子宮內膜模型大鼠的“關元”、“子宮”、“三陰交”，探究其對蛻膜巨噬細胞極化水平的調節以及與改善子宮內膜厚度之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

未交配過的健康SPF 級雌性SD 大鼠60 只，體質量（220±20）g，8-10 周齡，隨機分為空白組、模型組、電針組，每組各20只；健康SPF級雄性SD大鼠15只，體質量（260±20）g，用于動情期合籠，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（滬）2018-0006。晝夜交替節律各12 h，（22±2）℃，濕度55%±5%，自由攝食飲水。實驗過程中涉及的動物處置均符合2006 年國家科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，并通過南京中醫藥大學倫理委員會審查（202004A018）。

1.2 主要儀器與試劑

華佗牌電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；普通光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；吸入式氣體麻醉機（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（美國致微公司）；流式細胞儀（美國碧迪公司）；PCR儀（德國耶拿公司）；臺式高速冷凍離心機（德國海蒂詩公司）；優普超純水機（南京優普實驗儀器有限公司）；移液槍（美國賽默飛世爾公司）；計時器（菲亞斯家居制品有限公司）。

異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；無水乙醇（上海久億化學試劑有限公司）；“0”號手術線（上海浦東金環醫療用品有限公司）；1 mm注射器（上海金鐘手術器械有限公司）；4%多聚甲醛（寧波諾德生物科技公司）；F4/80 流式單克隆抗體（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，貨號：25-4801-82）；CD11b 流式抗體（美國碧迪公司，貨號：561684）；CD86 流式抗體（美國碧迪公司，貨號：551396）；CD206 流式抗體（美國碧迪公司，貨號：565250）；Ⅳ型膠原酶（上海源葉生物有限公司）；1640 培養基（美國HyClone 公司）；PCR 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；一次性無菌針灸針（0.25 mm×13 mm）（蘇州醫療用品廠有限公司）。

1.3 造模方法

參考文獻[18-19]以及課題組先前造模方法，于大鼠動情期制備薄型子宮內膜模型。雌性大鼠異氟烷麻醉后于子宮頸正上方約0.5 cm處行一長約1.0 cm的縱行切口。用鑷子將一側子宮分離后于兩端結扎防止95%乙醇損傷卵巢和陰道。95%乙醇注入單側子宮腔2 min 后吸出，并用生理鹽水沖洗。將子宮恢復至正常位置后逐層縫合。

1.4 干預方法

電針組大鼠麻醉后行電針干預，參照《實驗針灸學》[20]及《循證針灸治療學》[21]取“關元”穴，單側“子宮”穴，單側“三陰交”穴。“子宮”穴，“三陰交”穴接一對電極（每日一側，隔日交替），疏密波2/15 Hz，1 mA，持續15 min，每天1 次，連續干預4 個動情周期。空白組和模型組大鼠每日僅抓取麻醉。

1.5 觀察指標及檢測方法

各組大鼠干預結束后與雄鼠合籠，將觀察到陰道栓或是陰道涂片中觀察到精子作為妊娠第1 天，在妊娠第8天取材并對造模側子宮相關指標進行檢測。

1.5.1 動情周期檢測

適應性飼養1 周后，每天上午固定時間行陰道涂片，并于顯微鏡下觀察確定動情周期[22]：動情前期（Proestrus，P）視野中以大量有核上皮細胞為主，并伴有少量角化上皮細胞；動情期（Estrus，E）視野中滿是角化上皮細胞堆疊；動情后期（Metestrus，M）多為角化上皮細胞和白細胞；動情間期（Diestrus，DI）視野中可見大量白細胞。

1.5.2 HE 染色觀察子宮內膜形態、厚度及腺體和血管數目

取各組大鼠造模側子宮，常規石蠟包埋，使用石蠟切片機將蠟塊切成4 μm石蠟切片，脫蠟至水，HE染色，脫水，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。

1.5.3 流式細胞術檢測巨噬細胞極化水平

將新鮮的子宮組織于冰上剪成直徑約1 mm 的團塊后放到含3 mL 0.1% IV 型膠原酶和1 mL 0.001%DNA 酶I 的1640 培養基中，置于37℃，5% CO2恒溫培養箱中消化40 min。消化液經100 μm 濾網過濾后制成單細胞懸液，用淋巴細胞分離液分離出單核細胞。避光條件下各組加入相應的流式抗體：F4/80 流式單克隆抗體；CD11b流式抗體；CD86流式抗體；CD206流式抗體，1 μL，室溫孵育15 min，最后經2500 r·min-1離心5 min后棄上清，加入1 mL含2%胎牛血清的PBS上機檢測。陰性染色用于篩選各組中陰性的細胞群體，F4/80 與CD11b 用于篩選出單核細胞中的巨噬細胞，CD86與CD206用于鑒定巨噬細胞的亞型。

1.5.4 qRT-PCR 檢測子宮內膜中IGFBP-1、CD86 及CD206 mRNA表達量

于冰上刮取子宮內膜組織，每100 mg 組織加入1 mL 總RNA 提取液。使用超微紫外可見分光光度計測定RNA濃度與純度，使用PCR試劑盒去除殘留基因組DNA并進行逆轉錄，最后于PCR 反應器中進行PCR擴增。擴增條件為：升溫（95℃，5 min，循環1次）、擴增（①95℃，10 s，②60℃，20 s，③72℃，20 s，循環40 次）、退火（①95℃，1 min，②55℃，30 s，③95℃，30 s，循環1 次）。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，引物序列見表1，數據處理采用2-ΔΔCT法。、

1.6 統計學方法

測得的實驗數據中滿足正態分布的實驗數據使用均值±標準差（±s）來表示。采用單因素方差分析比較各組間數據，若方差齊性則采用LSD 法，若方差不齊則改為Dunnett's T3 法。不符合正態分布的等級資料與計量資料采用中位數、下四分位數、上四分位數表示，組間兩兩比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠動情周期比較

空白組大鼠動情周期規律，每個時相持續時間穩定。與空白組大鼠相比，模型組大鼠動情周期紊亂，動情期出現次數減少，動情后期與動情間期持續時間增加。與模型組大鼠相比電針組大鼠動情周期稍有恢復，動情期出現的頻率有所增加，動情后期與動情間期持續的時間較模型組大鼠稍有減少。見圖1。

圖1 各組大鼠動情周期比較

2.2 各組大鼠胚胎著床個數比較

與空白組相比，模型組大鼠造模側子宮中幾乎無胚胎著床（P＜0.01）；與模型組相比，電針組大鼠造模側子宮中著床胚胎數量明顯增加（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠胚胎著床個數比較

2.3 各組大鼠子宮內膜形態、厚度、腺體和血管數的比較

空白組大鼠子宮內膜表面呈規律褶皺，上皮層、內膜層與漿膜層分界明顯，各層細胞排列整齊規律、形態完整、無水腫；子宮內膜厚度較厚；腺體與血管豐富。與空白組相比，模型組大鼠子宮內膜全層變薄，內膜完整性遭破壞，細胞排列變的無序，形態趨于扁平；子宮內膜厚度明顯降低（P＜0.01）；腺體數目及血管數目均減少（P＜0.01）。與模型組相比，電針組大鼠子宮內膜形態有所恢復；子宮內膜厚度提升（P＜0.01）；腺體及血管數目均增加（P＜0.01）。見圖3，圖4。

圖3 各組大鼠子宮內膜形態比較

圖4 各組大鼠子宮內膜厚度，腺體和血管數目比較

2.4 各組大鼠蛻膜巨噬細胞極化水平比較

與空白組相比，模型組大鼠子宮內膜中蛻膜巨噬細胞以M1 型巨噬細胞為主，M2 與M1 型巨噬細胞的比值明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，電針組大鼠子宮內膜中蛻膜巨噬細胞以M2 型巨噬細胞為主，M2 與M1 型巨噬細胞的比值明顯升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠蛻膜巨噬細胞極化水平比較

2.5 各組大鼠子宮內膜IGFBP-1、CD86 及CD206 mRNA表達比較

與空白組相比，模型組大鼠子宮內膜中IGFBP-1 mRNA 表達量明顯下降（P＜0.01），CD86 mRNA 表達量明顯上升（P＜0.01），CD206 mRNA 表達量明顯下降（P＜0.01）。與模型組相比，電針組大鼠子宮內膜中IGFBP-1 mRNA 表 達 量 明 顯 上 升（P＜0.01），CD86 mRNA 表達量明顯下降（P＜0.05），CD206 mRNA 表達量明顯上升（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組大鼠子宮內膜IGFBP-1、CD86及CD206 mRNA表達比較

3 討論

薄型子宮內膜子宮間質細胞大量減少而導致以間質細胞增殖分化為主的蛻膜化進程受阻。而子宮內膜蛻膜化是子宮內膜接受胚胎所必須的過程[23]。電針的治療使模型組大鼠子宮內膜厚度與組織形態得到明顯改善，同時子宮內膜中IGFBP-1 的表達水平明顯上升，表明電針對薄型子宮內膜有顯著的修復作用并且促進了子宮內膜的蛻膜化水平，最終改善了胚胎著床的情況。在蛻膜化過程中，兩種不同亞型的巨噬細胞分別發揮著不同的作用[24]。M1 型巨噬細胞主要以CD86 為表面標記物，其對機體外來物能產生最大的細胞毒性和炎癥能力；M2型巨噬細胞主要以CD206為表面標記物，其對組織重塑以及免疫抑制起到關鍵作用[25]。在子宮內膜中分離出的單核細胞通過表面抗體F4/80 與CD11b 確定了巨噬細胞群體，通過M1 與M2 型巨噬細胞各自的表面標記物CD86 與CD206 對兩種亞型的巨噬細胞數量進行比較后發現電針能使巨噬細胞極化水平朝M2方向偏移。

已有諸多研究證實了電針對全身各個組織的巨噬細胞均有調節作用，也有關于電針對薄型子宮內膜的治療的研究[19,26]。本研究著眼于電針對子宮內膜組織蛻膜巨噬細胞的調節，發現電針“關元”，“子宮”，“三陰交”可以調節子宮內膜蛻膜巨噬細胞的極化水平，使蛻膜巨噬細胞朝M2 方向極化。M2 型巨噬細胞有促進組織再生與免疫抑制的功能，大量的M2 型巨噬細胞加快了薄型子宮內膜修復的進程，使子宮內膜間質細胞數目，腺體數目以及血管數目都有所增加。而蛻膜化的過程主要包括了子宮內膜間質細胞的增殖分化、腺體的分泌等，故電針在改善蛻膜巨噬細胞極化水平的同時促進了蛻膜化的進程。另一方面，M2型巨噬細胞能抑制機體的免疫反應，大量的M2 型巨噬細胞確保了胚胎不受母體免疫反應的攻擊，能夠順利在子宮著床，這也是電針后著床胚胎數量增加的原因之一。

以往的研究雖然證實電針對薄型子宮內膜有一定的修復作用[27]，但是薄型子宮內膜患者想要解決的首要問題是胚胎無法順利著床。過去的研究通常只關注電針對薄型子宮內膜的修復作用，忽視了對于妊娠結局的研究。本實驗通過對薄型子宮內膜模型大鼠進行電針干預，觀察其子宮中胚胎數量、子宮內膜修復情況以及蛻膜巨噬細胞極化水平，不僅將目光聚焦于電針對薄型子宮內膜修復作用，同時也探討了電針對妊娠結局改善的作用，對內膜因素導致的不孕癥的臨床治療更有指導意義。蛻膜巨噬細胞的極化水平是決定妊娠結局的重要因素[28]，目前對蛻膜巨噬細胞的研究十分有限，仍然存在研究的空白。目前已有大量的研究證明電針對全身各個組織中巨噬細胞極化有明確的調節作用[14-17]，但是鮮有研究探索電針對蛻膜巨噬細胞極化水平的調節作用。本研究創新性的將這兩方面進行結合，填補了該領域的研究空白。在與西醫療法的療效比較中，電針與激素替代療法均能有效地促進薄型子宮內膜修復[29]，但激素替代療法無法調節蛻膜巨噬細胞的極化水平，在這方面電針具有相對優勢。

目前對于薄型子宮內膜的治療臨床大多采用激素替代療法，但是對雌激素的使用劑量以及應用情況尚未達成共識。此外，激素療法對肝腎功能有一定的損傷，若長期、大量服用激素藥物可能導致肝腎功能損害、雌激素依賴性腫瘤、動靜脈栓塞等風險[27,29]。電針療法近年來作為輔助生殖的重要治療方法在對薄型子宮內膜的治療方面起了重要的作用[30]。與激素療法相比，電針療法不僅能有效地避免激素療法副作用，還能減少患者的經濟負擔。更重要的是，電針療法調節了蛻膜巨噬細胞極化水平，使M2 型巨噬細胞數量明顯增多，其免疫抑制以及促進組織重塑的功能有效的幫助胚胎的著床，而常規的激素替代療法無法實現對蛻膜巨噬細胞極化水平的調節，更值得臨床推廣。本實驗的結論為電針療法在內膜因素相關不孕癥的臨床推廣應用提供了新的科學依據，也進一步豐富電針治療不孕癥的理論依據。

綜上，電針對子宮內膜中蛻膜巨噬細胞極化水平具有調節作用，同時能促進薄型子宮內膜的修復，有利于胚胎著床。其作用可能是電針通過調節細胞之間的免疫調節網絡，影響相應的細胞因子的分泌實現的[31]，其相關調節機制仍有待深入研究，同時臨床數據的收集也有待在后續試驗中進行。