HPLC-GC聯(lián)用技術(shù)的原理與儀器發(fā)展

郭凌霄 李良良 王敏

山東天弘化學(xué)有限公司 山東 東營 257000

在眾多二維色譜技術(shù)中，將高效液相色譜（HPLC）與毛細(xì)管氣相色譜（GC）相結(jié)合是一種有前景的聯(lián)用技術(shù)，同時(shí)這種技術(shù)由于存在兩相的變化（液相到氣相）也具有很大的技術(shù)挑戰(zhàn)。1980年Majors[1]報(bào)道了第一臺(tái)HPLC-GC多維色譜[123]，但由于其效果并不理想沒有被推廣（圖1）。隨后經(jīng)過多代的改進(jìn)，HPLC-GC多維色譜已經(jīng)成為了在分離和分析過程中非常重要的一類方法。本文對(duì)于這類聯(lián)用儀器的關(guān)鍵技術(shù)和設(shè)計(jì)部件進(jìn)行了概述，并簡單介紹其在石油化工等領(lǐng)域的應(yīng)用。

圖1 第一個(gè)HPLC-GC儀器示意圖

相較于傳統(tǒng)的制備分離手段，HPLC-GC有著非常大的優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)在分離效率高、檢測(cè)限低、樣品處理簡便和檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性高：（1）對(duì)于未知樣品的分析是比較困難的，干擾物質(zhì)越多就越難以分離。HPLC和毛細(xì)管GC有著強(qiáng)大的分離能力，相較于傳統(tǒng)的分離手法， 通過HPLC將樣品按照不同類型化合物進(jìn)行分離后再利用GC來對(duì)于某一感興趣的物質(zhì)進(jìn)行分析可以大大提高分離效率。（2）預(yù)分離效率的提高不僅可用于復(fù)雜混合物的分離，也可用于痕量分析中雜質(zhì)的清除。在其他情況下，幾個(gè)傳統(tǒng)的清理雜質(zhì)步驟可以被一個(gè)步驟所取代， 從而提供更可靠的分析結(jié)果和更低的檢出限。（3）樣品制備通常是分析過程中最耗費(fèi)勞力的部分，因此也是最昂貴的部分。自動(dòng)聯(lián)機(jī)程序?qū)嶋H上可以減輕這項(xiàng)工作，并使過程更加可靠。（4）HPLC-GC可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分離，相比于繁瑣的傳統(tǒng)分離技術(shù)中各種不可控因素的引入，通過在不同時(shí)間多次測(cè)定已經(jīng)證明其具有高的重現(xiàn)性。

1 GC 中的溶劑蒸發(fā)

1.1 樣品的富集

HPLC-GC中最關(guān)鍵的部分便是如何將HPLC的洗脫溶劑蒸發(fā)注入到GC中。由于揮發(fā)會(huì)產(chǎn)生較大的峰展寬，為了減小峰的展寬，一般通過兩個(gè)基本原理來實(shí)現(xiàn)：溶劑捕獲和保留隘口效應(yīng)。

溶劑捕獲是指進(jìn)入到GC中的淋洗液由載氣向前推動(dòng)，會(huì)在毛細(xì)管壁上留下一層不規(guī)則的液體膜，直到液體全部擴(kuò)散。這層膜具有相應(yīng)的高保留能力，可以有效的捕獲揮發(fā)性的樣品組分。加熱時(shí)溶劑的揮發(fā)幾乎只發(fā)生在液膜的后端，使載氣迅速被溶劑蒸氣飽和。高沸點(diǎn)的樣品組分會(huì)趁機(jī)在干燥的毛細(xì)管壁上，而低沸點(diǎn)組分則會(huì)蒸發(fā)并重新被前端的溶劑液膜捕獲。不斷重復(fù)此過程，直到溶劑的最后一部分蒸發(fā)，所捕獲的大量揮發(fā)性溶劑會(huì)一同釋放（圖2，a）。首先，由于使溶劑部分蒸發(fā)，所以只有比溶劑更容易揮發(fā)的組分會(huì)造成損失，所以溶劑捕獲并不適用于這類樣品。其次，不管前期蒸發(fā)速率如何，揮發(fā)性溶質(zhì)總會(huì)在最后一刻跟隨溶劑一同釋放，這就意味著開始蒸發(fā)與結(jié)束之間會(huì)存在相應(yīng)的延遲，這對(duì)于蒸氣排除和檢測(cè)器的檢測(cè)提出要求。最后，由于此技術(shù)要求柱溫較低，所以高沸點(diǎn)溶質(zhì)不會(huì)蒸發(fā)，而是在毛細(xì)管壁形成一條和初始長度一致的淹沒區(qū)條帶，所以也不實(shí)用于高沸點(diǎn)組分，這樣就應(yīng)用到了保留隘口效應(yīng)。

圖2 （a）溶劑捕獲示意圖 （b）保留隘口效應(yīng)示意圖

保留隘口效應(yīng)是指將淹沒區(qū)放入未包被的預(yù)柱中，由于預(yù)柱的保留能力低于分離柱，因此組分可以通過更高的速度或遠(yuǎn)低于分離柱洗脫溫度下通過該預(yù)柱。溶質(zhì)進(jìn)入分離柱，由于溫度過低，且分離柱的保留能力較強(qiáng)，于是實(shí)現(xiàn)了溶劑在住口固定相的富集，直到升高烘箱溫度到正常洗脫溫度（圖2，b）。未包被的預(yù)柱必須具有足夠的惰性，以免吸附溶質(zhì)，但也不應(yīng)該失去保留能力，表面必須可被溶劑潤濕，以便形成連續(xù)膜：非潤濕溶液（例如許多反相淋洗液）會(huì)在管壁留下液滴，并且可能通過整個(gè)預(yù)柱滑入分離柱。

1.2 蒸氣排出

溶劑蒸發(fā)形成大量的蒸氣，若以正常柱流速將它們排出整個(gè)色譜柱非常耗時(shí)，同時(shí)為了保護(hù)檢測(cè)器，需要將溶劑蒸氣提前排出。目前有兩種排出方法：通過程序溫度氣化（PTV）進(jìn)樣器的分流出口釋放蒸氣和通過安裝在預(yù)柱和分離柱之間的溶劑蒸氣出口釋放。

1.3 蒸發(fā)模式

限制蒸發(fā)模式的因素主要有溶劑的蒸發(fā)、溶質(zhì)峰的銳化等，并通過上述的溶劑富集模式來設(shè)計(jì)[2]。

溶劑同時(shí)氣化法（Concurrent eluent evaporation）為蒸發(fā)速率大于注入速率，所有溶劑到達(dá)蒸發(fā)位點(diǎn)便會(huì)氣化（圖3，a）。此方法不需要大的未包被的預(yù)柱來捕獲溶質(zhì)，所以不受預(yù)柱長度的限制，可以實(shí)現(xiàn)大量的溶劑氣化，適合于傳輸大體積的HPLC流分，1985年該技術(shù)引入了多大10 mL的己烷溶液，若使用蒸氣出口，則該體積增加到20 mL。由于需要同時(shí)將所有溶劑氣化，所以氣化溫度一般較高，會(huì)使較多的揮發(fā)性溶劑被提前帶出，造成峰展寬和從蒸氣排出口排出而造成損失。為了降低峰展寬，在50 cm的預(yù)柱范圍內(nèi)，設(shè)置一個(gè)10-20 cm的溫度較低的淹沒區(qū)來捕獲溶劑，溶劑的蒸發(fā)受供熱控制，發(fā)生在整個(gè)淹沒區(qū)。由于其操作簡單方便，所以是最常用的一種蒸發(fā)模式。

圖3 （a）溶劑同時(shí)蒸發(fā)模式裝置圖（b）部分溶劑同時(shí)蒸發(fā)模式裝置圖（c）共溶劑效應(yīng)示意圖

部分溶劑同時(shí)氣化法（Partially concurrent eluent evaporation）為控制溶劑的蒸發(fā)速度和流速的比例，使大部分的溶劑揮發(fā)而少量溶劑保留（圖3，b）。由于溶劑捕獲的方法需要較長的預(yù)柱（若轉(zhuǎn)移270 μL溶液則需50 m×0.32 mm的未包被的預(yù)柱），而采用此方法則可以大大減少所需預(yù)柱的長度同時(shí)也能夠保證溶質(zhì)捕獲（若轉(zhuǎn)移1～2 mL溶液只需要10 m×0.53 mm預(yù)柱，其蒸發(fā)比例為75%）。在未包被的預(yù)柱后再加一段包被的預(yù)柱可以同時(shí)應(yīng)用到保留隘口技術(shù)來減小峰展寬。

為了綜合這兩種模式的優(yōu)點(diǎn)，Grob等[4]將復(fù)合溶劑效用與溶劑同時(shí)氣化法相結(jié)合，設(shè)計(jì)了一種新型的蒸發(fā)模式（圖3，c）。其方法將少量的高沸點(diǎn)溶劑加入到洗脫劑中，主洗脫劑為低沸點(diǎn)溶劑。再氣化過程中輔助溶劑起著溶劑捕獲作用，彌補(bǔ)了溶劑同時(shí)氣化法的不足。在該方法中，氣化主要發(fā)生在流分的前端，低沸點(diǎn)溶劑被蒸發(fā)，而高沸點(diǎn)溶劑則潤濕在前端的管壁上，采用溶劑同時(shí)氣化法產(chǎn)生的溶質(zhì)蒸氣被高沸點(diǎn)溶劑液膜所捕獲。

2 HPLC-GC 接口

2.1 柱上接口

柱上接口一般與部分溶劑同時(shí)氣化法配合使用（圖3，b）。一個(gè)直徑為0.11 mm /外徑為0.17 mm的熔融二氧化硅毛細(xì)管將來自轉(zhuǎn)移開關(guān)閥的洗脫液輸送到未包被的預(yù)柱里，就像柱上進(jìn)樣的注射器針一樣，但它不能移動(dòng)和拔出。在傳輸結(jié)束時(shí)，通過安裝在傳輸閥上的限制器，將該管線與載氣反沖洗。該接口一直用于部分溶劑氣化，后來也可用于同時(shí)溶劑氣化法，但在2009年被Y型界面所取代。

2.2 環(huán)型接口

環(huán)形接口常用于溶劑同時(shí)氣化法（圖3，a），是第一臺(tái)商用的on-line HPLC-GC儀器上的接口，也是應(yīng)用最廣泛的接口。在轉(zhuǎn)移閥中安裝一個(gè)與需轉(zhuǎn)移流分體積相適應(yīng)的回路，溶劑從HPLC洗脫至回路中，然后開啟閥門，由載氣推動(dòng)餾分進(jìn)入GC。烘箱溫度必須略高于溶劑沸點(diǎn)，以形成一個(gè)蒸汽壓，使液體停留在烘箱恒溫預(yù)柱的入口。此時(shí)蒸氣壓與載氣的壓力相同，從而使流入速率等于蒸發(fā)速率。

2.3 程序溫度氣化（PTV）注射器

PTV進(jìn)樣器主要用于大體積進(jìn)樣。Villen等人將自動(dòng)化的TOTDA接口應(yīng)用到反相HPLC-GC中（圖4，a），大量反相HPLC淋洗液泵入裝有吸附劑的PTV室中，分別從兩側(cè)泵入高流量的氦氣。在低溫下（40℃）將溶劑排出，并在高溫下（250℃）將吸附的待測(cè)物釋放到GC中檢測(cè)。

圖4 （a）反相HPLC-GC中的自動(dòng)化TOTAD接口（b）Y型接口示意圖

另一種基于PTV的接口將HPLC的流分送入流通池中，自動(dòng)進(jìn)樣器從流通池中手機(jī)管興趣的部分并注入PTV中，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)接。

2.4 Y 型接口

Y型接口與柱上接口不同，載氣管路和轉(zhuǎn)移閥管路連接在一個(gè)壓接的Y形元件中（圖4，b）。Y形元件位于氣相色譜爐上方，載氣通過熔融二氧化硅毛細(xì)管送入Y形元件，預(yù)柱的入口穿過烘箱的頂部進(jìn)入Y形管的主管。

3 結(jié)論

HPLC-GC聯(lián)用有著重要的應(yīng)用前景，并在石油、食品等領(lǐng)域有著不可或缺的用處。相較于其他的分析方法，HPLC-GC有著分離效率高、檢測(cè)限低、樣品處理簡便和檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在著如何將液體氣化的技術(shù)困難。本文主要介紹了HPLC-GC聯(lián)用技術(shù)中的蒸發(fā)方法和接口設(shè)計(jì)。通過溶質(zhì)捕獲和保留隘口效益可以有效的減小溶質(zhì)峰的展寬，這兩種技術(shù)被廣泛應(yīng)用在了儀器設(shè)計(jì)中。溶劑蒸發(fā)主要有溶劑同時(shí)蒸發(fā)和部分溶劑同時(shí)蒸發(fā)兩種技術(shù)，前者適用于大的進(jìn)樣量，但會(huì)產(chǎn)生較大的展寬，后者則需要較長的預(yù)柱。為了解決這個(gè)問題，利用復(fù)合溶劑效應(yīng)的蒸發(fā)方法被開發(fā)出來，利用輔助溶劑來捕獲溶質(zhì)。為了匹配各種蒸發(fā)模式，各類不同接口也被設(shè)計(jì)。

盡管HPLC-GC聯(lián)用技術(shù)有著很大的應(yīng)用，但如何改進(jìn)其進(jìn)樣量和減小峰展寬是下一步的發(fā)展方向。同時(shí)，由于油相與水相有著不同的性質(zhì)，適用于正相色譜的技術(shù)并不能直接應(yīng)用到反相HPLC-GC中來，對(duì)于反相HPLC-GC的研究并不充分，如何拓展色譜的種類也成為了此領(lǐng)域發(fā)展必須考慮的因素。