新型抗菌藥G0775的合成新方法

趙文豪, 楊玉社, 孟 昕, 張銀勇*.

(1.南京中醫藥大學 新中藥學院,江蘇 南京 210023; 2.中國科學院 上海藥物研究所,上海 201203)

抗生素的過度使用和濫用導致細菌耐藥性迅速發展,這嚴重威脅了人類的健康,尤其是多重耐藥(Multi-drug resistance, MDR)和廣泛耐藥(Extensively drug resistant, XDR)革蘭氏陰性菌引起的感染,已成為全球衛生機構面臨的主要挑戰[1-4]。然而,具有全新結構和全新作用機制的抗生素研發工作卻相對滯后,這進一步助長了細菌耐藥性的出現和蔓延[5-7]。G0775(圖1),化學名為(4S,7S,10S)-10-(S)-4-氨基-(2-(2-(4-((叔丁基)苯基)-4-甲基嘧啶)-5-甲酰胺)-N-甲基丁酰胺)-16,26-雙(2-氨基乙氧基)-N-(氰甲基)-7-甲基-6,9-二氧代-5,8-二氮雜-1,2(1,3)-二苯環癸烷-4-甲酰胺[2],是由美國基因泰克PETER等研究人員通過對阿龍霉素結構改造發現的新型細菌信號肽酶I(Signal peptidaseI)抑制劑,結構新穎,作用機制獨特,對典型的臨床分離革蘭氏陰性菌(鮑曼不動桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌)具有強大的體內外抗菌活性,且對MDR和XDR病原體敏感[8-10],證明了其在應對多藥耐藥革蘭氏陰性菌日益增長的臨床威脅方面有著巨大的潛力。

圖1 G0775 的結構

G0775的文獻合成方法是以(S)-2-氨基-2-(4-羥基苯基)乙酸(I-7)為起始原料,經碘代、親核取代、Suzuki-Miyaura偶聯、縮合、水解和脫保護等[11-14]共22步反應制得目標產物G0775(圖2～3),總產率1.40%,中間體I-6是以(叔丁氧基羰基)-L-酪氨酸甲酯(I-1)為起始原料,經甲基化、碘代和親核取代等共5步反應得到,產率為63.61%。該方法最大缺點為線性路線步驟太長,操作繁瑣,總產率很低。

圖2 G0775的原合成路線(A和B)

圖3 G0775的原合成路線(C)

為解決上述路線存在的問題,本文重新設計了匯聚式的G0775的合成路線(圖4～5:如圖4所示,按文獻方法[15-17],(S)-2-氨基-2-(4-羥基苯基)乙酸(I-7)經過碘代、親核取代、Suzuki-Miyaura偶聯和縮合等共7步反應得到中間體甲基(4S,7S,10S)-26-芐氧基-10-((((芐氧基)羰基)甲基)氨基)-16-羥基-7-甲基-6,9-二氧代-5,8-二氮雜-1,2(1,3)-二苯環癸烷-4-羧酸甲酯(I-40),中間體I-33是以L-酪氨酸(I-29)為起始原料,經碘代,親核取代等共4步反應得到。本文設計以I-40為起始原料,經催化氫化、兩步親核取代反應得到中間體I-22,然后經脫保護,與(S)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-(2-(4-(叔丁基)苯基)-4-甲基嘧啶-5-甲酰氨基)丁酸(T4)(圖6)縮合,再經水解和縮合反應,最后氯化氫脫除Boc保護,共8步得到目標產物G0775(圖5)。本研究設計的新路線明顯更具收斂性,比文獻方法縮短7步反應,且操作更簡便,總產率大幅度提高,為該類分子的合成研究提供有益參考。

圖4 大環中間體I-40的合成路線

圖5 G0775新的合成路線

圖6 片段T4的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker-400/600 MHz型核磁共振儀(TMS為內標,CDCl3和(CD3)2SO為溶劑)、LTQ離子阱質譜儀、Q-TOF四極桿飛行時間質譜儀。

所用溶劑及試劑均為分析純,硅膠粉200～300目。

1.2 合成

(1) (S)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-(2-(4-(叔丁基)苯基)-4-甲基嘧啶-5-甲酰氨基)丁酸甲酯(T3)的合成

向100 mL茄形瓶中依次加入二氯甲烷20 mL和(S)-2-氨基-4-((叔丁氧羰基)氨基)丁酸甲酯鹽酸鹽2.0 g(7.44 mmol)、 2-(4-(叔丁基)苯基)-4-甲基嘧啶-5-羧酸[11](T2)2.6 g(9.67 mmol)、N,N-二異丙基乙胺3.8 g(29.76 mmol),在0 ℃條件下攪拌反應10 min后加入2-(7-氮雜苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯5.6 g(14.88 mmol),繼續0 ℃條件下攪拌1 h。反應結束,將反應混合物減壓濃縮,并將殘余物用乙酸乙酯150 mL溶解,依次用水、10%碳酸鈉水溶液和飽和食鹽水各150 mL洗滌有機層,有機層經無水硫酸鈉干燥,過濾,減壓濃縮得粗產物,經柱層析(洗脫劑:石油醚 ∶乙酸乙酯=1 ∶30～1 ∶10,V∶V)純化,得白色固體T33.4 g,產率95%;1H NMR(400 MHz, Chloroform-d6)δ: 8.87(s, 1H), 8.39(d,J=8.3 Hz, 2H), 7.52(d,J=8.4 Hz, 2H), 4.96～4.86(m, 1H), 3.80(s, 3H), 3.47(s, 1H), 3.18～3.04(m, 1H), 2.77(s, 3H), 2.22～1.99(m, 2H), 1.43(s, 9H), 1.38～1.36(m, 9H);13C NMR(151 MHz, Chloroform-d6)δ: 172.44, 166.58, 166.01, 165.06, 156.31, 155.58, 154.66, 134.27, 128.42(2C, overlap), 125.70(2C, overlap), 79.90, 52.81, 50.17, 36.52, 34.93, 32.63, 31.23(3C, overlap), 28.39(3C, overlap), 23.38; HR-MS(ESI)m/z: Exact mass calcd for C26H36N4O5{[M+H]+}485.2763, found 485.2758。

(2) (S)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-(2-(4-(叔丁基)苯基)-4-甲基嘧啶-5-甲酰氨基)丁酸(T4)的合成

向100 mL茄形瓶中依次加入四氫呋喃和水(1 ∶1,V∶V)的混合溶劑20 mL和(S)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-(2-(4-(叔丁基)苯基)嘧啶-5-甲酰氨基)丁酸甲酯(T3)2.7 g(5.58 mmol),隨后加入氫氧化鋰一水合物930 mg(22.32 mmol),混合物室溫下攪拌反應1 h,反應結束,向混合物中加入1 M硫酸氫鉀水溶液,直到pH達到5,用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取,合并有機層,然后用飽和食鹽水(2×50 mL)洗滌,有機層經無水硫酸鈉干燥,過濾,減壓濃縮得到白色固體T42.6 g,產率99%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.86(d,J=7.6 Hz, 1H), 8.78(s, 1H), 8.40～8.30(m, 2H), 7.60～7.52(m, 2H), 6.91(t,J=5.7 Hz, 1H), 4.44～4.26(m, 1H), 3.16～3.02(m, 2H), 2.62(s, 3H), 2.08～1.91(m, 2H), 1.38(s, 9H), 1.33(s, 9H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 175.13, 175.05, 166.93, 166.38, 164.70, 156.87, 155.44, 155.27, 154.71, 133.90, 128.41, 125.81, 125.59, 80.16, 50.80, 34.91, 32.47, 31.21(3C, overlap), 29.71, 28.34(3C, overlap), 23.22; HR-MS(ESI): Exact mass calcd for C25H34N4O5{[M+H]+}471.2603, found 471.2602。

(3)I-22的合成

室溫下向100 mL茄形瓶中依次加入N,N-二甲基乙酰胺20 mL、I-402.3 g(3.53 mmol)和10%的鈀碳230 mg,在50 ℃和常壓條件下進行催化氫化反應6 h后冷卻至室溫,將反應混合物過濾除去鈀碳,濾液無需進一步處理,隨后移至0 ℃環境下,依次加入氯甲酸芐酯604 mg(3.53 mmol)和三乙胺535 mg(5.30 mmol),并在0 ℃條件下反應12 h后加入2-溴乙基氨基甲酸叔丁酯5.5 g(24.70 mmol)、碳酸鉀7.3 g(52.95 mmol),并在80 ℃條件下反應7 h。反應結束,冷卻至室溫,將反應混合物用乙酸乙酯200 mL稀釋,用水(3×100 mL)和飽和食鹽水100 mL洗滌,有機層用無水硫酸鈉干燥,過濾,減壓濃縮得粗產物,經柱層析(洗脫劑:二氯甲烷 ∶甲醇=1∶30～1∶10,V∶V)純化,得白色固體2.7 g, 3步產率90%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.07(t,J=7.5 Hz, 1H), 8.45(dd,J=23.6 Hz, 9.1 Hz, 1H), 7.43～7.27(m, 5H), 7.16(t,J=9.9 Hz, 2H), 7.08(d,J=8.5 Hz, 1H), 7.02(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.75～6.58(m, 4H), 5.98(d,J=4.5 Hz, 1H), 4.85(s, 1H), 4.72(q,J=7.0 Hz, 1H), 4.07～3.91(m,J=21.2 Hz, 6.5 Hz, 4H), 3.69(s, 3H), 3.29～3.00(m, 6H), 2.59(d,J=14.3 Hz, 3H), 1.37～1.31(m, 18H), 1.16(dd,J=10.9 Hz, 6.7 Hz, 3H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 172.64, 172.50, 170.68, 170.64, 160.04, 156.68, 156.67, 156.11(2C, overlap), 155.95, 155.55, 154.50, 137.53, 137.37, 134.91, 134.75(2C, overlap), 131.19, 130.33, 130.18, 129.54, 128.90, 128.71, 128.66, 128.58, 128.31, 127.99, 127.16, 113.97, 113.59, 78.31, 78.28, 67.59, 67.40, 66.87, 66.46, 64.59, 61.44, 61.41, 52.81, 50.36, 47.98, 32.99, 32.97, 32.06, 28.62, 19.74, 19.61; HR-MS(ESI): Exact mass calcd for C44H58N5O12{[M+H]+}: 848.4073, found 848.4076。

(4)I-26的合成

室溫下向100 mL茄形瓶中,依次加入乙醇50 mL和I-222.6 g(3.07 mmol)、 10%的鈀碳260 mg和一滴30%的氨水溶液,在室溫和常壓條件下進行催化氫化反應6 h后將反應混合物過濾除去鈀碳,濾液減壓濃縮得白色固體,無需進一步處理,直接溶于20 mL的二氯甲烷,依次加入T42.2 g(4.60 mmol)、N,N-二異丙基乙胺1.2 g(9.21 mmol),在0 ℃條件下攪拌10 min后添加2-(7-氮雜苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯2.3 g(6.14 mmol),繼續在0 ℃條件下攪拌反應1 h。反應結束,將反應混合物減壓濃縮,并將殘余物用乙酸乙酯100 mL溶解,用水、10%碳酸鈉水溶液和飽和食鹽水各50 mL洗滌,有機層用無水硫酸鈉干燥、過濾,減壓濃縮得粗產物,經柱層析(洗脫劑:二氯甲烷 ∶甲醇=1∶30～1∶10,V∶V)純化,得白色固體I-263.0 g, 2步產率85%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.12～9.04(m, 1H), 8.98(d,J=7.2 Hz, 1H), 8.79(d,J=4.7 Hz, 1H), 8.45(d,J=8.9 Hz, 1H), 8.35(t,J=6.8 Hz, 2H), 7.57(dd,J=8.9 Hz, 3.5 Hz, 2H), 7.22～7.15(m, 1H), 7.11(s, 2H), 7.02(dd,J=12.3 Hz, 7.0 Hz, 2H), 6.75～6.61(m, 4H), 6.36(s, 1H), 4.92～4.65(m, 3H), 4.07～3.94(m, 4H), 3.69(s, 3H), 3.32(s, 1H), 3.25～2.96(m, 7H), 2.81(s, 2H), 2.65(d,J=5.8 Hz, 3H), 2.07～1.84(m, 2H), 1.34(q,J=2.7 Hz, 2.2 Hz, 32H), 1.27～1.10(m, 7H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 172.62, 172.51, 172.44, 170.37, 166.22, 165.53, 163.51, 156.27, 156.06, 155.95(2C, overlap), 155.53, 154.52, 154.47, 134.94, 134.45, 131.27, 129.98, 129.53, 128.97, 128.69, 128.51, 128.31(2C, overlap), 127.60, 126.03(3C, overlap), 114.02, 113.69, 78.30, 78.27, 78.00, 67.62, 59.49, 52.81, 50.43, 67.44, 48.33, 48.04, 37.14, 35.11, 33.04, 32.69, 31.45(4C, overlap), 30.78, 28.62(10C, overlap), 23.19, 19.75; HR-MS(ESI)m/z: Exact mass calcd for C61H84N9O14{[M+H]+}1166.6132, found 1166.6132。

(5)I-28的合成

室溫下向50 mL茄形瓶中依次加入四氫呋喃10 mL和I-263.0 g(2.57 mmol),隨后移至0 ℃,加入氫氧化鋰一水合物432 mg(10.28 mmol)的水溶液10 mL,將混合物在攪拌下逐漸加熱至室溫,并在室溫條件下攪拌反應1 h后加入1 M硫酸氫鉀水溶液,直到pH達到5,用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取,合并有機層,并用飽和食鹽水50 mL洗滌,有機層用無水硫酸鈉干燥、過濾,減壓濃縮得白色固體,無需進一步處理,直接溶于24 mL二氯甲烷,移至0 ℃,依次加入N,N-二異丙基乙胺996 mg(7.71 mmol),氨基乙腈鹽酸鹽359 mg(3.86 mmol),隨后添加2-(7-氮雜苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯2.0 g(5.14 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液4 mL,并在0 ℃條件下攪拌反應1 h。反應結束,將反應混合物減壓濃縮,并將殘余物用乙酸乙酯100 mL溶解,用水、10%碳酸鈉水溶液和飽和食鹽水各100 mL洗滌,有機層用無水硫酸鈉干燥、過濾,減壓濃縮得粗產物,經柱層析(洗脫劑:二氯甲烷 ∶甲醇=1 ∶30～1 ∶10,V∶V)純化,得白色固體I-282.8 g, 2步產率90%;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 9.01(d,J=7.7 Hz, 1H), 8.97(d,J=7.4 Hz, 1H), 8.79(d,J=6.3 Hz, 1H), 8.73～8.67(m, 2H), 8.39～8.33(m, 3H), 7.59～7.54(m, 2H), 7.22～7.16(m, 1H), 7.11(s, 2H), 7.06～6.96(m, 2H), 6.76～6.60(m, 4H), 6.36(s, 1H), 4.87～4.66(m, 3H), 4.17(t,J=4.8 Hz, 2H), 4.04～3.96(m, 4H), 3.15～2.98(m, 8H), 2.82(s, 2H), 2.65(d,J=5.3 Hz, 3H), 2.03～1.93(m, 2H), 1.34(dd,J=7.2 Hz, 2.4 Hz, 39H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 172.75, 172.50, 172.43, 170.26, 166.23, 165.54, 163.52, 156.28, 156.07, 155.96(2C, overlap), 155.53, 154.47(2C, overlap), 135.06, 134.45, 131.22, 130.09, 130.04, 129.57, 129.09, 128.66, 128.58, 128.31(2C, overlap), 127.60, 126.04(2C, overlap), 118.05, 114.05, 113.78, 78.34, 78.28, 78.01, 67.66, 67.49, 59.52, 51.51, 48.35, 48.21, 37.15, 35.11, 33.98, 32.68, 31.45(2C, overlap), 30.78, 28.65(10C, overlap), 27.80, 23.20, 19.85; HR-MS(ESI)m/z: Exact mass calcd for C62H84N11O13{[M+H]+}1190.6244, found 1190.6245。

(6)G0775的合成

室溫下向50 mL茄形瓶中依次加入I-28500 mg(0.42 mmol)和六氟異丙醇溶液3 mL、氯化氫的1,4-二氧六環溶液1.6 mL(4 M, 6.30 mmol),并在室溫條件下攪拌反應1 h。反應結束,將反應混合物減壓濃縮至干燥得白色固體G0775434 mg,產率99%,純度97%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.25(dd,J=19.3 Hz, 7.1 Hz, 1H), 8.99(d,J=7.9 Hz, 1H), 8.86(d,J=6.6 Hz, 1H), 8.43(d,J=8.9 Hz, 1H), 8.40～8.33(m, 2H), 8.21(s, 3H), 8.12(d,J=7.2 Hz, 4H), 7.62～7.55(m, 2H), 7.34(s, 1H), 7.21(d,J=5.9 Hz, 3H), 7.16～7.09(m, 2H), 6.77(d,J=4.0 Hz, 2H), 6.35(s, 1H), 5.14(q,J=7.0 Hz, 1H), 4.98(q,J=7.3 Hz, 1H), 4.82～4.66(m, 2H), 4.33～4.16(m, 4H), 3.73～3.64(m, 2H), 3.27(d,J=16.7 Hz, 1H), 3.19～2.91(m, 8H), 2.85(s, 2H), 2.66(d,J=7.6 Hz, 3H), 2.17～1.97(m, 2H), 1.34(d,J=2.9 Hz, 10H), 1.21(q,J=8.0, 7.1 Hz, 3H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 172.81, 172.54, 171.46, 170.15, 166.26, 165.66, 163.62, 156.33, 155.15, 154.60, 154.12, 135.33, 134.35, 131.35, 131.00, 130.29, 129.79, 128.70, 128.66, 128.33(2C, overlap), 127.13, 126.08(2C, overlap), 121.73, 118.04, 115.20, 114.98, 67.69, 67.44, 66.09, 65.93, 59.86, 51.39, 48.59, 48.25, 38.62, 38.57, 36.34, 35.13, 34.10, 33.12, 31.44, 29.26, 27.76, 23.34, 19.88; HR-MS(ESI)m/z: Exact mass calcd for C47H60N11O7{[M+H]+}890.4673, found 890.4672。

G0775的文獻合成方法是以I-7為起始原料,經22步反應得到,總產率1.40%。該方法最大缺點為線性路線步驟太長,操作繁瑣,總產率很低。此外,I-21合成I-22這步反應存在所需的N-Boc-溴乙胺試劑用量很大(10 eq)和反應時間較長(48 h)的問題,最后一步脫Boc保護反應存在需用制備液相純化和產率較低(47%)的問題。

針對I-22合成存在的問題,本文展開了反應條件優化研究,結果如表1所示:在相對較高的溫度下可以明顯縮短反應所需的時間并提高產率(Entries 2～4),但溫度過高反而會導致產率急劇下降(Entry 5)。降低N-Boc-溴乙胺試劑當量,反應時間有所延長(Entry 6),但可以取得更高的產率。但當繼續降低N-Boc-溴乙胺試劑當量時(Entry 7),發現即使延長反應時間反應也不能進行到底,推測可能是N-Boc-溴乙胺不穩定引起。最終確定該步反應的相對較優條件是I-21與N-Boc-溴乙胺物質的量之比為1∶7, 80 ℃反應7 h。

表1 溫度和原料配比對于反應時間和反應產率的影響a

最后一步原合成方法需用制備液相純化且產率較低,探索發現以六氟異丙醇做溶劑,使用氯化氫的1,4-二氧六環溶劑脫保護可以以極高的純度(97%)和極高的產率(99%)得到G0775鹽酸鹽,避免了制備液相純化,產率得到明顯提高。

G0775原合成路線步驟長和總產率低的缺點限制了其實用性,新路線則是以I-7為起始原料,僅需15步反應得目標產物G0775,總產率高達23.73%;從關鍵大環中間體I-40到目標產物G0775,僅需8步,產率為68.16%。本文還巧妙地利用“一鍋法”,中間體I-41和I-21不經分離純化、I-23和I-27僅需簡單后處理可直接用于下一步,使得從I-40到G0775共8步反應僅需3步純化操作即可得終產物,很大程度上減少了操作工序。

本文通過對G0775原合成路線的改善,按照參考文獻方法合成中間體甲基(4S,7S,10S)-26-芐氧基-10-((((芐氧基)羰基)甲基)氨基)-16-羥基-7-甲基-6,9-二氧代-5,8-二氮雜-1,2(1,3)-二苯環癸烷-4-羧酸甲酯(I-40),并設計以I-40為起始原料,經過催化氫化、親核取代、水解和縮合,最后經氯化氫脫保護等共8步反應得到目標產物G0775,總產率為68.16%,純度97%。相對原合成路線,新路線反應步驟明顯縮短,操作更簡便,總產率大幅度提高,為該類分子的合成研究提供有益參考。