鋅指蛋白ZNF23在非小細胞肺癌中表達的研究

曲 微,任洪久,徐藝桐,邱雪杉*,趙俊軍*

(1.大連理工大學附屬中心醫院 病理科,遼寧 大連116000;2.中國醫科大學附屬第一醫院 病理科,遼寧 沈陽110000)

近年來,肺癌已經成為全球癌癥死亡的首要原因。我國的肺癌發生率也在快速增長,死亡率已經攀升至第一位[1-2]。多于百分之八十的肺癌被確診為非小細胞肺癌。雖然目前的治療方法有了很大的進步,但仍然沒有控制肺癌發生的有效方法[3]。轉錄抑制因子在預防肺癌發生發展中發揮必不可少的作用。因此尋找有效的抑癌生物標記物,探索新的治療靶點是非常必要的。

含有Krab(Kruppel associated box)結構域的鋅指蛋白-KRAB-ZFPs是人類轉錄抑制蛋白家族中數量最多的一類蛋白。它們參與很多重要的生理過程,包括細胞發育,增殖和凋亡的調控。ZNF23是近年發現的Krab結構鋅指蛋白家族的一員。ZNF23基因位于染色體16q22[4-5],這一區域含有多種抑癌基因并在腫瘤發生時有突變,例如卵巢癌和子宮內膜癌[6-7]。它含有N端Krab結構域及C端C2H2鋅指結構[8]。其中Krab結構域被認為是一個保守的模體并含有75個氨基酸,分為A盒和B盒,可以通過募集其他蛋白發揮轉錄抑制功能,例如KAP-1[9-10]。Krab結構域中均含有A盒,起到主要的抑制功能,B盒并非存在于所有,對A盒發揮輔助功能[11]。KRAB-ZFPs的Krab 結構域是高度保守的,有著相同的氨基酸序列,因此推測ZNF23與其它KRAB-ZFPs可能有相同的分子靶點[12]。鋅指模體可能參與DNA的識別[13]。

ZNF23蛋白在人類各種組織中廣泛表達。但在人類腫瘤中報道較少。最近幾年越來越多的研究發現ZNF23參與多種惡性腫瘤的發生發展進程,有研究證實ZNF23在人類卵巢癌和子宮內膜癌中表達明顯降低,并且是p53非依賴性的[14]。還有研究檢測了在肝細胞癌中癌與癌旁組織的ZNF23的mRNA水平及其與臨床預后關系,結果顯示ZNF23的mRNA水平癌旁明顯高于癌組織,還能抑制肝細胞周期,促進調亡[15]。然而ZNF23在非小細胞肺癌中的表達情況,以及其對癌細胞作用的機制,這些研究未見報道。為了明確這些問題,我們檢測了非小細胞肺癌組織中ZNF23蛋白和mRNA的表達,并研究了ZNF23調節細胞周期進展的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本 151例組織標本全部來自中國醫科大學附屬第一醫院病理科。患者手術前均沒有接受過任何化療或放射治療。標本用中性福爾馬林固定,石蠟包埋,常規進行HE染色,分別由兩位病理醫師,根據WHO(2004)肺癌分類標準和IUAC(2002)TNM分期標準確定腫瘤的組織學分型以及臨床病理分期。151例NSCLC包括:鱗癌75例,腺癌76例;高中分化97例,低分化54例;臨床病理分期顯示I期82例,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ期共69例;淋巴結轉移66例,無淋巴結轉移85例。18對新鮮的非小細胞肺癌和癌旁正常肺組織(遠離原發灶)低溫快速冷凍,以后用于RNA。患者病理參數有組織學類型、分化程度、病理分期、腫瘤大小和淋巴結轉移等。

1.1.2細胞系和細胞培養 A549、H460和H1299細胞系購自于American Type Culture Collection (Manassas,VA,USA)。LH7、SPC、LTE和LK2細胞系購與中國科學院上海細胞庫。凍存于液氮的A549、H1299、H460和HBE等細胞經復蘇后細胞使用RPMI 1640和高糖DMEM培養基含10%的滅活小牛血清,以及100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。37℃、5%CO2的條件下培養,每兩天換一次液,并用0.25%的胰酶進行消化傳代。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學 將組織蠟塊切成4 μm厚切片,進行脫蠟,脫水,修復等步驟后采用Elivision法進行免疫組織化學染色。染色步驟簡述如下:檸檬酸緩沖液(pH=7.0),高溫高壓進行抗原修復;3%H2O2和5%血清37℃下分別孵育切片30 min;一抗(antiZNF23 1∶50稀釋)4℃孵育過夜;反應放大劑和IgG聚合物37℃分別孵育組織切片35 min;然后使用DAB試劑進行顯色,蘇木素復染細胞核8 min。所有切片由兩位經驗豐富的病理醫師在不知道參數的情況下觀察切片和細胞計數。ZNF23蛋白定位于胞核。規定0%～25%的胞核染色記為1分,26%～50%記為2分,51%～75%記為3分,76%～100%記為4分。同時根據染色強度:無染色或淡染色記為0分,黃色顆粒記為1分,棕褐色顆粒記為2分。ZNF23的得分實為著色細胞得分乘以著色強度得分。我們將總分<4分判定為ZNF23陰性,總分≥4分判定為ZNF23陽性

1.2.2細胞培養 H1299細胞使用RPMI 1640培養基培養,A549細胞使用高糖DMEM培養基培養,培養基內含10%的滅活小牛血清,以及100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。37℃、5%CO2的條件下培養,每兩天換一次液,并用0.25%的胰酶進行傳代。

1.2.3干擾siRNA轉染 轉染前一天將細胞按40%～60%密度分散種于6孔板,使用LipofectamineTM 2000作為轉染試劑進行轉染,48 h后提取細胞,用于后續實驗。Real-time PCR和Western blot檢測干擾效率。ZNF23干擾序列和陰性對照均購自上海吉瑪生物公司。

1.2.4Western blot分析 收集的細胞用NP-40(含1 mM PMSF和磷酸酶抑制劑)裂解液裂解40 min,超聲粉碎后冰浴中靜置15 min。低溫高速離心(4℃,12 000 rpm)15 min,取上清。樣品置于100℃水浴中煮5 min。向泳道內加入18 μl樣品(含60 μg蛋白)及蛋白Marker。10%SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉印至PVDF膜(40～100V,2h)。5%脫脂奶粉或5%BSA室溫封閉2hr,以TTBS洗滌1次,每次5 min。分別加入一抗4℃孵育過夜。TTBS洗滌3次,每次10 min。加辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)室溫孵育2 h。TTBS洗滌3次,每次10 min。采用ECL發光顯色,結果經自動電泳凝膠成像分析儀(UVP Inc.,Upland,CA,USA)采集.進行灰度測定。

1.2.5細胞提取總RNA 處理后的細胞使用Trizol試劑提取總RNA,用Real-time PCR檢測ZNF23等指標的mRNA表達量。六孔板每孔加入1 ml Trizol試劑靜置10 min,吹打并移入1.5 ml EP管中。每1 ml Trizol加入200 μl氯仿,上下震蕩,室溫靜置10 min。4℃ 12 000 rpm離心15 min,取上層無色水相。在水相中加入等體積的異丙醇,震蕩混勻,室溫靜置10 min。4℃ 12 000 rpm離心15 min,可見RNA沉于管底,棄上清。分別加入1 ml 75%和100%無水乙醇,溫和震蕩,懸浮沉淀。4℃ 7 500 rpm離心10 min,可見RNA沉于管底,棄上清。用DEPC水溶解RNA并測定RNA A260/A280,比值在1.8～2.0之間純度為佳。

1.2.6Real-time PCR 利用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)合成特異性的cDNA,設計引物序列(表1)反應體系10 μl(總RNA 5 μl),在基因擴增儀內進行如下反轉步驟: 37℃,15 min; 85℃,5 s,4℃ 保存,待第二天進行PCR,或-20℃長期保存,一個月內使用。Real time PCR 在Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems,USA)內完成。反應體系20 μL,包括cDNA 1.33 μL,按照TaqMan MicroRNA Assays Kit(Applied Biosystems)優化程序進行擴增,采用相對定量的方法,循環過程如下:一次循環:95℃,30 s;: 95℃,5 s;60℃,30 s,40個循環。實驗及對照組均設3個副孔。實驗結束后讀取RQ值并進行統計分析。

表1 引物序列

1.2.7細胞周期試驗 6孔板干擾48 h后,當細胞長滿卻不擁擠時胰酶消化,吸管吹打至1.5 ml EP管,4℃ 1 200 rpm離心8 min,倒掉上清液留下沉淀,加入1 ml PBS洗一遍,4℃ 1 200 rpm離心8 min,倒掉上清,加入70%乙醇使細胞懸浮-20℃過夜以固定細胞。第二天取出,4℃ 1 200 rpm離心8 min,倒掉乙醇,PBS洗一遍,4℃ 1 200 rpm離心8 min,倒掉PBS,每管加入400 μL PI染料(碧云天公司),4℃ 靜置30 min,流式細胞儀進行檢測。

1.3 統計學分析

采用SPSS13.0統計分析軟件,對ZNF23表達和臨床病理因素的關系用卡方檢驗;其他實驗結果采用t檢驗進行數據分析,用mean±SD表示,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZNF23在非小細胞肺癌組織內的表達情況

我們對151例非小細胞肺癌切片使用免疫組織化學方法進行ZNF抗體染色,并選擇癌旁正常支氣管上皮作為對照。結果顯示ZNF23蛋白定位于細胞核,且在正常肺支氣管上皮細胞中強染色,非小細胞癌組織中低表達(圖1A-H),并且低分化腫瘤組織的染色明顯低于高分化腫瘤。我們還分析了ZNF23的表達情況與臨床的相關性,發現ZNF23在肺癌組織中的表達與年齡(P=0.223)和性別(P=0.336)無明顯相關性,卻和組織類型(P=0.000),分化程度(P=0.000),TNM分期(P=0.03),腫瘤大小(P=0.018)和淋巴結轉移(P=0.03)相關(表2)。ZNF23在肺腺癌與鱗狀細胞癌中表達均明顯降低,并腫瘤分化程度正相關,與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移數量負相關。我們還對18對新鮮的非小細胞肺癌的癌和癌旁組織進行real-time PCR檢測了ZNF23的mRNA表達水平,其中有13對的癌組織樣本ZNF23的mRNA表達明顯低于癌旁組織,5對的癌組織樣本與癌旁組織的ZNF23表達水平相近,差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。以上結果表明非小細胞肺癌患者的ZNF23蛋白水平低于癌旁正常組織,作為肺非小細胞癌的抑癌因子。

圖1 ZNF23在非小細胞肺癌組織中的蛋白表達情況

圖2 18對新鮮肺癌與癌旁正常組織realtime PCR結果統計

表2 ZNF23在非小細胞肺癌組織中的表達和臨床因素相關性統計

2.2 ZNF23在非小細胞肺癌細胞系中的表達和干擾情況

我們采用Western Blot方法檢測了10種肺癌細胞系A549、LTE、SPC、H1299、H157、83a、LK2、LH7和H460中的內源性ZNF23的蛋白含量,其中A549、LTES和H1299細胞系ZNF23蛋白高表達,LK2和H460細胞系中ZNF23蛋白低表達。最終選取高表達ZNF23蛋白的細胞系A549和H1299進一步研究(圖3A)。在選取的細胞系A549和H1299中進行干擾實驗,同時轉染ZNF23siRNA及對照siRNA,并應用Weatern Blot、Real-time PCR方法分別在蛋白水平及mRNA水平檢測了干擾效率,結果顯示干擾組內源性ZNF23后其蛋白及mRNA水平表達較對照組均顯著減少(圖3B、C),證實干擾效率已經達到標準,并進行下一步細胞周期實驗。

圖3 ZNF23在肺癌細胞系中的表達及干擾效率測定

2.3 ZNF23抑制細胞周期進展

在干擾效率達到的前提下,我們采用PI染料對干擾組和對照組細胞進行染色,用酶標儀檢測兩組細胞周期進展并進行比較。結果顯示ZNF23干擾組細胞周期進展更快,多在S/G2期,而對照組的細胞周期多停滯在G1期(圖4)。以上結果表明ZNF23通過阻滯細胞周期進展而抑制細胞增殖,從而發揮腫瘤抑制作用。

圖4 ZNF23干擾組與對照組細胞周期對比

3 討論

含有Krab結構域的鋅指蛋白(Krupple-associated box-containing zinc-finger proteins) KRAB-ZFPs是人類轉錄抑制蛋白家族中最數量最多的一類。它所含有的Krab結構域,參與很多重要的生理過程,包括細胞發育,增殖和凋亡等。ZNF23是一種Krab結構鋅指蛋白。它的基因所在染色體區有含有多種腫瘤抑制基因,并在腫瘤發生時突變[6-7]。ZNF23在人類腫瘤中的報道相對很少。已經有研究證實ZNF23在人類卵巢癌和子宮內膜癌中表達減少[14]。SHI等[15]也發現在肝癌中ZNF23的mRNA水平癌旁明顯高于癌組織,并且和TNM分期相關,還能抑制肝細胞周期,促進調亡。還有學者證實ZNF23通過線粒體依賴途徑抑制皮膚惡性黑色素瘤的惡性生物學行為,并發現ZNF23誘導凋亡是通過激活caspase-3、P27、P53并抑制Bcl-2的表達[16]。但ZNF23在非小細胞肺癌中的表達及其與臨床因素的關系還尚未有人研究。我們的研究發現ZNF23的蛋白和mRNA表達水平在肺癌組織中均低于癌旁正常組織,而且和TNM分期,腫瘤大小,淋巴結轉移,分化程度及組織類型都密切相關。這些都與先前的研究相一致。這些結果都說明ZNF23在非小細胞肺癌的發生發展中起到不可忽視的作用。

為了探究ZNF23在非小細胞肺癌發展中的作用機制,我們首先在多種肺癌細胞系中檢測了蛋白表達水平,并選擇了ZNF23蛋白水平較高的A549和H1299細胞系做進一步的研究。我們用siRNA干擾ZNF23的蛋白表達,并發現與對照組相比,兩種細胞系干擾組的細胞周期進展更快,細胞多在S/G2期。這個結果說明ZNF23可以通過抑制細胞周期進展來發揮抑制細胞增殖作用,而ZNF23對肺癌細胞侵襲、凋亡的作用以及其深入的機制及信號通路還不清楚,需要進一步研究。

KRAB-ZFPs的Krab 結構域是高度保守的,有著相同的氨基酸序列,而ZNF23是含有Krab鋅指蛋白家族中重要的一員,因此推測ZNF23與其它KRAB-ZFPs可能有相同的分子靶點[12]。HUANG等[14]研究證實ZNF23在人類卵巢癌和子宮內膜癌A.ZNF23在多種肺癌細胞系中的內源性表達。B.Western bolt檢測A549和H1299細胞中ZNF23干擾效率。C.realtiime PCR檢測A549和H1299細胞中ZNF23干擾效率。

中表達明顯降低,并且通過上調p27的表達抑制細胞周期進展,并且是p53非依賴性的。p27是細胞周期蛋白CDK抑制蛋白(CDKI)的其中一種[17],體外實驗證實它是通過抑制G1期激酶復合物如細胞周期蛋白E-CDK2和D-CDK4等,使細胞停滯在G1期[18]。體內實驗也發現p27蛋白水平升高使細胞周期多停滯在G1期,細胞增殖也隨即停止[19-20]。有研究者發現cAMP處理過的巨噬細胞,其內p27的合成量增加了幾倍,細胞也停止在G1期[21]。此外,PENG等研究發現在用抗上皮生長因子受體處理的細胞中,p27的mRNA表達水平升高,進而其蛋白合成增加并抑制CDK2的活性[20],說明在抗增殖信號的控制下,p27的迅速增多對于負調控細胞增殖并使其停滯于G1期是一個重要環節。因此我們有理由推測ZNF23在非小細胞肺癌中抑制細胞周期進展是通過上調p27進行的,為今后的研究提供了思路。

隨著對腫瘤研究的深入發展,越來越多的研究表明microRNA在腫瘤的發生發展中起到重要作用,最新研究證實microRNA-1246在順鉑耐藥卵巢癌中高表達,并且通過抑制ZNF23的轉錄調控細胞周期及凋亡[22]。Wei等人研究發現在分泌期子宮內膜上皮中細胞核小分子RNA SNORA5與micro146a-3p/ZNF23信號通路促進子宮內膜的容受性[23]。這些研究都表明ZNF23可作為多種microRNA的靶點調控細胞周期與凋亡,成為腫瘤治療的潛在新靶點。