宮頸癌中循環腫瘤細胞檢測的研究進展

苗鳴殊,孫鴻妍,張曉天,賀思思,任浩文,楊 梅,朱洪權*

(1.吉林大學白求恩第二醫院 檢驗科,吉林 長春130022;2.吉林大學基礎醫學院,病理生理系,吉林 長春 130021)

宮頸癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一,2020年全球癌癥統計報告表明,宮頸癌的全球新發病例為60.4萬例,死亡人數達34.1萬人[1]。近年來,我國女性宮頸癌的發病率和死亡率也逐年增高,同時發病人群趨于年輕化[2]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的持續感染是誘發宮頸癌的主要原因,其中以高危型HPV16和HPV18為主[3]。宮頸癌具有早期無自覺癥狀、發病隱匿及易復發和轉移的特點,患者出現臨床癥狀時大多數患者已錯過最佳治療時期,因此療效和預后較差。復發轉移是宮頸癌患者死亡的最主要的原因之一,許多研究表明在早期就可能出現腫瘤的轉移。目前預測復發轉移的指標有腫瘤直徑大小、國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期及浸潤深度等,然而該類指標都是術后獲取的信息,對于高危病人的及時診斷和病情的精準評估存在限制[4]。因此,尋找一種可早期反應患者復發轉移的生物標志物是十分重要的。目前,新興的液體活檢中對循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cell,CTC)的檢測可早期反映轉移復發、評估預后、判斷療效、指導個性化治療,具有豐富的臨床應用價值[5]。

1 CTC生物學特性

CTC是指自發或因診療等因素從原發腫瘤或轉移病灶脫落,釋放入外周血液的腫瘤細胞[6]。在循環中逃避免疫監視等影響的CTC向繼發性部位外滲,最終導致遠處器官的轉移性病變[7]。大部分的CTC通常由于物理剪切力、細胞死亡、免疫監視、缺乏生長因子等綜合因素在血液中很快被清除,只有少數CTC處于休眠狀態而存活[8]。因此,CTC具有稀缺性。此外,CTC以單個細胞或細胞簇的形式存在,其中CTC簇稱為循環腫瘤微栓子(Circulating Tumor Microemboli,CTM),CTM的數量相對于CTC更為稀少,但CTM的轉移能力比單個CTC高23～50倍[9],且持續存在的可能性更大,可作為提示患者預后不良的指標[10]。CTC具有上皮-間充質可塑性,可從外周血中分離出上皮、間充質或雙雜合上皮/間充質表型[11]。其中雙雜合上皮/間充質表型的CTC成簇能力高、存活時間長且有較強的成瘤能力[12]。CTC先后通過上皮-間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)和間充質-上皮轉化(Mesenchymal-epithelial transition,MET)完成腫瘤的轉移和播散,EMT過程使CTC的侵襲能力增加并且促進CTC的內滲,有助于其在循環過程中存活[13]。MET這一過程使CTC的上皮特性和遷移能力喪失,從而在遠處器官定植[14]。

2 CTC的檢測方法

因腫瘤患者外周血中CTC含量極低,每106～107個白細胞中可能只存在1個CTC,同時外周血中的大量血細胞還會干擾CTC的檢測,因此首先要通過富集提高檢測效率,繼而對富集的細胞進行下一步的檢測和鑒定[15]。CTC的富集主要包括基于物理學特性和基于生物學特性的兩種富集方法,基于物理特性的富集方法是根據CTC與外周血細胞之間的物理特性差異進行富集,包括尺寸[16]、電介性、慣性、密度及變形能力[17]等,但是這類方法的靈敏度和特異性較低[18]。基于生物特性的富集方法包括靶向上皮細胞黏附分子、細胞角蛋白等腫瘤細胞上的標志物進行的陽性選擇和靶向具有CD45等常見白細胞生物標志物以去除其他血細胞的陰性選擇[19]。這種基于抗原-抗體識別的富集方法特異性較高,是分離富集CTC的常用方法。CTC體外檢測鑒定方法主要分為細胞計數法和核酸檢測法兩種,其中細胞計數法包括流式細胞技術、免疫熒光染色法[20]及免疫熒光原位雜交技術等,核酸檢測法包括聚合酶鏈反應和逆轉錄聚合酶鏈反應等。此外,目前新興的CTC體內檢測方法包括在體熒光流式細胞術和在體光聲流式細胞術等,它們實現了非侵入性的實時監測CTC,是體內定量和分析循環腫瘤細胞的新技術[21]。由于CTC的稀缺性和異質性,導致對CTC的檢測仍存在一定困難,未來發展更高靈敏度和特異性的檢測技術可以進一步實現CTC的精準捕獲。

3 CTC檢測在宮頸癌中的應用

3.1 發現早期微轉移

CTC是腫瘤轉移過程中原發腫瘤和轉移性腫瘤之間重要的樞紐,保留著與原發腫瘤相似的生物學特性。研究表明CTC檢測可以輔助診斷腫瘤的轉移和復發。LAW等[22]研究了一種基于生物芯片的微流控裝置檢測宮頸癌患者體內的CTC,在對術后患者進行隨訪時觀察到患者外周血中人表皮生長因子受體2(HER2)的表達,但此時沒有臨床表現,肺部PET-CT掃描診斷也不明確。在初步診斷12個月時,才產生了宮頸癌轉移的組織學證據。因此,對患者進行CTC檢測有助于早期發現腫瘤轉移的發生。PAN等[23]研究了90例I-IIA期宮頸癌患者的CTC表型,結果發現上皮型CTC占38.89%,間充質型CTC占23.33%,混合型CTC占14.44%,除此之外,間充質CTC在FIGO II期、盆腔淋巴結轉移、淋巴血管受累的患者中更常見,因此,具有間充質表型的CTC與I-IIA期宮頸癌的盆腔淋巴結轉移和淋巴管浸潤密切相關,檢測CTC表型有助于宮頸癌微轉移的早期診斷和病情評估。HR-HPV E6/E7是人乳頭瘤病毒的早期轉錄基因,可作為檢測宮頸癌患者外周血中CTC的獨特生物標志物。WEISMANN等[24]對宮頸癌患者外周血中CTC的HR-HPV E6/E7致癌基因進行了檢測,結果顯示表達HR-HPV E6/E7致癌基因的CTC是宮頸癌患者早期微轉移的特異性基因標志,有助于提示早期微轉移的發生。

3.2 判斷患者預后情況

CTC的存在反映了腫瘤轉移的潛能,而腫瘤轉移與患者較低的生存率相關,因此對CTC計數有助于判斷患者的預后情況。DU等[25]選取了107例經過放療或同步順鉑化療之后的宮頸癌患者,探究了CTC水平與無進展生存期(PFS)之間的關系。結果顯示其中有86名患者CTC陽性且中位PFS為43.1個月,進一步研究發現每3.2 ml血液中檢測到≥1個CTC的患者的PFS短于未檢測到CTC的患者的PFS,多因素分析表明經過放療或同步順鉑化療后的宮頸癌患者的CTC計數是預后評估的獨立預測因素。因此,宮頸癌患者經過治療后體內的CTC水平是獨立的預后指標。鱗狀細胞癌抗原(SCC-Ag)是宮頸癌診斷、預后評估過程中使用廣泛的腫瘤標志物,SSC-Ag與CTC聯合檢測可以達到更好的預后評估效果。WEN等[26]研究了治療前CTC和SSC-Ag水平與晚期宮頸癌患者生存率之間的關系,結果顯示,每3.2 ml血清中CTC水平<3個和每3.2 ml血清中CTC水平≥3個的患者兩年DFS率分別為71.3%和40.6%,因此得出治療前高水平的CTC與較差的DFS顯著相關的結論。此外,研究還表明CTC聯合SCC-Ag的檢測結果與局部晚期宮頸癌患者的DFS相關,而且建立了一種CTC和SCC-Ag聯合應用預測宮頸癌患者疾病進展的風險模型,該模型是計算每個病例的CTC評分和SCC-Ag評分之和得出新的聯合風險評分,其預測患者疾病進展的效能與單一生物標志物的預測效能相比顯著提高,這一模型可能有助于改善宮頸癌患者的預后分層,以便準確地判斷預后。

3.3 動態監測疾病進展及指導治療

監測宮頸癌患者的疾病進展和指導個性化治療是治療過程中關鍵的環節,CTC的檢測不僅可以幫助監測疾病進展而且還有助于判斷藥物的療效。TEWARI等[27]通過動態監測宮頸癌患者外周血CTC的水平進而探究了貝伐單抗治療對晚期宮頸癌患者的療效。研究發現,治療前外周血CTC的中位數為7CTC/7.5 ml全血,治療36天后外周血CTC中位數下降至4CTC/7.5 ml全血,這表明了CTC的檢測可以對治療過程中的宮頸癌患者進行實時監測和療效的動態評估。此外,CTC檢測還可以幫助選擇治療藥物,在接受順鉑-紫杉醇化療的治療前CTC較高的女性患者中,同步使用和不使用貝伐單抗的患者的中位PFS分別為14.6個月和6.4個月,所以治療前CTC數量較多且同時接受順鉑-紫杉醇化療和貝伐珠單抗治療的患者PFS顯著改善。因此,CTC的檢測不僅可以動態監測患者疾病的進展還有助于對治療藥物的選擇。此外,尋找一種靈敏度較高的檢測方法對實時動態監測患者的疾病進展是十分重要的。PFITZNER等[28]建立了一種基于HPV癌基因轉錄物的敏感測定法Digital-Direct-RT-PCR,它是將Ficoll分離、細胞固定和一步RT-PCR以低通量數字PCR形式結合,使得可以直接分析和檢測單個CTC而不需要分離RNA。該方法可以在高背景的HPV陰性細胞中分離出數量少的HPV16/18-E6表達的細胞,這種靈敏度較高的檢測方法可以更好地實現對宮頸癌患者體內的CTC水平進行動態監測,從而實現對患者的個性化治療。

4 小結

宮頸癌作為女性生殖系統常見的惡性腫瘤,嚴重威脅著女性的生殖健康和生活質量,早期發現和診斷是患者良好預后的關鍵。目前臨床上檢測和診斷宮頸癌的主要方法包括電子計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)等影像學檢查,薄層液基細胞檢測(TCT)、組織活檢等病理學檢查,但是缺少與宮頸癌相關的高靈敏度和高特異性的腫瘤標志物。液體活檢作為一種新興的檢測技術,它包括CTC、循環腫瘤DNA和外泌體等檢測。其中CTC是液體活檢的基石之一,其檢測具有微創、實時、便捷、靈敏的優點,是一種十分有前景的生物標志物。CTC已被證明與肺癌[29]、乳腺癌[30]、結直腸癌[31]及胰腺癌[32]等其他許多實體腫瘤的早期診斷、療效監測和預后評估相關,雖然CTC的檢測在婦科惡性腫瘤方面仍處于探索階段,但是現有的研究發現宮頸癌患者外周血中CTC的檢測也具有豐富的臨床應用價值,包括在早期診斷微轉移、判斷患者的預后情況、動態監測和評估患者的療效等方面。未來將CTC的體外培養和CTC的靶向治療與宮頸癌相結合,可能會使CTC在宮頸癌的診治中具有更加廣泛的應用前景。