富硒大米的飲料制作工藝及其抗氧化作用研究

劉 爽, 崔承弼,*, 金敏淇, 劉勃辰, 劉禹彤, 魏金峰

(1.延邊大學 融合學院;2. 延邊大學 農學院：吉林 延吉 133002; 3.延邊平崗綠洲現代農業科技有限公司,吉林 和龍 133500)

硒是人體內的一種必需微量元素,廣泛存在于人體的各個器官當中。硒元素對人體的生理和保健功能都大有益處,例如硒可以增強機體免疫力、解毒、抗癌,以及對心、肝等臟器具有保護作用;除此之外,硒元素還可以預防近視,具有提升生殖功能、美容養顏等藥理作用,因此人們賦予硒元素以“生命之火”、“抗癌之王”的美譽[1]。

抗氧化是近年來國內外學者對功能性食品的一個重要研究課題。對于人體的衰老,有研究認為是體內過多的氧自由基誘發脂質過氧化,使細胞膜結構受到損傷,從而引起細胞破壞老化和功能障礙[2]。自由基是需氧生物體呼吸作用中不可避免產生的中間代謝產物,極其不穩定,會與生命大分子物質反應,造成有機體的損傷,從而加速細胞老化和致癌等[3-4]。許多疾病的發生與活性氧引發的氧化反應有關,如腫瘤、衰老、心腦血管疾病等[5]。為降低自由基對人體的危害,將具有天然抗氧化劑的食品作為日常膳食補充劑是一種常用做法[6],且硒本身具有一定的抗氧化作用,因此含硒的物質可以作為重要的抗氧化劑。同時,大米是我國的主要糧食作物,是大多數地區居民膳食結構中的主要組成部分[7],是人體補充各種營養元素的重要途徑,其硒含量和形態與人體硒營養狀況關系非常密切[8]。大米對硒具有一定的生物富集作用,可將吸收的無機硒轉化為有機硒[9]。因此,富硒大米是補充人體硒元素,實現科學補硒最有效的方式。

隨著當今社會消費的不斷升級,人們為了追求更美好的生活品質,在飲食方面更加注重吃得健康、吃得營養[10],硒元素也隨之慢慢地進入到大眾視野當中。由于前幾年的疫情沖擊,大家逐漸意識到免疫力對于戰勝疾病的重要性,營養補充也成為了人們關注的熱點,世界各國興起對保健飲料的開發與應用研究,保健飲料也越來越受到消費者的青睞[11],消費者對飲料的需求不再只是滿足消暑解渴的目的,而是同時考慮營養保健功效[12]。再加上富硒產品的興起,所以富硒飲料市場的前景十分廣闊[13]。

目前,我國對于富硒大米的相關研究主要側重于富硒大米中硒含量的提取與檢測[14-15],但對于富硒大米的抗氧化活性以及產品的研究開發還有待深入。基于此,該研究通過測定富硒大米對DPPH·、ABTS+、·OH清除能力以及總抗氧化能力等理化指標,測定了富硒大米的抗氧化活性;同時通過單因素和正交試驗確定富硒大米飲料的最佳酶解條件和飲料制作最佳配方,最后通過感官評分值制成風味獨特的富硒大米飲料,為富硒大米功能性飲料的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒大米(延邊乾豐實業有限公司提供);α-淀粉酶(江蘇銳陽生物科技有限公司);抗壞血酸(Vc)(國藥集團化學試劑有限公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、2 ,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+)、羥自由基(·OH)(上海源葉生物科技有限公司);2,4,6-三(2-吡啶)-1,3,5-三嗪(TPTZ)(天津市科密歐化學試劑有限公司);檸檬酸(濰坊英軒實業有限公司);FeSO4溶液(天津市永晟精細化工有限公司);H2O2溶液(中國惠世生化試劑有限公司上海);冰醋酸(天津市華東試劑廠);結晶乙酸鈉(天津市永大化學試劑有限公司)。

DF-35落地式連續投料粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司);HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒儀器有限公司);TG16A-WS離心機(上海盧湘儀器有限公司);BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌機(上海盧湘儀器有限公司);PHS-3C精密PH計(溫州市一州機械有限公司);ME204E分析天平(上海人和科學儀器有限公司);SP-Max3500FL多功能熒光酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司)。所有試劑均為分析級試劑,并按照說明儲存。

1.2 富硒大米提取物的制備

取適量富硒大米,將未成熟米、異色米粒等挑選干凈,用蒸餾水洗滌,直至表面的糠粉和灰塵洗凈為止,瀝干。然后將富硒大米放置烘箱中,調節溫度至50 ℃,干燥3 h,使富硒大米表面完全干燥后取出。將富硒大米放入粉碎機中粉碎,過60目篩,放置于潔凈干燥的密封袋中,備用。

1.3 富硒大米α-淀粉酶酶解單因素試驗設計

1.3.1 加酶量對酶解情況的影響

分別精密稱取6 g富硒大米粉末,按照α-淀粉酶含量為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%,將其置于80 ℃,pH值6.5的環境下,加熱50 min,并對結果進行感官評價,從而確定最佳加酶量。

1.3.2 加熱溫度對酶解情況的影響

分別精密稱取6 g富硒大米粉末,按照加酶量為0.5%,加熱溫度65、70、75、80、85 ℃,pH值為6.5環境下,加熱50 min,并對結果進行感官評價,從而確定最佳加熱溫度。

1.3.3 pH值對酶解情況的影響

分別精密稱取6 g富硒大米粉末,按照加酶量為0.5%,pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,將其置于80 ℃,加熱50 min,并對結果進行感官評價,從而確定最佳pH值。

1.3.4 加熱時間對酶解情況的影響

分別精密稱取6 g富硒大米粉末,按照加酶量為0.5%,在80 ℃、pH值為6.5的環境下,分別加熱40、50、60、70、80 min,并對結果進行感官評價,從而確定最佳加熱時間。

1.4 富硒大米α-淀粉酶酶解正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上,對富硒大米的提取條件進行優化。選擇加酶量、酶解溫度、酶解時間、pH值4個因素做正交試驗,從而優化α-淀粉酶酶解富硒大米工藝條件,最終結果以感官評價的評分來確定酶解效果[16]。依據單因素試驗結果,以富硒大米汁的加酶量、酶解溫度、酶解時間、pH值進行4因素3水平正交試驗設計[17],試驗因素與水平見表1。

表1 富硒大米酶解正交試驗因素與水平

1.5 富硒大米飲料配方單因素試驗設計

1.5.1 不同大米汁含量對富硒大米飲料口感的影響

分別精密稱取50、60、70、80、90 mL大米汁,分別向其中加入6%蔗糖和0.2%檸檬酸,攪拌均勻,配制成富硒大米飲料,并對結果進行感官評價,從而確定最佳大米汁含量。

1.5.2 不同蔗糖濃度對富硒大米飲料口感的影響

取多組添加0.2%檸檬酸的70 mL的大米汁,分別向其中加入2%、4%、6%、8%、10%的蔗糖,攪拌均勻,配制成富硒大米飲料,并對結果進行感官評價,從而確定最佳蔗糖濃度。

1.5.3 不同檸檬酸濃度對富硒大米飲料口感的影響

取多組添加6%蔗糖的70 mL大米汁,分別向其中加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的檸檬酸,攪拌均勻,配制成富硒大米飲料,并對結果進行感官評價,從而確定最佳檸檬酸濃度。

1.6 富硒大米飲料配方正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上,對富硒大米飲料的配方進行優化。選擇大米汁含量、蔗糖濃度、檸檬酸濃度3個因素做正交試驗,從而優化富硒大米飲料配方工藝條件,其最終結果以感官評價的評分來確定飲料制作最佳配方。依據單因素試驗結果,以大米汁含量、蔗糖濃度、檸檬酸濃度進行3因素3水平正交試驗設計,試驗因素與水平見表2。

表2 富硒大米飲料配方正交試驗因素與水平

1.7 殺菌方法

為了研究不同滅菌條件對飲料穩定性的影響,脫氣時將飲料溫度控制在70～75 ℃。該試驗的滅菌方式采用高溫滅菌法。殺菌條件對飲料穩定性的影響見表3。

表3 殺菌方式試驗設計

由于高溫滅菌會對飲料穩定性有一定影響,在試驗過程中對富硒大米飲料采取不同的滅菌溫度和滅菌時間,分別在110 ℃條件下滅菌25、30 min,在115 ℃條件下滅菌20、25 min,在121 ℃條件下滅菌15、20 min,并在室溫下放置3 d,觀察其穩定性。

1.8 感官評價

試驗由20位身體健康、無感官缺陷、來自不同專業的師生組成感官評定小組,對不同處理階段的富硒大米飲料分別從色澤、質地、香氣、口感4個方面進行感官評價,評定分數采用100分值。評分標準具體見表4。

表4 感官評價標準

感官測評小組根據相應評定指標對待測樣品進行感官評測,并以色澤是否呈淡黃色且透明,以及色澤分布是否均勻;香氣是否醇厚無異味;質地是否細膩且無沉淀,以及適口度的不同給予感官上的相應分數。每次評定后,取消最高分和最低分取平均值作為試驗最終記錄值,以感官評定的平均分為最后得分,確定最優產品。

1.9 富硒大米的抗氧化活性測定

1.9.1 DPPH·自由基清除能力測定

參考梁英琪等的方法,并進行修改[18-19]。取不同濃度的樣液20 μL加入配好的DPPH溶液180 μL,酶標儀于560 nm處測定吸光值Ai;等體積乙醇溶液代替DPPH溶液作空白對照組Aj;蒸餾水代替樣品作對照組A0。

1.9.2 ABTS+自由基清除能力測定

參考王佰靈等的方法,并進行修改[20-21]。取不同濃度樣液30 μL,加入配好的ABTS溶液270 μL,酶標儀于405 nm處測定吸光值Ai;等體積蒸餾水代替ABTS溶液作空白對照Aj;蒸餾水代替樣品作為對照A0。

1.9.3 ·OH自由基清除能力測定

參考王晴等的方法,并進行修改[22-23]。取不同濃度的樣液2 mL,加入2 mL FeSO4溶液和2 mL H2O2溶液,靜置6 min后加入2 mL水楊酸溶液,記為As;蒸餾水代替As組的水楊酸溶液,記為Ar;蒸餾水代替樣品作空白對照組,記為A0。

1.9.4 總抗氧化能力測定

60 μL FeSO4溶液(0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mmol/L)、6 mL FRAP工作液、25 mL TPTZ鹽酸溶液(10 mmol/L)和 50 mL FeCl3溶液(20 mmol/L)。在37 ℃黑暗中孵育30 min,測量593 nm處的光吸收值,繪制回歸曲線：y=0.063x+0.033 1(R2=0.992 7)。

富硒大米溶液(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)代替FeSO4標準溶液。其余按照上述方法操作,593 nm處測定吸光值A。根據標準曲線計算樣品溶液的FRAP值[24]。

1.10 數據處理

使用GraphPad Prism 8.0和Excel軟件進行統計和繪制圖表,通過SPSS 26.0軟件進行顯著性差異分析[25]。P<0.05為顯著性差異,P>0.05表示無顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 富硒大米飲料的工藝研究

2.1.1 富硒大米α-淀粉酶酶解試驗

1) 富硒大米α-淀粉酶酶解單因素試驗結果

如圖1-A所示,當α-淀粉酶添加量為0.1%～0.9%時,感官評價分值呈現先遞增后遞減的趨勢;當富硒大米α-淀粉酶添加量為0.5%時,感官評價分值達到峰值,此時繼續添加α-淀粉酶,隨著加酶量的提高,感官評價分值隨之降低。因此,選擇富硒大米α-淀粉酶添加量為0.3%～0.7%,富硒大米飲料的酶解情況最佳。

注：不同字母表明不同組下樣品差異顯著(P<0.05),下同。

如圖1-B所示,當pH值為5.5～7.5時,感官評價分值呈現先遞增后遞減的趨勢;當富硒大米pH值為6.5時,感官評價分值達到峰值,將其置于pH值更高的環境中,隨著pH值的提高,感官評價分值隨之降低。因此,富硒大米酶解時選擇pH值為6.0～7.0,富硒大米飲料的酶解情況最佳。

如圖1-C所示,當酶解溫度為65～85 ℃時,感官評價分值呈現先遞增后遞減的趨勢。當富硒大米酶解溫度為75 ℃時,感官評價分值達到峰值,此時提高酶解溫度,隨著溫度的升高,感官評價分值隨之降低,尤其在80～85 ℃降低更為明顯。因此,選擇富硒大米酶解溫度為70～80 ℃,富硒大米飲料的酶解情況最佳。

如圖1-D所示,當酶解時間為40～50 min時,感官評價分值迅速上升,當酶解溫度在50 min時,感官評價分值達到峰值,此時延長酶解時間,酶解時間為50～80 min時,隨著酶解時間的增加,感官評價分值隨之降低。因此,選擇酶解時間為40～60 min,富硒大米飲料的酶解情況最佳。

2) 富硒大米正交試驗結果

在單因素試驗結果基礎上,選擇加酶量(0.3%、0.5%、0.7%)、pH值(6.0、6.5、7.0)、酶解溫度(70、75、80 ℃)、酶解時間(50、60、70 min)4個因素,進行4因素3水平正交試驗。正交試驗結果與分析見表5。

表5 富硒大米α-淀粉酶酶解正交試驗結果

由試驗可知根據直觀分析法中極差R的大小,對因素進行主次排列,其次序可以排列為：A>B>C>D,即加酶量為最主要的因素,其次為pH值,其最佳組合為A2B2C3D1,因此,最佳酶解條件是在酶濃度0.5%,pH值6.5的環境中,80 ℃加熱50 min,此時酶解效果最佳,最終獲得80分,為最高的感官評價值。

2.1.2 富硒大米飲料配方試驗結果

1) 富硒大米飲料配方單因素試驗結果

如圖2-A所示,大米汁添加量為50～90 mL時,感官評價分值呈現先遞增后遞減的趨勢。當富硒大米汁添加量為70 mL時,感官評價分值達到峰值,此時繼續添加大米汁,隨著大米汁含量的提高,感官評價分值隨之降低。因此,選擇富硒大米汁添加量為50～70 mL,富硒大米飲料配方情況最佳。

圖2 飲料配方對感官評價的影響

如圖2-B所示,蔗糖添加量為2%～10%時,感官評價分值呈現先遞增后遞減的趨勢。當蔗糖添加量為4%時,感官評價分值達到峰值,此時繼續添加蔗糖,隨著蔗糖含量的提高,感官評價分值隨之降低。因此,選擇蔗糖添加量為4%～8%,富硒大米飲料配方情況最佳。

如圖2-C所示,檸檬酸添加量為0.2%～0.6%時,感官評價分值呈現先遞增后遞減的趨勢。當檸檬酸添加量為0.3%時,感官評價分值達到峰值,此時繼續添加檸檬酸,隨著檸檬酸含量的提高,感官評價分值呈梯度下降趨勢。因此,選擇蔗糖添加量為0.2%～0.4%,富硒大米飲料配方情況最佳。

2) 富硒大米飲料配方正交試驗結果

在單因素試驗結果基礎上,選擇大米汁含量(50、60、70 mL)、蔗糖添加量(4.0%、6.0%、8.0%)、檸檬酸添加量(0.2%、0.3%、0.4%)3個因素,進行3因素3水平正交試驗。正交試驗結果與分析見表6。

表6 富硒大米飲料配方正交試驗結果

由試驗可知,根據直觀分析法中極差R的大小,對因素進行主次排列,其次序可以排列為：C>B>A,即檸檬酸含量為最主要的因素,其次為蔗糖含量,其最佳組合為A3B1C2,因此,蔗糖添加量為4%,大米汁70 mL,檸檬酸添加量為0.3%時,最受大家喜愛,飲料配方最佳,最終獲得78.5分,為最高的感官評價值。

2.1.3 殺菌條件確定

通過試驗得出不同滅菌溫度和滅菌時間下飲料的穩定性,結果見表7。

表7 不同滅菌條件對飲料穩定性的影響結果

在121 ℃滅菌20 min,飲料不分層,產品呈淡乳黃色,效果更好,故得出結論,在121 ℃,滅菌20 min為最佳滅菌條件。將灌裝好的飲料置于121 ℃下,滅菌20 min,迅速冷卻至室溫,經檢查無染菌、分層、脹蓋現象,即得到富硒大米飲料成品。

2.1.4 感官指標

富硒大米飲料為乳白色,色澤均一;在保留大米本身香氣的基礎上,兼具有酸味和甜味,口感清柔;質地均勻,無明顯沉淀。

2.2 富硒大米抗氧化作用研究

2.2.1 DPPH·自由基清除能力結果

DPPH·是一種相對穩定的自由基,它能接收到電子或氫原子,從而形成穩定的抗磁分子[26]。抗氧化能力強的物質清除能力越強,其顏色褪去或消失,因此,DPPH被廣泛用于測量自由基是否有清除活性[27]。從圖3可以看出,在0.4～2.0 mg/mL濃度范圍內,富硒大米提取液對DPPH·的清除能力與濃度呈現一定程度的正相關。同時,隨著乙醇溶液的添加,富硒大米提取液濃度達到2.0 mg/mL時顯示出明顯的清除能力。與富硒大米+乙醇溶液相比,Vc+乙醇溶液對DPPH·的清除能力明顯更強,在濃度為2.0 mg/mL時,富硒大米和Vc對乙醇的DPPH清除率分別高達(85.28±0.32)%、(98.96±0.41)%,經分析可知,富硒大米提取液和Vc溶液對DPPH·在試驗范圍內均有一定的清除效果,乙醇組與蒸餾水組對比,乙醇組更能增強富硒大米提取液和Vc溶液的清除能力,由此可見,富硒大米具有一定的DPPH·清除能力。

圖3 Vc和富硒大米的DPPH自由基清除能力

2.2.2 ABTS+自由基清除能力結果

ABTS可用于親水性和親脂性物質的抗氧化能力測定,在乙醇溶液中呈現藍綠色,并且在734 nm或405 nm處具有特征吸收峰,當有抗氧化物存在時,ABTS+的產生被抑制使反應體系褪色,405 nm處吸光度下降,在一定范圍內其吸光值與自由基被清除的程度成正比,通過吸光值下降的程度,就可以反映樣品的ABTS+的清除能力。所以ABTS+測定可作為反映樣品總抗氧化活性的指標[28]。從圖4可以看出,在濃度范圍內,富硒大米的清除率呈增長趨勢,說明富硒大米對ABTS+具有很強的清除能力。當富硒大米提取液在0.30 mg/mL濃度時,隨著乙醇溶液的添加,ABTS+的清除能力明顯提高。而對于Vc溶液,當濃度為0.1～0.3 mg/mL時,隨著蒸餾水或乙醇溶液的添加,Vc溶液對ABTS+的清除率差異不顯著(P>0.05),整體呈現平穩趨勢.而富硒大米提取液和Vc溶液在相同濃度下均差異顯著(P<0.05)。在濃度0.3 mg/mL時,對于蒸餾水組,富硒大米提取液對ABTS+的清除率為(48.42±0.28)%,Vc溶液對ABTS+的清除率高達(99.14±0.17)%,對于乙醇溶液組,富硒大米提取液對ABTS+的清除率為(48.41±0.27)%,Vc溶液對ABTS+的清除率高達(99.50±0.62)%。經分析可知,富硒大米提取液對ABTS+清除能力在試驗范圍內具有一定的清除效果,但弱于Vc溶液。

圖4 Vc和富硒大米的ABTS自由基清除能力

2.2.3 ·OH自由基清除能力結果

由于H2O2和Fe2+的協同作用,產生了對生物體毒性最大、危害最強的自由基,即·OH,這種自由基會造成組織損傷和細胞的死亡[29]。由圖5可知,當濃度為0.4～2.0 mg/mL時,隨著濃度的增加,富硒大米蒸餾水組的清除率呈梯度上升,但都弱于Vc。當濃度為2.0 mg/mL時,富硒大米和Vc溶液清除率可達到(75.30±1.57)%、(99.56±0.29)%,有較好的·OH清除活性。而富硒大米乙醇組雖然沒有像蒸餾水組形成較好的線性關系,但當濃度達到2.0 mg/mL時,富硒大米提取液乙醇組對·OH的清除能力較明顯。Vc溶液蒸餾水組在濃度為0.4～2.0 mg/mL時,·OH的清除能力始終很強,但此時隨著乙醇溶液的添加,Vc溶液對·OH的清除能力略顯下降。富硒大米提取液和Vc溶液在每組濃度下均差異顯著(P<0.05)。在濃度2.0 mg/mL時,對于蒸餾水組,富硒大米提取液對·OH的清除率為(51.27±0.25)%,Vc溶液對·OH的清除率高達(99.47±0.17)%,對于乙醇溶液組,富硒大米提取液對·OH的清除率為(69.85±0.63)%,Vc溶液·OH的清除率高達(89.74±0.54)%。經分析可知,富硒大米提取液和Vc溶液對·OH在一定范圍內均有一定的清除效果。

圖5 Vc和富硒大米的羥自由基清除能力

2.2.4 總抗氧化能力測定結果

酸性條件下,抗氧化劑與Fe3+-TPTZ反應,使其還原為藍紫色的Fe2+-TPTZ,根據溶液顏色的變化,可反映出待測樣品的還原能力,最后由吸光值測定FRAP值,兩者呈正相關[30]。由圖6可知,在濃度為0.4～2.0 mg/mL時,富硒大米提取液與Vc溶液的濃度均與FRAP值呈現良好的線性關系,同時,乙醇溶液的添加,明顯提高了富硒大米提取液的總抗氧化能力,其中,當濃度為1.2～2.0 mg/mL時,乙醇溶液添加后,富硒大米提取液的FRAP值增長的略有緩慢,但整體仍呈現上升趨勢。

圖6 Vc和富硒大米的FRAP值

富硒大米提取液和Vc溶液在每組濃度下均差異顯著(P<0.05)。在2.0 mg/mL濃度下,對于蒸餾水組,富硒大米提取液的FRAP值為(0.23±0.02) mmol/L,Vc溶液的FRAP值為(0.29±0.04) mmol/L,對于乙醇溶液組,富硒大米提取液的FRAP值為(0.25±0.05) mmol/L,Vc溶液的FRAP值為(0.35±0.03) mmol/L。經分析可知,在濃度為0.4～2.0 mg/mL時,富硒大米提取液和Vc溶液均有一定的抗氧化能力,尤其乙醇溶液添加后,對富硒大米提取液和Vc溶液的抗氧化能力均有一定程度的提高,對Vc溶液效果更明顯。

3 結論

通過以上研究發現,在試驗濃度范圍內,富硒大米具有較強的DPPH·、ABTS+、·OH清除能力以及總抗氧化能力,表明富硒大米具有較強的抗氧化活性。

最佳酶解條件：加酶量0.5%,pH值6.5,酶解溫度80 ℃,加熱時間50 min。

飲料制作最佳配方：富硒大米汁70 mL,蔗糖濃度4%,檸檬酸濃度0.3%。

綜上所述,該研究證實了富硒大米具有較強的抗氧化能力,且在功能性食品等深加工產品方面具有較好的應用前景。