ELP-SOD融合蛋白的純化及其脂質(zhì)體制備

朱月蓉, 陳星宇, 馮嬌燕, 周奔, 樊燕蓉

(1. 東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科, 江蘇 南京 210002; 2. 南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院, 江蘇 南京 210014)

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一類廣泛存在于生物界的金屬酶類,根據(jù)其活性中心結(jié)合的金屬離子不同,主要可分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD,人類的細(xì)胞質(zhì)中以Cu/Zn-SOD為主要種類。SOD具有催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng),平衡機(jī)體內(nèi)氧自由基的功能,是生物體防御活性氧毒害的關(guān)鍵性防線。SOD較強(qiáng)的抗氧化特性使其在抗輻射、抗衰老、抑制腫瘤等方面具有獨(dú)特的功能[1］,在醫(yī)藥[2］、食品[3］和化妝品[4］領(lǐng)域亦有較好的應(yīng)用前景。

最初生產(chǎn)的SOD蛋白大都源自動(dòng)植物組織,但存在提取工藝相對(duì)復(fù)雜、產(chǎn)率低、品質(zhì)不穩(wěn)定、生產(chǎn)成本較高、有免疫原性等問(wèn)題[5-6］。歐洲已從1999年禁止動(dòng)物源SOD用于人類,這推動(dòng)了從基因工程菌中獲得重組人源SOD的研究。目前重組人源SOD已成功在大腸埃希菌[7-10］、畢赤酵母[11-12］等表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá),Lin等[9］將重組人源SOD克隆到表達(dá)載體,利用大腸埃希菌進(jìn)行表達(dá),產(chǎn)量為5.9 mg/L培養(yǎng)基。由于以往重組人源SOD蛋白表達(dá)量不高,且純化過(guò)程通常需要結(jié)合親和層析、分子排阻等系列的層析方法,對(duì)純化實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高,操作較為復(fù)雜,因此,開(kāi)發(fā)高效、可行的生產(chǎn)系統(tǒng)以獲得高產(chǎn)量及高活性的人源SOD受到了廣泛關(guān)注。

類彈性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELP)是一種人工合成的基因工程化多肽聚合物,主要是(VPGXG)n五肽重復(fù)序列[13］,其中Xaa(X)指除了脯氨酸外的氨基酸[14］,通常為纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸等氨基酸,Xaa(X)可以由除了脯氨酸外的單一氨基酸組成,也可以由上述幾種氨基酸以不同比例組成,重復(fù)單元n通常為20～120不等。ELP蛋白單獨(dú)或與外源蛋白在N端或C端形成融合蛋白表達(dá)時(shí)具有相轉(zhuǎn)變特性,即達(dá)到一定溫度時(shí)ELP蛋白或ELP融合蛋白能發(fā)生從溶液到凝聚態(tài)的可逆轉(zhuǎn)變,隨著體系降低到一定溫度,則又能恢復(fù)溶液態(tài)[15］。因此,利用ELP融合蛋白可逆的溫度相變特性,通過(guò)簡(jiǎn)單離心就能分離重組蛋白,實(shí)現(xiàn)重組蛋白的可逆相變循環(huán)(inverse transition cycling,ITC)非色譜純化[16］,這種蛋白純化方法有著經(jīng)濟(jì)高效的顯著優(yōu)勢(shì),因而廣泛應(yīng)用于蛋白純化標(biāo)簽[17-18］。

基于ELP融合蛋白的可逆熱相變性特性,本研究采用基因工程法生產(chǎn)一種由ELP與人源Cu/Zn-SOD連接的ELP-SOD融合蛋白,經(jīng)過(guò)三輪ITC獲得純化人源重組Cu/Zn-SOD,研究了該融合蛋白的穩(wěn)定性、模擬了體內(nèi)半衰期和細(xì)胞毒性,并且結(jié)合脂質(zhì)體包裹技術(shù),制備了ELP-SOD脂質(zhì)體,分析了脂質(zhì)體包裹后ELP-SOD的半衰期及透皮效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-SOD-ELP40,并導(dǎo)入大腸埃希菌BL21·DE3中進(jìn)行表達(dá)[18］,篩選鑒定陽(yáng)性表達(dá)菌株。

1.1.2 試劑 IPTG、考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)自生興生物技術(shù)有限公司;EGTA、PEG-8000購(gòu)自生工生物工程股份有限公司;鄰苯三酚購(gòu)自上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司;RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清購(gòu)自德國(guó)Capricorn公司;卵磷脂、膽固醇購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 試劑配制 PBS(1 L):氯化鈉8 g,氯化鉀0.2 g,十二水合磷酸氫二鈉3.49 g,磷酸二氫鉀0.2 g,用超純水溶解并定容至1 L,用0.1 mol/L鹽酸調(diào)pH至7.4;LB培養(yǎng)基(1 L):氯化鈉5 g,胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,用超純水溶解補(bǔ)水至1 L。大腸埃希菌裂解液(1 L):20 mL PBS(pH 7.2),29.2 g氯化鈉,2.5 mL Tween-20,0.7 mL β-巰基乙醇,20 mL EDTA(0.5 mol/L,pH 8.0),20 mL EGTA(0.5 mol/L,pH 7.0),用超純水溶解并定容至1 L。

1.1.4 儀器與設(shè)備 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司;凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能生命科學(xué)有限公司;多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TECAN公司;紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海美析儀器有限公司;二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO公司;熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海市愛(ài)朗儀器有限公司;納米粒度儀ZS90購(gòu)自馬爾文儀器有限公司;TP-6透皮擴(kuò)散儀購(gòu)自天津市精拓儀器科技有限公司。

1.2 重組人源SOD的表達(dá)及鑒定[18］

委托南京金斯瑞生物科技有限公司提前合成ELP[H33V7] 40基因預(yù)先插在pET28a載體的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ之間;其中,ELP[H33V7] 40的N端含有N10,C端含有R9,形成pET28a-N10-ELP40-R9(pET28a-ELP40)載體。

委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成SOD(Cu/Zn-SOD,EC 1.15.1.1,GenBank:AY049787)的PCR引物(內(nèi)有NdeⅠ或BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))。PCR條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性25 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸25 s,循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min,10 ℃保溫。PCR引物序列上游:5′-CGCCATATGGCGACGAAGGCCGTGTGCG-3′,下游:5′-CGCGGATCCCTGCGCAATACCGATAACGCCG-3′。

分別將SOD基因的PCR產(chǎn)物與pET28a-ELP40載體通過(guò)NdeⅠ和BamH Ⅰ雙酶切和試劑盒純化,按照NEB公司的M2200S Quick ligation kit說(shuō)明書(shū)分別連接SOD的PCR酶切產(chǎn)物和含有ELP[H33V7] 40的pET28a-ELP40載體的雙酶切產(chǎn)物,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)連接,通過(guò)導(dǎo)入DH5α感受態(tài),37 ℃卡那霉素抗性平板菌落培養(yǎng),挑取單克隆菌落于3 mL含有終濃度為50 μg/mL的卡那霉素的普通LB培養(yǎng)液37 ℃搖菌過(guò)夜,PCR鑒定單克隆菌陽(yáng)性后,用質(zhì)粒提取試劑盒提取表達(dá)質(zhì)粒,酶切鑒定陽(yáng)性后,質(zhì)粒為pET28a-ELP40-SOD。

提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)導(dǎo)到大腸埃希菌表達(dá)菌BL21·DE3感受態(tài),挑取單克隆菌,在15 mL試管中加入3 mL含有終濃度為50 μg/mL的卡那霉素的普通LB培養(yǎng)液37 ℃搖菌過(guò)夜;然后在50 mL試管中加入10 mL含有終濃度為50 μg/mL的卡那霉素的普通LB培養(yǎng)液,加入0.5 mL菌液37 ℃搖菌2～3 h,當(dāng)光密度(D)值達(dá)到0.4～0.6時(shí),加入1 mmol/L的IPTG 37 ℃搖菌表達(dá)4 h,或先將菌液降溫至15 ℃,再加入1 mmol/L的IPTG 15 ℃搖菌表達(dá)16 h。分別收集1 mL表達(dá)菌,8 000 r/min離心5 min,加入100 μL電泳緩沖液,超聲破碎,100 ℃加熱10 min,離心,分別收集全菌液、沉淀和上清液。SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)菌中ELP-SOD融合蛋白表達(dá)分子量和表達(dá)量。

1.3 ELP-SOD融合蛋白的純化及酶活性測(cè)定

取200 μL攜帶目的蛋白基因(質(zhì)粒為pET28a-ELP40-SOD)的高表達(dá)大腸埃希菌(-80 ℃冷凍)接種于500 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃、140 r/min搖床培養(yǎng)20 h,以2%的接種量轉(zhuǎn)接于1 L的LB培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)至D(600 nm)達(dá)到0.6,加入1 mmol/L的IPTG 37 ℃搖菌表達(dá)4 h后收取發(fā)酵液。

粗酶液提取:培養(yǎng)好的發(fā)酵液以3 000 r/min離心20 min,收集菌泥,加3倍體積的大腸埃希菌裂解液溶解一定時(shí)間,進(jìn)行1次超聲-凍融循環(huán),即超聲一次(750 W,10 min),-80 ℃冷凍,取出溶解,13 000 r/min離心20 min,收集上清液,保存于-80 ℃冰箱。此上清液即為粗酶提取液。

ITC純化蛋白:取適量粗酶液加入1.5 mol/L NaCl,4 ℃冰浴1 h;13 000 r/min、4 ℃離心20 min,取上清液,加20 mg/mL PEG-8000,37 ℃水浴20 min;13 000 r/min、37 ℃離心20 min,棄上清液,沉淀加適量PBS溶解,此為1個(gè)循環(huán),總共循環(huán)3次。

ELP-SOD純度檢測(cè):對(duì)純化的酶液進(jìn)行SDS-PAGE,通過(guò)Tanon3500凝膠成像系統(tǒng)掃描得到電泳圖片,并利用Image studio軟件對(duì)電泳圖片進(jìn)行條帶純度分析。

ELP-SOD酶活性測(cè)定:采用改良的鄰苯三酚自氧化法(325 nm法)測(cè)定SOD融合蛋白的酶活性。酶活單位定義:在一定條件下,1 mL的反應(yīng)液中,每分鐘控制鄰苯三酚在325 nm波長(zhǎng)處的自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定為一個(gè)活力單位,測(cè)得數(shù)據(jù)按下列公式計(jì)算酶活性:

A1:鄰苯三酚自氧化速率,單位為D/min;A2:加入SOD酶液后的自氧化速率,單位為D/min;a:鄰苯三酚的用量(mL);b:SOD酶液的用量(mL)。

1.4 ELP-SOD融合蛋白的pH穩(wěn)定性測(cè)定

將10 mmol/L PBS用NaOH或HCl溶液分別調(diào)pH至3.0、5.0、7.0、7.4、8.0、9.0、11.0,純化所得的酶液用不同pH的PBS進(jìn)行10倍稀釋,每個(gè)pH梯度設(shè)置3個(gè)平行,于25 ℃水浴鍋溫育2 h后測(cè)定各組酶活[19］,以pH 7.4的PBS稀釋處理的酶液作為初始酶活,得到酶活保留率與溶液pH的關(guān)系曲線。

1.5 ELP-SOD融合蛋白的熱穩(wěn)定性測(cè)定

將純化所得的酶液取適量分別于25 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃水浴30 min后[20］,冷卻至室溫,測(cè)定各組酶活,每個(gè)溫度梯度設(shè)置3個(gè)平行,以25 ℃水浴30 min的酶液為初始酶活,得到酶活保留率與溫度的關(guān)系曲線。

1.6 添加Cu2+/Zn2+后ELP-SOD酶活性測(cè)定

將純化的ELP-SOD蛋白與最佳終濃度的Cu2+/Zn2+(Cu2+濃度為0.90 mmol/L、Zn2+濃度為0.45 mmol/L)混合,蛋白的終濃度為0.04 mg/mL,每組設(shè)3個(gè)平行,4 ℃反應(yīng)1、2、4、10、16 h時(shí)取樣用鄰苯三酚法測(cè)定ELP-SOD酶活。之后,取5 mL酶液于透析袋(8 000～14 000 Da)中,冰浴透析,4 h換1次液,同時(shí)取透析袋內(nèi)蛋白溶液0.3 mL,測(cè)定蛋白溶液中剩余Cu2+濃度,直至達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后停止透析。測(cè)定透析前后SOD-ELP的酶活,分析透析過(guò)程對(duì)SOD-ELP酶活的影響。

1.7 ELP-SOD融合蛋白的模擬體內(nèi)半衰期[21］

SPF級(jí)SD大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈取血,以大鼠血漿進(jìn)行模擬體內(nèi)半衰期實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分3組,實(shí)驗(yàn)組為ELP-SOD(0.25 mg/mL),陽(yáng)性對(duì)照組為純化SOD蛋白(購(gòu)自杭州紐龍生物科技有限公司,0.25 mg/mL),空白對(duì)照組為PBS溶液。實(shí)驗(yàn)時(shí)每組樣品液含有50%大鼠血漿、40% PBS及10%各自對(duì)應(yīng)的蛋白(空白對(duì)照組為PBS補(bǔ)足體積),加入后混勻,靜置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、20、32、48 h后分別取樣測(cè)定酶活,并按下式計(jì)算半衰期[19］:

t1/2:半衰期(酶活力下降為初始酶活的一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作的時(shí)間,單位為h);E0:初始酶活;E:t時(shí)的酶活力。

1.8 ELP-SOD融合蛋白細(xì)胞毒性試驗(yàn)

利用MTT法檢測(cè)ELP-SOD對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和小鼠成纖維細(xì)胞(L929)的毒性。HUVEC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,L929細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,分別置于37 ℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí),用0.25%的胰酶進(jìn)行消化,1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞,PBS洗滌2次,然后用相應(yīng)的培養(yǎng)基配成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液備用。分別將兩種細(xì)胞懸液接種于96孔板中,每孔100 μL,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。

吸去原培養(yǎng)液,用PBS清洗1次,每孔加入100 μL用培養(yǎng)基(含2.5%胎牛血清)稀釋的ELP-SOD蛋白酶液。分為4個(gè)濃度梯度,分別為1.5%、3%、6%、12%(對(duì)應(yīng)酶活性分別為10.5、21.0、42.0、84.0 U/mL),每組設(shè)置9孔平行樣,于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、48、72 h。對(duì)照組每孔加100 μL RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基(含2.5%胎牛血清)。

培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入10 μL配置好的MTT溶液(5 mg/mL),放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h;吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入100 μL DMSO,輕輕敲打96孔板框架使其充分溶解,用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定D值。增殖抑制率(%)=(空白對(duì)照組D值-實(shí)驗(yàn)組D值)/空白對(duì)照組D值×100%。

1.9 ELP-SOD融合蛋白脂質(zhì)體制備及包封率測(cè)定

薄膜水化法制備ELP-SOD脂質(zhì)體:將總膜材濃度為9.6 mg/mL的卵磷脂和膽固醇(質(zhì)量比為2∶1)溶于一定體積氯仿中,30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿,在茄形瓶?jī)?nèi)壁形成一層均勻的脂膜,加入一定體積ELP-SOD融合蛋白(0.25 mg/mL,溶于pH 6.8的PBS中),在37 ℃水浴下水化一段時(shí)間,所制得的ELP-SOD脂質(zhì)體用超聲細(xì)胞破碎儀在260 W條件下超聲10 min,接著依次濾過(guò)0.45 μm濾器和0.22 μm濾器,4 ℃無(wú)菌保存?zhèn)溆谩＝?jīng)ZS90納米粒度儀測(cè)量ELP-SOD脂質(zhì)體的平均粒徑、電位和聚合物分散性指數(shù)(PDI),以衡量ELP-SOD脂質(zhì)體的大小、電荷量和均一度。

ELP-SOD脂質(zhì)體酶活包封率的測(cè)定:取一定體積的ELP-SOD脂質(zhì)體于100 kD超濾管(Amicon,Ultra-4),5 000×g離心20 min,收集濾液并且記錄濾液體積,濾液即為游離的ELP-SOD,測(cè)定濾液酶活性。ELP-SOD脂質(zhì)體用1%的Triton X-100破膜0.5 h,得到破膜的脂質(zhì)體,經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后測(cè)定ELP-SOD的總活性。酶活包封率計(jì)算公式如下:

A:ELP-SOD的總活性(U/mL);a:超濾時(shí)加的ELP-SOD脂質(zhì)體體積(mL);B:超濾得到的濾液活性(U/mL);b:超濾得到的濾液體積(mL)。

ELP-SOD脂質(zhì)體蛋白包封率的測(cè)定:按上述方法用超濾管分離游離的ELP-SOD,實(shí)驗(yàn)采用BCA試劑盒法(美國(guó)THERMO公司)測(cè)定濾液的蛋白濃度,并按照下式計(jì)算ELP-SOD脂質(zhì)體的蛋白包封率:

a:超濾時(shí)加的ELP-SOD脂質(zhì)體體積(mL);C1:ELP-SOD脂質(zhì)體總蛋白濃度(mg/mL);b:超濾得到的濾液體積(mL);C2:濾液蛋白濃度(mL)。

1.10 ELP-SOD脂質(zhì)體的模擬體內(nèi)半衰期

以大鼠血漿進(jìn)行模擬體內(nèi)半衰期實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分3組,實(shí)驗(yàn)組為ELP-SOD脂質(zhì)體,陽(yáng)性對(duì)照組為同法制備的SOD脂質(zhì)體(SOD蛋白購(gòu)自杭州紐龍生物科技有限公司),空白對(duì)照為PBS溶液。實(shí)驗(yàn)時(shí)每組樣品液體積中50%大鼠血漿、40% PBS及10%各自對(duì)應(yīng)的脂質(zhì)體(陰性對(duì)照組為PBS補(bǔ)足體積),加入后混勻,靜置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、20、32、48 h后分別取樣測(cè)定酶活,并按照步驟“1.7”給出的公式計(jì)算ELP-SOD脂質(zhì)體的半衰期。

1.11 ELP-SOD脂質(zhì)體的透皮效應(yīng)

小鼠離體皮膚的制備:取6只健康SPF級(jí)雄性ICR小鼠頸椎脫臼處死,用脫毛劑將小鼠腹部皮膚脫毛處理,用生理鹽水洗凈殘留在小鼠腹部的脫毛劑后,剝下小鼠腹部皮膚,用鑷子刮凈離體皮膚內(nèi)側(cè)的組織,用PBS浸泡離體皮膚備用。

體外透皮實(shí)驗(yàn):采用TP-6透皮擴(kuò)散儀進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。用Franz擴(kuò)散池考察ELP-SOD脂質(zhì)體運(yùn)載ELP-SOD的透皮效率。Franz擴(kuò)散池由上下兩個(gè)磨口玻璃容器對(duì)合而成,分為接收池和供給室,釋藥面積為1.13 cm2,接收池的容積為15 mL。實(shí)驗(yàn)時(shí)取15 mL PBS充滿Franz接收池,加入磁性轉(zhuǎn)子,將小鼠皮膚用不銹鋼夾固定于接收池與供給室之間(內(nèi)側(cè)皮膚朝下,與PBS接觸,且不能有氣泡殘留),供給室分別加入ELP-SOD脂質(zhì)體0.5 mL和0.25 mg/mL ELP-SOD蛋白溶液0.5 mL,將Franz擴(kuò)散池置于37 ℃恒溫水池,調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為350 r/min,每隔2 h取大約1 mL樣品,然后用等量PBS補(bǔ)足體積,持續(xù)24 h,每組設(shè)6個(gè)平行樣。

分別測(cè)定兩組樣品的SOD酶活性(ELP-SOD脂質(zhì)體組需加Triton X-100破膜,Triton X-100終濃度為0.5%),按照以下公式計(jì)算ELP-SOD脂質(zhì)體的透過(guò)率:透過(guò)率(%)=(a×b/c×d)×100%;其中,a:Franz擴(kuò)散池總體積(mL);b:取樣測(cè)得的樣品SOD活性(U/mL);c:供給室加入樣品體積(mL);d:加樣前樣品SOD活性(U/mL)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ELP40-SOD的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

以牛血清白蛋白(BSA)作為測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品,GS-900成像儀(SH1WBA10698)進(jìn)行凝膠透射圖像掃描(圖1),測(cè)算SDS-PAGE圖中目的蛋白的表達(dá)水平。對(duì)比電泳圖上的蛋白標(biāo)準(zhǔn)參照物(Marker)可以看出,目的蛋白ELP40-SOD的分子量在48 kDa左右,在普通LB培養(yǎng)基采用普通搖床進(jìn)行37 ℃表達(dá)4 h,pET28a載體表達(dá)的ELP40-SOD量最高是10 mg/L。

1、2分別為牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1 μg、2 μg;3為未加IPTG誘導(dǎo)樣品全菌裂解液;4、8、9分別為用15 ℃ 16 h表達(dá)的全菌裂解液、裂解液上清和沉淀;5、6、7分別為37 ℃表達(dá)4 h的全菌裂解液、裂解液上清和沉淀;10、11分別為37 ℃表達(dá)4 h的細(xì)菌裂解液沉淀和上清。ELP40-SOD的最高表達(dá)量(箭頭指示)測(cè)定為10 mg/L

2.2 ELP-SOD融合蛋白的純化結(jié)果

由圖2可見(jiàn),經(jīng)第一輪ITC純化后,蛋白溶液中除了ELP-SOD外還有較多其他雜蛋白,需要繼續(xù)純化;粗酶液經(jīng)三輪ITC純化后,SDS-PAGE蛋白電泳顯示ELP-SOD融合蛋白可以基本達(dá)到電泳純。ITC純化蛋白一般循環(huán)3～5次,融合蛋白經(jīng)三輪ITC純化,目的蛋白的純度已經(jīng)達(dá)到95%以上,兼顧蛋白得率考慮,因此ELP-SOD融合蛋白純化進(jìn)行三輪ITC。圖3為三輪ITC純化后的ELP-SOD,經(jīng)鄰苯三酚自氧化法沉淀,通過(guò)Image studio軟件分析可得純度為97.8%,酶比活達(dá)到4 894.5 U/mg,得率為0.96 mg/L,其中純化倍數(shù)5.98,恢復(fù)率28.5%。說(shuō)明用三輪ITC法純化ELP-SOD融合蛋白可以基本達(dá)到電泳純,純化后的蛋白酶比活較高,且純化過(guò)程僅需控溫離心,操作簡(jiǎn)便,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的ELP-SOD融合蛋白均由三輪ITC法純化。

1:全菌裂解液;2:裂解液沉淀;3:裂解液上清;4:粗酶液一輪ITC純化后樣品;5:三輪ITC純化后樣品

1-4為ITC三輪純化后的4個(gè)平行樣品

2.3 ELP-SOD融合蛋白的pH穩(wěn)定性

將目的蛋白用不同pH的緩沖液進(jìn)行稀釋,以考察pH對(duì)ELP-SOD融合蛋白酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4,ELP-SOD在pH 5.0～8.0的范圍內(nèi)酶活均能保留在90%以上,說(shuō)明該范圍內(nèi)的pH對(duì)酶活影響較小,蛋白較為穩(wěn)定。當(dāng)pH>8.0或者pH<5.0時(shí),酶活下降較快,但是仍保持在80%以上,因此,ELP-SOD融合蛋白在一定pH范圍內(nèi)能保持較高的穩(wěn)定性。

圖4 ELP-SOD融合蛋白pH穩(wěn)定性曲線

2.4 ELP-SOD融合蛋白的熱穩(wěn)定性

將目的蛋白在不同溫度下保持一定時(shí)間,以考察溫度對(duì)ELP-SOD融合蛋白酶活性的影響。由圖5可見(jiàn),當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí)ELP-SOD的活性較為穩(wěn)定,溫度超過(guò)60 ℃后酶活急劇下降,到80 ℃時(shí)ELP-SOD融合蛋白幾乎完全失活。因此,ELP-SOD在溫度小于60 ℃的環(huán)境下有較好的穩(wěn)定性。

圖5 ELP-SOD融合蛋白溫度穩(wěn)定性曲線

2.5 外源添加Cu2+和Zn2+提高ELP-SOD酶活性

外源添加Cu2+和Zn2+可以有效提高ELP-SOD的酶活性,其酶活隨作用時(shí)間的變化曲線如圖6所示,在1 h之內(nèi)酶活迅速升高,已經(jīng)達(dá)到初始酶活的416%,之后的16 h內(nèi)酶活沒(méi)有顯著提升(t檢驗(yàn)結(jié)果顯示各點(diǎn)沒(méi)有顯著性差異),因此酶液與Cu2+/Zn2+混合液于4 ℃反應(yīng)1 h即可達(dá)到穩(wěn)定,酶活達(dá)到8 281 U/mg。該蛋白混合液于透析袋中冰浴透析72 h后,溶液中殘留的Cu2+和Zn2+濃度小于10 ppm,符合中國(guó)藥典對(duì)于SOD中重金屬含量的標(biāo)準(zhǔn),透析后的酶活為7 291.2 U/mg,是透析前酶活的88%。

圖6 外加Cu2+/Zn2+混合液提高ELP-SOD酶活隨時(shí)間的變化曲線

2.6 ELP-SOD融合蛋白的模擬體內(nèi)半衰期實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖7可以看出,隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),ELP-SOD融合蛋白和SOD純品都具有較好的穩(wěn)定性,例如在37 ℃孵育48 h后,空白對(duì)照組酶活僅為初始酶活的53.4%,SOD組酶活為初始酶活的78.4%,而ELP-SOD組仍保留了84.1%。此外,ELP-SOD融合蛋白的半衰期為(59.00±5.95)h,SOD的半衰期為(49.80±6.92)h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.965,P<0.05)。由此可見(jiàn),融合蛋白中ELP的加入不僅簡(jiǎn)化了蛋白純化過(guò)程,而且能夠有效保留酶活性,延長(zhǎng)酶在體內(nèi)的模擬半衰期。

圖7 ELP-SOD在血漿中的酶活保留率隨時(shí)間的變化

2.7 ELP-SOD融合蛋白細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖8及圖9所示,含有不同濃度ELP-SOD的培養(yǎng)基分別與HUVEC和L929細(xì)胞孵育,在24 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用;在孵育48 h后,ELP-SOD對(duì)于HUVEC增殖沒(méi)有明顯的促進(jìn)或者抑制作用,而在低濃度下對(duì)于L929細(xì)胞仍存在一定的促進(jìn)作用;當(dāng)含有ELP-SOD的培養(yǎng)基與細(xì)胞共孵育72 h時(shí),對(duì)于HUVEC細(xì)胞在高濃度下(42、84 U/mL)出現(xiàn)一定的抑制作用,而對(duì)L929細(xì)胞的增殖仍然沒(méi)有顯著抑制和促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,低濃度的ELP-SOD對(duì)于細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用,當(dāng)濃度較高(84 U/ml)且孵育時(shí)間夠長(zhǎng)時(shí)(72 h)才開(kāi)始表現(xiàn)出一定的增殖抑制(<30%),因此可以說(shuō)明ELP-SOD有較好的生物安全性。

*:P<0.05

圖9 不同濃度ELP-SOD對(duì)L929細(xì)胞增殖的影響

2.8 ELP-SOD融合蛋白脂質(zhì)體制備

經(jīng)ZS90納米粒度儀測(cè)量,ELP-SOD脂質(zhì)體的粒徑分布情況如圖10所示,脂質(zhì)體的粒徑分布呈現(xiàn)單峰的正態(tài)分布,平均粒徑小于200 nm(124.8 nm),PDI小于0.3(0.137),說(shuō)明該脂質(zhì)體的均一度好,粒徑較小且分布均勻。脂質(zhì)體表面所帶的電荷接近20 mV(-19.7 mV),這使脂質(zhì)體保持較為穩(wěn)定的形態(tài),不易發(fā)生聚集。ELP-SOD脂質(zhì)體的蛋白包封率為80.8%±3.42%,活性包封率為81.5%±2.17%,都高于80%,說(shuō)明該脂質(zhì)體能夠?qū)LP-SOD融合蛋白進(jìn)行有效的包裹。

圖10 ELP-SOD脂質(zhì)體的粒徑分布圖

2.9 ELP-SOD脂質(zhì)體的模擬體內(nèi)半衰期實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖11所示,隨著孵育時(shí)間的增加,以ELP-SOD融合蛋白或SOD制備的脂質(zhì)體都具有較好的穩(wěn)定性,但ELP-SOD脂質(zhì)體的半衰期達(dá)到(73.90±1.69)h,高于SOD脂質(zhì)體(63.40±6.61)h,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.333,P<0.05),且ELP-SOD融合蛋白的半衰期(59.00±5.95)h與ELP-SOD脂質(zhì)體的半衰期相比也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=14.189,P<0.001)。結(jié)果表明ELP-SOD融合蛋白制備成脂質(zhì)體后可以有效延長(zhǎng)其在血漿中的半衰期。

圖11 ELP-SOD脂質(zhì)體在血漿中的酶活保留率隨時(shí)間的變化

2.10 ELP-SOD脂質(zhì)體的透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖12所示,與ELP-SOD融合蛋白相比,其脂質(zhì)體能夠很快透皮擴(kuò)散入接收池中,8 h達(dá)到最高29.93%。之后雖稍有下降,在24 h最低仍然可達(dá)到20%左右,高于ELP-SOD融合蛋白,說(shuō)明脂質(zhì)體包裹ELP-SOD融合蛋白能夠加強(qiáng)其透皮效率。

圖12 ELP-SOD脂質(zhì)體透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

ELP具有逆向溫度相變特性,其作為標(biāo)簽制備的融合蛋白能隨溶液溫度或鹽濃度改變從可溶性狀態(tài)變?yōu)椴蝗苄誀顟B(tài),因此融合蛋白可用離心、超濾等簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的方法進(jìn)行融合蛋白分離,尤其便于規(guī)模化制備。此外,ELP標(biāo)簽不改變?nèi)诤系鞍锥?jí)結(jié)構(gòu)及酶活,ELP融合蛋白能增加蛋白溶解性,維持其生物活性和物理性質(zhì);ELP標(biāo)簽增加蛋白穩(wěn)定性主要包括提高酶的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、抵御酶失活和延長(zhǎng)酶的半衰期[22］。本研究將人源SOD與ELP進(jìn)行融合表達(dá),目的就是在保留蛋白酶活的同時(shí)簡(jiǎn)化純化工藝和降低成本。本實(shí)驗(yàn)利用重組大腸埃希菌表達(dá)ELP-SOD融合蛋白,結(jié)果提示在37 ℃誘導(dǎo)4 h表達(dá)量最高,而且目的蛋白主要在菌液裂解液上清中,最高表達(dá)量為10 mg/L。為了提高純化效率,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)ITC純化方案中的一些條件進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)過(guò)三輪ITC純化得到該目的蛋白,其最終純度為97.8%,酶比活為4 894.5 U/mg。而且ELP-SOD融合蛋白在pH在5.0～8.0的范圍、溫度低于60 ℃有較好的穩(wěn)定性。以大鼠血漿對(duì)ELP-SOD進(jìn)行模擬體內(nèi)半衰期實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示ELP的接入對(duì)于SOD的半衰期有一定的延長(zhǎng)作用。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明ELP-SOD對(duì)HUVEC和L929細(xì)胞的增殖影響較小,有較好的生物安全性。

針對(duì)ELP-SOD作為生物大分子在實(shí)際應(yīng)用中可能存在的生物利用率低、易被蛋白酶分解等問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)結(jié)合脂質(zhì)體包裹技術(shù),制備了ELP-SOD脂質(zhì)體,平均粒徑為124.8 nm,電位-19.7 mV,包封率達(dá)到80%以上,且模擬體內(nèi)半衰期實(shí)驗(yàn)表明脂質(zhì)體能進(jìn)一步有效延長(zhǎng)ELP-SOD融合蛋白的半衰期。并且ELP-SOD脂質(zhì)體的透皮效率明顯高于ELP-SOD融合蛋白,說(shuō)明脂質(zhì)體的包裹促進(jìn)了ELP-SOD的透皮效應(yīng),有助于該融合蛋白進(jìn)入皮膚發(fā)揮作用,提高生物利用度,這在皮膚科局部外用藥物、日用化妝品等方面將會(huì)有很好的發(fā)展前景。

本實(shí)驗(yàn)采用基因工程法構(gòu)建了ELP-SOD融合蛋白,利用其可逆熱相變性簡(jiǎn)化了純化步驟,降低了純化成本,解決了SOD來(lái)源的問(wèn)題。后續(xù)研究中還可以對(duì)大腸埃希菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,提高ELP-SOD的產(chǎn)量;也可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)在大腸埃希菌培養(yǎng)基中直接添加一定濃度和比例的Cu2+、Zn2+,來(lái)進(jìn)一步提高ELP-SOD融合蛋白的初始酶活,為重組人源SOD在醫(yī)療、保健、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。