保和丸對潰瘍性結腸炎小鼠腸道內A.muciniphila菌的調節作用*

游豐鋒 楊光勇 涂小華 何亞敏 喻良錦 李雨彤 何光志

潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis,UC) 是一種臨床常見的慢性疾病,據《潰瘍性結腸炎中醫診療專家共識意見(2017)》[1],UC黏液膿血便的臨床表現及反復發作、遷延難愈的疾病特點,屬于中醫“久痢”范疇。藥理研究表明,保和丸主要有助消化、調節腸胃功能、抗潰瘍和抑菌的作用[2]。保和丸是由焦山楂、神曲、萊菔子、茯苓、法半夏、陳皮、連翹7味藥組成,既有消食化滯、行氣和胃之功,又有清熱散結之效,使食積得消,胃氣得和,濕熱得去。臨床研究發現,保和丸常用于急慢性胃炎、急慢性腸炎、消化不良、嬰幼兒腹瀉等屬食積內停者。

嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila,A.muciniphila)是腸道微生態系統數千種共生菌中,對機體生理機能起重要作用的腸道優勢菌群之一,屬專性厭氧菌,占3%～5%。主要定殖于盲腸與結腸,其代謝產物之一的丙酸對腸道免疫穩態具有調節作用,在多種疾病如糖尿病、肥胖癥、潰瘍性結腸炎、結腸癌等均起到關鍵作用[3]。

本研究主要從A.muciniphila菌角度探討保和丸對UC小鼠的作用機制,通過其與傳統藥物5-氨基水楊酸對比,用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR, RT-PCR)對各組結果進行絕對定量分析,探究保和丸對該菌在UC疾病中的影響,為UC的臨床治療提供參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物清潔級6周齡昆明(KM)小鼠40只,雌雄各半,體質量(20±2)g,購買于長沙市天勤生物技術有限公司,許可證號:SCXK(湘)2019—0014。

1.2 實驗試劑與藥品右旋葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulphate Sodium, DSS, Sigma-Aldrich公司,批號:H02J9B62777);中成藥保和丸(北京同仁堂,批號:18081639);5-氨基水楊酸(莎爾福公司,批號:17G27518L);糞便基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司,批號:S7516);2×預混實時熒光定量快速PCR反應體系(2×RealStar Green Fast Mixture)(批號:9AG01,GeneStar 公司)。

1.3 主要儀器CFX96TM實時PCR檢測儀(BIO-RAD, 美國),核酸濃度檢測儀(Thermo Fisher Scientific, 美國)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組造模與給藥將40只小鼠隨機分為正常組、模型組、5-氨基水楊酸組、保和丸組,每組10只。根據參考文獻[4-6],除正常組外,其他組小鼠均以3%葡聚糖硫酸鈉溶液灌胃7 d,制備小鼠UC模型。參考《藥理實驗方法學》[7]體表面積計算劑量方法,5-氨基水楊酸配制成6.5 mg/ml的藥液,3次/d灌胃給藥;同時,將保和丸按上述方法,配制成78 mg/ml的藥液,2次/d灌胃給藥。正常組和模型組按0.1 ml/10 g灌胃給藥,2次/d,每次0.2 ml,連續14 d。

1.4.2 糞便總DNA提取在實驗第15天清晨,收集各組小鼠新鮮糞便,按照糞便基因組DNA試劑盒說明書,提取總DNA,核酸濃度檢測儀測定提取DNA模板的純度及濃度,保留DNA純度A260/A280 比值在1.8左右的樣本,調整各樣本濃度在200 ng/μl左右,-20 ℃保存備用。

1.4.3 RT-PCR標準品目的DNA的制備根據參考文獻[8],委托上海生工生物工程有限公司合成引物,P1:5′-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3′,P2:5′- CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3′。用正常組DNA進行PCR擴增,回收目的條帶擴增產物交由上海生工進行克隆測序,基因長度包含329堿基對(bp),對應Gene-Bank(NR_042817.1)無差別,委托上海生工抽提該克隆菌質粒作為熒光定量PCR標準品。計算標準品目的DNA的拷貝數,0.5 ng/μl 濃度20 μl體系PCR的拷貝數約為2.0×108copies/μl。

1.4.4 實時熒光定量RT-PCR檢測標準品0.5 ng/μl質粒稀釋10倍作為擴增模板,模板2 μl(5 ng/μl),P1、P2各0.3 μl(10 μmol/L),2×RealStar Green Fast Mixture 10 μl,超純水(dd H2O)補充體系至20 μl。RT-PCR程序設置:95 ℃(10 min)、95 ℃(15 s)、60 ℃(40 s)、72 ℃(30 s),循環39次,于72 ℃采集熒光信號,溶解曲線默認設置(65～95 ℃,0.5 ℃/5 s遞增)。標準曲線:標準品0.5 ng/μl采用10倍梯度稀釋3復孔法,7個梯度稀釋,添加無模板對照(NTC),CFX96TM實時PCR檢測儀運行標準曲線程序,檢驗方法的靈敏度。

1.4.5 特異性檢測本實驗室保存有Lactobacillus,Glucococcusaureus,Escherichiacoli,Bifidobacterium,Enterococcus,Bacteroides等菌屬可用于特異性檢測,A.muciniphila菌為陽性對照。

1.5 統計學分析采用BIO-RAD CFX96TM實時PCR檢測儀自帶軟件進行ΔCt分析,以正常組(Blank control)作為對照,每組8個樣本,3個復孔。

2 結果

2.1 標準曲線的制備及方法靈敏度梯度范圍(2.0×108copies/μl)～(2.0×102copies/μl),3個平行復孔重復,結果呈指數增長。見圖1。熔解曲線峰值在87.5 ℃且均為單個峰。見圖2。NTC表現出個別雜峰,Cq值≈31,提示靈敏度為2.0×102copies/μl。R2=0.998,斜率-3.464符合標準(MIQE指南[9]),截距38.666,擴增效率94.4%符合標準(MIQE指南90%～105%)。標準曲線橫坐標為DNA拷貝數,縱坐標為Cq值。見圖3。線性關系為Cq=-3.464×lgX+38.666,即X=10^[(Cq - 38.666)/ -3.464],其中X為RT-PCR結果對應的拷貝數copies/μl,線性良好。

圖1 A.muciniphila菌RT-PCR靈敏度實驗擴增曲線

圖2 A.muciniphila菌RT-PCR靈敏度實驗熔解曲線

圖3 A.muciniphila菌RT-PCR靈敏度與重復性實驗標準曲線

2.2 特異性陰性樣本表現擴增非特異性現象。見圖4。陽性對照樣組A.muciniphila菌表現特異性擴增,熔解曲線。見圖5。顯示A.muciniphila菌曲線峰值高突,證明方法具有良好的特異性。

圖4 A.muciniphila菌RT-PCR特異性實驗擴增曲線

圖5 A.muciniphila菌RT-PCR特異性實驗熔解曲線

2.3 RT-PCR絕對定量結果各組擴增結果呈指數增長期曲線平行。見圖6。熔解曲線除NTC顯示無擴增外,各組峰值在87.5 ℃,特異性高尖單峰。見圖7。ΔCt分析顯示,以正常組(Blank control)為組間參照時保和丸組(Baohe pills)的相對值明顯升高,5-氨基水楊酸組(Mesalazine)稍有降低,模型組(Model control)有一定升高;Cq值均值對應的拷貝數/μl提示與正常組比較,保和丸組的A.muciniphila細菌拷貝數顯著升高,模型組拷貝數較之約升高1倍,5-氨基水楊酸組拷貝數略有降低。見表1。各組樣本Cq值箱線圖顯示正常組內差異無統計學意義,模型組和5-氨基水楊酸組各自組內差異無統計學意義,模型組和保和丸組組內差異有統計學意義,但不超過0.5,符合MIQE指南[9],可以進行相關分析。見圖8。

表1 各組小鼠RT-PCR絕對定量結果

圖6 A.muciniphila菌RT-PCR各組實驗擴增曲線

圖7 A.muciniphila菌RT-PCR各組實驗熔解曲線

圖8 各組樣本Cq值箱線圖

3 討論

潰瘍性結腸炎的病機為本虛標實,濕(熱)、毒、痰、瘀等為主要病理因素,保和丸中山楂消肉食之積,神曲化谷物之積,萊菔子消痰濁之積,半夏、陳皮行氣化滯,茯苓健脾滲濕,連翹清熱散結。對于脾虛濕蘊夾雜食積者,可用參苓白術散合保和丸加減消食導滯[10]。藥理研究表明,保和丸主要有助消化、調節腸胃功能、抗潰瘍和抑菌的作用[2],能促進雙歧桿菌目菌群數量[11],還可促進梭菌目、脫硫弧菌目、產氫細菌目菌群數量,同時減少紅蝽菌目、擬桿菌目、芽孢桿菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、氣單胞菌目、疣微菌目菌群數量[12]。說明保和丸有一定選擇性抑菌作用,但其對UC菌群紊亂的調節作用機制尚不明確。

A.muciniphila菌通過多種機制維持腸道穩態。它能將黏蛋白分解,刺激杯狀細胞合成黏蛋白,從而達到動態平衡,維持腸道黏膜屏障穩定[13]。A.muciniphila菌胞外囊泡(Extracellular vesicle,EV)可使結腸上皮細胞產生的促炎因子白細胞介素(IL)-6生成減少。說明A.Muciniphila菌胞外囊泡能有效減輕對DSS誘導結腸炎的炎性程度,從而對正常的腸道組織起到保護作用。Amuc-1100作為A.muciniphila的一種外膜蛋白,通過激活由腸上皮細胞Toll樣受體2( Toll-like receptor 2,TLR2)介導的胞內信號,使得腸道黏膜屏障的保護作用增強。Amuc-1100還能誘導產生IL-10,起抗炎的作用[14]。研究顯示,潰瘍性結腸炎病情較嚴重患者中的A.muciniphila菌含量明顯下降[15]。二甲雙胍及一些寡聚果糖[16]、石榴鞣單寧[17]和膳食纖維[3]等可以增加腸道內A.muciniphila菌,而相關中成藥對其卻少有相關報道。

本研究用RT-PCR技術分析結果表明,保和丸對DSS誘導的UC模型小鼠腸道中A.muciniphila細菌有明顯促進增殖的作用。由于5-氨基水楊酸是一種抗菌藥,在實驗中表現出了輕微的抑制作用,而本研究中模型組小鼠腸道中的少量增殖情況可能是炎癥早期黏蛋白分泌增多進而促進了A.muciniphila菌的增殖。