銀翹解毒片(膠囊)中灰氈毛忍冬皂苷乙的檢查研究*

黃招光 薛 陽 周云峰 楊建冬 黃炳泉△

金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或帶初開的花,山銀花為忍冬科植物紅腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq)、灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz)、黃褐毛忍冬(Lonicera fulvoto-mentosa Hsu et S.C.Cheng)、華南忍冬(Lonicera confusa DC)的干燥花蕾或帶初開的花,兩者均具有清熱解毒,疏散風熱的功效,均收載于2020年版《中華人民共和國藥典·一部》[1-3]。但由于市面上山銀花的價格比金銀花低,有部分企業為節約成本會將山銀花摻偽甚至冒充金銀花進行投料生產[4-7],這將阻礙中醫藥產業的健康發展。據報道,山銀花含有灰氈毛忍冬皂苷乙成分,而金銀花并不含有[8],可通過測定該成分區分兩者的差異。銀翹解毒片(膠囊)由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子(炒)、桔梗、淡竹葉、甘草9味中藥組成,具有疏風解表、清熱解毒的作用,可用于風熱感冒引起的發熱頭痛、咳嗽口干、咽喉疼痛等癥[9,10]。為考察銀翹解毒片(膠囊)中金銀花的投料情況,該研究采用 TLC、HPLC、UPLC-MS/MS法建立了銀翹解毒片(膠囊)中灰氈毛忍冬皂苷乙的檢查方法,報道如下。

1 儀器與材料

Waters Acquity Uplc H-class/xevo TQD液相色譜質譜聯用儀(美國waters公司);Agilent 1260II高效液相色譜儀(配置蒸發光散射檢測器,美國Agilent公司);CAMAG雙波長紫外觀察箱(瑞士卡瑪公司);KH-250DB超聲儀(昆山禾創超聲儀器有限公司);DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)。

銀翹解毒片(膠囊)(31批,其他信息見表1);缺金銀花的陰性樣品(實驗室自制);灰氈毛忍冬皂苷乙(批號:111814-202106,含量:96.1%)、金銀花對照藥材(批號:121060-201608)、山銀花對照藥材(批號:121595-201202)來自中國食品藥品檢定研究院;硅膠G薄層板(批號:2021-10-09,煙臺市化學工業研究所);乙醇、硫酸、三氯甲烷、甲醇(TLC)、氨水、正丁醇為分析純,乙腈、甲醇、甲酸為色譜純,水為一級純化水。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 TLC檢查供試品溶液的制備:取本品5片,研細,加水50 ml使溶解,離心,取上清液,用水飽和的正丁醇振搖提取2次,每次30 ml,合并正丁醇液,用氨試液洗滌2次,每次30 ml,正丁醇液蒸干,殘渣加甲醇2 ml使溶解,作為供試品溶液。對照品溶液的制品:取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品,加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作為對照品溶液。薄層色譜法試驗,吸取供試品溶液 5～10 μl、對照品溶液各 5 μl,分別點于同一硅膠G 薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水(14∶10∶2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果:供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點,初篩有3批樣品可能存在山銀花摻偽投料的情況。

2.2 HPLC檢查色譜條件: 采用Agilent ZORBAX SBC18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),以甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)為流動相(梯度洗脫:0～2 min,90%B～90%B;2～8 min,90%B～30%B;8～13 min,30%B～30%B;13～15 min,30%B～10%B;15～20 min,10%B～10%B;20～21 min,10%B～90%B;21～28 min,90%B～90%B),采用蒸發光散射檢測器,流速為1 ml/min, 柱溫為 35 ℃。對照品溶液的制備:取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 ml中約含0.1 mg的溶液,搖勻,即得。供試品溶液的制備:取本品10片,研細,取約5 g,置100 ml具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 ml,稱重,超聲30 min,放冷,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。取對照品溶液和供試品溶液各20 μl,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。見圖1。結果顯示,疑似陽性樣品溶液的色譜圖中出現與對照品保留時間一致的色譜峰,共有4批樣品出現該色譜峰。

注:A 對照品;B 疑似陽性樣品溶液。圖1 HPLC色譜圖

注:A 陰性樣品;B 正常樣品;C 金銀花對照藥材;D 山銀花對照藥材;E 灰氈毛忍冬皂苷乙對照品;F 陽性樣品。圖2 HPLC色譜圖

2.3 UPLC-MS/MS確證對上述樣品采用 HPLC-MS/MS法進行確認。檢測條件:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.8 μm,50 mm×2.1 mm);乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)為流動相,流速:0.3 ml/min,梯度洗脫(0～2 min,95%B～95%B;2～5 min,95%B～25%B;5～7 min,25%B～25%B;7～9 min,25%B～95%B;9～12 min,95%B～95%B);柱溫:35 ℃;進樣量:5 μl;脫溶劑氣流量1000 L/h,錐孔氣流量50 L/h,脫溶劑氣溫度 600 ℃,監測模式MRM、Daughter scan,負離子掃描,檢測離子對m/z 1397.5→1074.5、m/z 1397.5→603.2和m/z 1397.5→471.3。對照品溶液:取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 ml含1.9528 μg 的溶液;供試品溶液:取本品細粉約0.5 g,置100 ml具塞錐形瓶中,精密加入甲醇50 ml,稱重,超聲30 min,放冷,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得;取金銀花對照藥材0.2 g、山銀花對照藥材0.2 g、缺金銀花的陰性樣品0.5 g按供試品溶液的制備方法同法制備溶液。見圖2。金銀花對照藥材溶液、缺金銀花的陰性樣品溶液和正常樣品溶液的色譜圖中均未出現與灰氈毛忍冬皂苷乙對照品溶液保留時間一致的離子流色譜峰,而山銀花對照藥材溶液、陽性樣品溶液的色譜圖中出現與對照品保留時間一致的色譜峰,且離子豐度比均一致,說明灰氈毛忍冬皂苷乙為山銀花的特征性成分,金銀花藥味并不含有。通過驗證,確有4批樣品檢出灰氈毛忍冬皂苷乙成分,批號分別為220601、210802、400326、BB04003。

3 討論

目前金銀花中藥材和飲片中混有山銀花的現象已較少見,但根據中國食品藥品檢定研究院發布的中成藥質量分析報告可知,有不少含有金銀花的中藥制劑檢出山銀花特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙[11,12],提示有部分企業會使用混有山銀花的金銀花原料進行違規生產,這有必要加強對含有金銀花藥味的中藥制劑的監管力度。該研究采用TLC、HPLC-ELSD、UPLC-MS/MS法對銀翹解毒片(膠囊)中金銀花的投料情況進行考察,發現HPLC-ELSD、UPLC-MS/MS法檢出灰氈毛忍冬皂苷乙的樣品批數高于TLC法,這可能與方法的靈敏度不一有關。共有3家企業4批次樣品檢出山銀花成分,說明這些企業的金銀花原料可能存在質量問題,存在山銀花摻偽的風險。現行的銀翹解毒片(膠囊)標準[1]不能有效反映金銀花投料的具體情況,對誤用或摻雜山銀花投料不能得到有效監督與控制,研究建立的灰氈毛忍冬皂苷乙檢查方法能準確甄別金銀花投料是否摻有山銀花,對全面控制該藥的質量具有重要意義。