乳雙歧桿菌Probio-M8發酵乳緩解便秘的作用

李培培，李樹森，孫二娜，王月嬌，劉巨龍*

（1.內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司，北京 101107）

便秘是常見的消化道疾病，主要表現為糞便干結、排便困難和排便次數少等，常見于兒童和老年人。兒童的腸胃功能尚未發育完全，容易受到環境、飲食和腸道菌群失調等因素的影響[1]；而老年人是由于身體機能退化、腸道功能降低、飲食結構不均衡、缺乏運動和飲水量減少等原因[2]，成為便秘的高發人群。便秘會降低患者的生活質量，嚴重時會威脅患者的健康，引起炎癥反應，破壞腸黏膜[3]，導致腹痛、腹脹、肛裂、痔瘡和腸穿孔，甚至會誘發高血壓、心血管疾病和結腸癌等[2，4]，同時由于排便壓力，部分人會患上不同程度的精神疾病[5]。目前便秘的治療方式主要有藥物、非藥物和手術治療3 種，藥物治療通常伴隨著副作用，長期使用會使患者的耐藥性增加，治療效果不佳[6]。腸道微生態失調是形成便秘的一種原因[7]，腸道菌群紊亂會導致膽汁酸代謝失調，引起近端結腸蠕動障礙，從而導致便秘的發生。益生菌可調節宿主腸道微生物的組成，改善腸道環境，被廣泛應用于緩解便秘的研究中，因其具有無副作用、可緩解腸道炎癥和促進腸道蠕動等優點，受到了廣泛的關注。雙歧桿菌是目前應用較多的益生菌，對便秘有很好的緩解效果。張琪等[8]通過動物實驗和人群實驗探究乳雙歧桿菌IU-100 對便秘的緩解作用，發現小鼠和受試者飲用IU-100 菌株發酵乳后，排便次數、時間和狀況等均得到改善。李亦漢等[3]使用兩歧雙歧桿菌CCFM1167 干預便秘小鼠，發現CCFM1167 可以通過減輕腸道炎癥達到緩解小鼠便秘的目的。綜上，諸多研究已經證實雙歧桿菌部分菌株對便秘存在緩解作用。

乳雙歧桿菌Probio-M8（BifidobacteriumlactisProbio-M8，Probio-M8）是從中國健康婦女母乳中篩選分離出的一株具有益生特性的菌株，研究發現Probio-M8菌株具有較高的膽鹽和胃腸液耐受性[9]，可以改善宿主體內炎癥因子水平，調節腸道菌群，并可緩解腹瀉的癥狀[10]。本研究通過動態體外仿生消化系統評價發酵乳中Probio-M8 菌株的胃腸液耐受性，并招募35 名便秘患者，開展28 d 的Probio-M8發酵乳干預實驗，探究Probio-M8發酵乳對便秘的緩解作用，以期為雙歧桿菌在便秘中的應用研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌株與材料

乳雙歧桿菌Probio-M8（BifidobacteriumlactisProbio-M8，Probio-M8）：內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室；商業基礎發酵劑PYS-010（由唾液鏈球菌嗜熱亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種組成）：北京科拓恒通生物技術股份有限公司。

生牛乳：蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司；白砂糖：中糧糖業有限公司；MRS 固體培養基：英國Oxoid 公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽（分析純）：青島海博生物技術有限公司；體外仿生胃腸模擬液粉劑（胃液模擬液粉劑、腸液模擬液粉劑）、CaCl2（分析純）、MgCl2（分析純）、胃蛋白酶（2 000 U/mL）、胰蛋白酶（100 U/mL）、膽鹽（10 mmol/L）：曉東宜健（蘇州）儀器設備有限公司；NaCl、NaHCO3、HCl（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

pHS-3C 型pH 計：上海雷磁技術有限公司；HWS28 型恒溫水浴鍋：上海智城分析儀器有限公司；SRH 60-70 型均質機：上海申鹿均質機有限公司；GNP-9080 型恒溫培養箱：天津市中環實驗電爐有限公司；HA-300MII1 型全自動高壓蒸汽滅菌鍋：日本HIRAYAMA 公司；CP2202C 型分析天平：奧豪斯儀器有限公司；DHSI-Ⅳ型動態人胃腸體外仿生消化設備：曉東宜?。ㄌK州）儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 益生菌發酵乳制備

將生牛乳預熱至45 ℃，添加白砂糖混合均勻，化料15 min 后升溫至60 ℃進行均質，均質壓力為20 MPa，隨后在95 ℃條件下殺菌5 min，殺菌完畢冷卻至37 ℃后接種商業基礎發酵劑（接種量為0.03‰）和Probio-M8 菌株（接種量為6×106CFU/mL），置于37 ℃恒溫培養箱中進行發酵，發酵至pH4.60 時停止，破乳攪拌隨后灌裝，置于4 ℃冷藏后熟。

1.2.2 益生菌發酵乳活菌數測定

采用GB 4789.34—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗雙歧桿菌檢驗》對Probio-M8發酵乳進行活菌數測定。

1.2.3 動態體外仿生消化系統菌株存活率測定

1.2.3.1 模擬液的配制

模擬液包括胃液模擬液（simulated gastric fluid，SGF）和腸液模擬液（simulated intestinal fluid，SIF）。SGF 的制備方法[11]：以配制100 mL 的SGF 為例，取80 mL 胃電解質儲備液（SGF 粉劑、0.825 mL MgCl2、3.25 mL 6 mol/L HCl）與50 μL CaCl2和18.5 mL 去離子水混合，用6 mol/L HCl 調節pH1.5，加入胃蛋白酶，調至胃蛋白酶的終濃度為800 U/mL，充分溶解后用0.22 μm 的無菌過濾膜進行過濾除菌，最后置于室溫陰涼處待用。SIF 的制備方法[11]：以配制100 mL 的SIF為例，取80 mL 腸電解質儲備液（SIF 粉劑、2.75 mL MgCl2、1.75 mL 6 mol/L HCl）與200 μL CaCl2和19 mL去離子水混合，用6 mol/L HCl 調節pH6.5，加入胰蛋白酶和膽鹽，調至胰蛋白酶和膽鹽的終濃度分別為200 U/mL 和20 mmol/L，充分溶解后用0.22 μm 的無菌過濾膜進行過濾除菌，最后放置室溫陰涼處待用。

1.2.3.2 動態體外仿生消化

動態體外仿生胃腸道消化設備主要由模擬食管、3D 仿生人胃、十二指腸、四節小腸和大腸過濾裝置組成，其已經被證實可以有效模擬發酵乳在胃腸道的消化過程[12]。試驗期間先打開設備電源，啟動并進行預熱，胃腸液的溫度控制在37 ℃左右，并根據成人胃腸道消化環境設定儀器各項參數（如胃腸消化液分泌速率、食道開放速率、胃和小腸蠕動頻率等）。設定好設備后，將發酵乳從進樣口倒入，分別在消化60 min 和120 min時從胃和腸道末端吸取4 mL 食糜進行活菌數測定。

1.2.3.3 發酵乳中益生菌活菌數測定與存活率計算

參考伍鵬等[11]的方法，分別測定Probio-M8發酵乳貯藏1 d 和28 d 時經過模擬胃腸道消化后的活菌數。當消化60 min 和120 min 時，分別在胃和腸道末端收集消化食糜，振蕩均勻后進行活菌計數。將經過消化0、60 min 和120 min 樣品的活菌數以N0、N60、N120（CFU/mL）表示，計算經消化60 min 和120 min 時菌株的存活率。消化60 min 時菌株在胃和腸道中的存活率按式（1）和（2）進行計算；消化120 min 時菌株在胃和腸道中的存活率按式（3）和（4）進行計算。

式中：S60min、S120min分別為發酵乳在胃中消化60、120 min 后Probio-M8 菌株的存活率，%；I60min、I120min分別為發酵乳在腸道中消化60、120 min 后Probio-M8 菌株的存活率，%；C0為發酵乳未經消化的Probio-M8 菌株活菌數，CFU/mL；CG60、CG120分別為胃內消化60、120 min 時Probio-M8發酵乳的活菌數，CFU/mL；V0為樣品體積，120 mL；V1、V11分別為消化60、120 min 胃中進入的模擬胃液總體積（含HCl），mL；CI60、CI120分別為腸道消化60、120 min 時Probio-M8發酵乳的活菌數，CFU/mL；V2、V22分別為消化60、120 min 腸道中進入的模擬腸液總體積（含NaHCO3），mL；4 為60 min 時從胃內取出的樣品體積，mL。

1.2.4 人群實驗設計

1）篩選標準。年齡20～50 歲；參考美國胃腸道委員會制定的羅馬Ⅳ臨床便秘診斷標準[13]，受試者應至少符合以下兩項癥狀：每4 次排便至少有1 次排便費力；每4 次排便至少有1 次排便類型為Bristol 糞便性狀分型中的1 型；每4 次排便至少有1 次有排便不盡、肛門阻塞感；每周排便次數少于3 次。

2）排除標準。15 d 前服用過抗生素、精神類藥物；確診患有腸道器質性疾?。蝗焉锘虿溉槠趮D女；對樣品成分過敏；拒絕簽署知情同意書。

3）干預措施。對符合篩選標準的35 名便秘患者進行7 d 排空期后，進行28 d 飲用期的臨床實驗，受試者每日飲用一瓶200 g 的Probio-M8發酵乳，活菌數為1×1010CFU/瓶。飲用期間，每周從排便頻次、排便類型和排便用力程度3 個方面對受試者便秘情況進行評價，每周進行詢問并記錄評分。排便類型評價參照Bristol 糞便性狀分型進行評分[14]，標準如表1所示。排便用力程度評分范圍為0～3[15-16]，分數增加表示排便用力程度增加。

表1 Bristol 糞便性狀分型評分標準Table 1 Bristol stool scoring scale

4）改善有效率計算。根據受試者對排便類型和排便用力程度的評分計算改善有效率[13，15]，并按照不同年齡段進行分析。改善有效率計算公式如下。

式中：C為改善有效率，%；W1為療效評估結果是痊愈、顯效和有效的人數；W0為總人數。

1.3 數據統計分析

采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析。顯著性水平為p＜0.05。由Origin Lab 2021 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵乳活菌數

足量的活菌數對于益生菌發揮益生功效極其重要，益生菌在進入體內后，會受到胃酸、膽鹽和各種消化酶等不利因素的影響，只有較高的活菌數才能抵御胃部的惡劣環境，保證一定數量的活菌到達腸道，并對宿主健康產生積極影響[17]。由此可知，Probio-M8發酵乳只有達到一定的活菌數才能更好地發揮菌株的益生功效。發酵結束后，對發酵乳中Probio-M8 進行活菌計數，結果為1.0×108CFU/g。根據GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》規定，發酵乳中的乳酸菌活菌數應達到106CFU/g 以上，Probio-M8發酵乳符合國家標準。此外，試驗期間對Probio-M8 菌株進行活菌數測定，發現整個試驗期間樣品的活菌數均可達107CFU/g 以上，符合國家標準。

2.2 發酵乳中Probio-M8 菌株存活率變化情況

動態體外仿生胃腸道消化設備可以模擬人體動態消化過程，較為真實地反映Probio-M8發酵乳經過人體消化后Probio-M8 菌株的存活率。貯藏1 d 和28 d的Probio-M8發酵乳經過動態體外仿生消化后，Probio-M8 菌株在胃內存活率變化情況如圖1所示。

圖1 貯藏1 d 和28 d 的發酵乳胃內Probio-M8 存活率Fig.1 Gastric survival rates of Probio-M8 in the fermented milk stored for 1 day and 28 days

由圖1 可知，在體外仿生胃內消化60 min 時，貯藏1 d 和28 d 的Probio-M8發酵乳中Probio-M8 菌株的存活率分別為82.3% 和74.3%；消化120 min 時，貯藏1 d 和28 d 的Probio-M8發酵乳中Probio-M8 菌株的存活率分別為46.9% 和42.1%。綜上，整個試驗期間的Probio-M8發酵乳在體外仿生胃內消化60 min后，Probio-M8 菌株的存活率可高達70% 以上；消化120 min 后，存活率仍可保持在40%以上。

貯藏1 d 和28 d 的Probio-M8發酵乳在體外仿生腸道內消化后，Probio-M8 菌株存活率變化情況如圖2所示。

圖2 貯藏1 d 和28 d 的發酵乳腸道內Probio-M8 存活率Fig.2 Intestinal survival rates of Probio-M8 in the fermented milk stored for 1 day and 28 days

由圖2 可知，在體外仿生腸道內消化60 min 時，貯藏1 d 和28 d 的Probio-M8發酵乳中Probio-M8 菌株的存活率分別為47.6% 和43.7%，消化結束后（120 min），貯藏1 d 和28 d 的Probio-M8發酵乳中Probio-M8 菌株的存活率分別為22.1% 和18.8%。綜上，整個試驗期間的發酵乳在體外仿生腸道內消化60 min 后，Probio-M8 菌株存活率可達40%以上；消化結束（120 min）時，仍保留20%左右的存活率。

綜上可知，貯藏1 d 和28 d 的Probio-M8發酵乳經過體外仿生胃腸道消化120 min 后，Probio-M8 菌株存活率可保持在18%以上，試驗初始和結束時Probio-M8 菌株存活率無明顯差異。表明Probio-M8 菌株具有較好的胃腸液耐受能力，在整個試驗期間都可維持一定的存活率，能夠在宿主胃腸道中大量存活，可發揮相應的健康功效。

2.3 人均排便頻次變化情況

排便次數少是便秘的一種癥狀表現，經研究可知，正常人的排便頻次應為每周3 次以上[18]。本研究受試者飲用發酵乳后人均排便頻次改變情況如圖3所示。

圖3 人均排便頻次Fig.3 Per capita defecation frequency

由圖3 可知，排空期受試者人均排便2.27 次，飲用Probio-M8發酵乳1 周后，受試者的人均排便頻次為3.87 次，到達了正常的排便頻次，與排空期存在顯著差異（p＜0.05）。第2 周受試者的人均排便頻次達到5.20 次，并且直到實驗結束每周人均排便頻次穩定在5 次以上。第4 周時，受試者人均排便頻次比排空期增加148%。結果表明，飲用Probio-M8發酵乳可以增加排便次數，縮短腸道運輸時間，使得腸道蠕動頻率恢復正常，從而改善便秘。

2.4 排便類型變化情況

以Bristol 糞便性狀分型為標準對糞便進行評價，受試者飲用Probio-M8發酵乳后，人均排便類型評分變化情況如圖4所示，排便類型改善有效率如表2所示。

圖4 人均排便類型評分Fig.4 Per capita stool scale score

表2 排便類型改善有效率Table 2 Stool scale improvement rate%

由圖4 可知，受試者飲用Probio-M8發酵乳后，人均排便類型評分明顯降低，第4 周評分較排空期顯著降低了63.67%（p＜0.05）。由表2 可知，不同年齡段的受試者在飲用發酵乳后，排便類型均得到了不同程度的改善。40～50 歲的受試者在飲用發酵乳3 周后改善有效率達到了100.00%，糞便表現為光滑柔軟、容易排出。20～30 歲的受試者在實驗結束后排便類型改善有效率為81.02%，30～40 歲受試者在實驗結束后排便類型改善有效率為77.46%，排便類型均得到了明顯改善，趨于正常狀態。糞便的性狀是便秘的直觀表現形式，堅硬的糞便會增加排便難度和延長排便時間。結果表明，Probio-M8發酵乳可以改善便秘患者的排便類型，減少水分吸收，使得糞便更易排出，改善便秘患者的生活質量。

2.5 排便用力程度變化情況

受試者飲用Probio-M8發酵乳后，排便用力程度評分變化情況如圖5所示，排便用力程度改善有效率如表3所示。

圖5 人均排便用力程度Fig.5 Per capita bowel movement effort

表3 排便用力程度改善有效率Table 3 Improvement rate of bowel movement effort%

由圖5 可知，在排空期內受試者均表現為排便困難，需要十分用力排出糞便，飲用Probio-M8發酵乳后，人均排便用力程度評分顯著降低（p＜0.05），飲用4周后人均排便用力程度評分降低了48.34%。由表3可知，不同年齡段的受試者飲用Probio-M8發酵乳后，排便用力程度改善有效率表現出了差別，40～50 歲的受試者第3 周的改善有效率達到了100.00%，效果明顯，表現為排便順暢。20～30 歲的受試者在實驗結束時排便用力程度改善有效率達到了87.50%。

3 討論

近年來隨著生活習慣的改變和社會壓力的增加，便秘患病率逐年增加，影響患者的健康及生活質量。越來越多的研究證明益生菌可以改善便秘，并已被投入便秘的輔助治療中。本研究發現Probio-M8發酵乳經過120 min 體外仿生消化后，Probio-M8 菌株存活率可保持20%左右，具有良好的耐胃腸液能力。人群實驗中，受試者在飲用Probio-M8發酵乳后，排便頻次增加、排便類型趨于正常、排便用力程度顯著降低，與相關研究人員對益生菌緩解便秘作用的研究結果一致[19]，具有緩解便秘的功效，未來可被廣泛應用到便秘的輔助治療中，用于改善便秘癥狀和提升患者的生活質量。本研究中Probio-M8發酵乳對不同年齡段受試者的排便類型和排便用力程度改善有效率呈現差異，30～40 歲的受試者改善有效率最低，可能與其在工作和生活方面的壓力較大有關，已有研究證實精神和心理因素是引起便秘的重要原因之一[20]。

關于益生菌干預便秘的研究中發現，益生菌可通過多種途徑改善便秘。白曉曄[21]發現便秘志愿者在食用益生菌發酵乳后，體內炎癥因子水平明顯下降，血液中炎癥因子C-反應因子和脂多糖顯著降低，抗炎因子脂多糖結合蛋白和白細胞介素-10 顯著增加，推測益生菌發酵乳可減輕炎癥，改善腸動力，促進腸道蠕動。劉文君[18]對比了實驗期間益生菌組和安慰劑組的腸道菌群組成，結果發現相比于安慰劑組，攝入植物乳植桿菌P9 后，便秘患者腸道內植物乳植桿菌和雙歧桿菌等有益菌株含量顯著升高，糞擬桿菌和芬氏別樣桿菌等菌株豐度下降，表明益生菌可以改變腸道菌群組成，以此對便秘產生影響。李亦漢[7]利用動物實驗，探究雙歧桿菌緩解便秘的機制，發現雙歧桿菌可以下調與腸道水分重吸收相關蛋白質的基因水平，以此改善排便類型。另外，雙歧桿菌還可以通過上調部分次級膽汁酸和下調部分初級膽汁酸的含量，影響膽汁酸代謝。膽汁酸受體的激活可以恢復免疫平衡、提高糞便的含水量和促進腸道蠕動，以此實現便秘的改善。綜上，推測Probio-M8發酵乳可能通過降低患者體內的炎癥水平、調節腸道菌群的組成和影響膽汁酸代謝等途徑，改善受試者的便秘癥狀。由于便秘成因復雜，實驗中不同年齡段的便秘患者對于Probio-M8發酵乳應答情況有所不同，具體成因還需要增加受試人群規模，完善整個實驗，并通過多組學聯用共同進行解析并深入研究。

4 結論

本研究通過動態體外仿生消化系統測試和人群實驗發現，乳雙歧桿菌Probio-M8發酵乳中益生菌Probio-M8 具有良好的耐胃腸液能力，能以活菌狀態到達腸道發揮益生功效，并且可以通過改善排便類型、增加排便頻次和降低排便用力程度緩解便秘癥狀。