植物乳桿菌發酵對小麥糊粉層粉營養組分的影響

耿浩，張智，溫紀平*，石松業，展小彬

（1.河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州 450000；2.國家小麥加工技術研發專業中心，河南鄭州 450000；3.黑龍江省北大荒米業集團有限公司，黑龍江哈爾濱 150000）

近年來，越來越多的研究表明，全谷物食品在預防慢性疾病中起重要作用[1]，許多流行病學研究表明，全谷物攝入量的增加能夠有效降低2 型糖尿病、心腦血管疾病和癌癥的發病率[2]。雖然這些作用的潛在機制尚未完全闡明，但是谷物麩皮層中含有針對代謝疾病的化學物質這一概念已經被更多的人認識和接受[3]。

小麥是全世界范圍內的主要糧食作物，且具有一定的營養價值，糊粉層是小麥麩皮的主要成分，糊粉層亦稱外胚乳，是位于籽粒皮層的內層細胞[4]，糊粉層細胞的細胞質中包含了大量礦物質（占小麥籽粒總礦物質含量的40%～60%）、蛋白質（約占小麥總蛋白質含量的15%）、B 族維生素、植物甾醇和植酸鹽[5-6]。小麥籽粒的硫胺素、核黃素以及大部分的類胡蘿卜素也主要存在于糊粉層粉中[7]，同時，小麥糊粉層也是木質素的主要來源，尤其是丁香樹脂醇。由于其營養豐富和潛在的健康作用，以及新型制粉技術的發展，小麥糊粉層在食品加工領域逐漸被用作代替麩皮的新型原料，因此在研究和開發全麥面包領域進行了較多應用，已有研究表明，以小麥糊粉層添加量為20% 制作面包，營養成分與全麥面包相當，但風味和外觀更接近精致小麥粉制作的面包，并且添加糊粉層粉的產品品質高于全麥面包[8]。然而，在小麥粉相關的產品中添加糊粉層，會表現出比市售白面包更小的比容和更粗糙的質地，這可能會影響消費者的感官接受度[9]。

酸面團發酵技術能夠將谷物粉轉化為口感好、易消化的產品。其產生作用的關鍵在于乳酸菌或酵母菌的應用，其中，乳酸菌在酸面團生產中起核心作用[10]。乳酸菌發酵是一種天然且可持續的方法，通過發酵處理能夠確保適當的衛生、感官和良好的保質期，同時提高食品的功能或營養價值[11]。在酸面團發酵過程中，乳酸菌主要負責酸化和蛋白質水解，這兩種現象在不同方面廣泛影響酸面團的感官和營養特性，通過生產有機酸使原料快速酸化，并通過合成乙醇、芳香化合物、細菌素、胞外多糖和酶，提升產品的綜合競爭力[12]。

植物乳桿菌屬于革蘭氏陽性菌株，以葡萄糖、果糖及乳糖等為原料進行新陳代謝，同時產酸，由于其較好的益生菌特性（良好的附著力、抗氧化性和抗菌特性），植物乳桿菌在食品工業中具有許多功能特性，例如提升營養價值、風味特性、抗氧化活性、抗菌活性，延長食品的保質期[13-14]，因此，植物乳桿菌常被用作食品微生物發酵劑，例如腌制酸菜、酸面團等[15]。使用植物乳桿菌對小麥糊粉層粉進行酸面團發酵，將明顯提高其抗氧化特性、風味物質含量以及營養功能特性，具有十分重要的意義。

本文以小麥糊粉層粉為原料，接種植物乳桿菌進行發酵，利用響應面優化試驗探究酸面團發酵對小麥糊粉層粉營養品質的影響，以期為糊粉層粉產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥糊粉層粉：山東知食坊食品科技有限公司；植物乳桿菌JCM1149 菌種：保藏于河南工業大學糧油食品學院；MRS 肉湯、MRS 培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；福林酚：上海麥克林生化科技股份有限公司；無水乙醇（分析純）：天津天力化學試劑有限公司；碳酸鈉（分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

手提式壓力蒸汽滅菌器（DSX-280B 型）：上海申安醫療器械廠；生化培養箱（SPX-250B-Z 型）：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；恒溫水浴振蕩器（THZ-82A 型）：江蘇杰瑞爾電器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9023A 型）：上海精宏實驗設備有限公司；單人單面垂直凈化工作臺（SW-CJ-1D 型）：蘇州智凈凈化設備有限公司；超聲波清洗器（KQ-500DE 型）：昆山市超聲儀器有限公司；紫外分光光度計（UV2150）：尤尼柯（上海）儀器有限公司；冷凍干燥機（Freezone6 plus型）：美國Labconco 有限公司；高速離心機（LXJ-IIB）：上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 JCM1149 菌株活化

挑取斜面保藏的JCM1149 菌株接種至10 mL 無菌MRS 液體培養基中，之后將其放置于37 ℃生化培養箱恒溫培養24 h，吸取1 mL 接種于100 mL MRS 培養基中，厭氧培養24 h 后，將菌液吸取至10 mL 離心管中，加入5 mL 滅菌生理鹽水，搖勻后，2 500 r/min 離心5 min，棄上清液，重復洗滌3 次后，加入5 mL 無菌水，搖勻，得到JCM1149 菌液。

1.3.2 酸面團及凍干樣品的制備

稱取100.0 g 小麥糊粉層粉，加入菌液和一定量的水，和面5 min，之后放置于恒溫培養箱中厭氧發酵，發酵完成后即為JCM1149 糊粉層粉酸面團，將酸面團裝在小型自封袋中，于-40 ℃冰箱中預凍備用。

將自封袋中預凍完成的酸面團樣品掰成小塊，放置于冷凍干燥機中凍干2 d，取出凍干樣品研磨成粉，用于后續試驗。

1.3.3 小麥糊粉層粉酸面團發酵單因素試驗

以發酵溫度35 ℃、發酵時間20 h，JCM1149 接種量1.4×107CFU/g 為基礎配方，分別對發酵溫度（25、30、35、40、45 ℃）、發酵時間（12、16、20、24、28 h）、JCM1149 接種量（1.4×105、1.4×106、1.4×107、1.4×108、1.4×109CFU/g）進行單因素試驗，研究各因素對發酵小麥糊粉層粉中多酚含量的影響。

1.3.4 小麥糊粉層粉酸面團發酵響應面試驗

參考1.3.3 單因素試驗結果，按照Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，選擇發酵溫度（A）、發酵時間（B）、JCM1149 接種量（C）為自變量，以JCM1149 糊粉層粉酸面團的多酚含量（R1）為響應值，進行響應面優化試驗，響應面試驗設計見表1。

表1 響應面試驗設計Table 1 Levels of response surface factors

1.3.5 酸面團總多酚含量的測定

參照徐小娟[16]的方法并稍作修改，準確稱取0.4 g酸面團凍干樣品于離心管中，加入80% 乙醇30 mL，磁力攪拌30 min，35 ℃超聲提取30 min 后2 500 r/min離心10 min，取上清液，再向離心管中加入20 mL 80%乙醇，重復上述操作，2 次上清液合并，乙醇定容于50 mL 容量瓶，搖勻待測。取1 mL 待測液加入0.5 mL福林酚混勻靜置5 min，加入3 mL 10%Na2CO3溶液搖勻，30 ℃水浴振蕩2 h，于740 nm 處測定吸光度。結果以沒食子酸當量表示mg/mL。測得的標準曲線為Y=29.091X+0.000 5，R2=0.999 8。

1.3.6 營養物含量的測定

膳食纖維含量：測定方法參照GB/T 5009.88—2014《食品安全國家標準食品中膳食纖維的測定》；粗蛋白含量：測定方法參照GB/T 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》；鈣含量：測定方法參照GB 5009.92—2016《食品安全國家標準食品中鈣的測定》；鉀含量：測定方法參照GB 5009.91—2017《食品安全國家標準食品中鉀、鈉的測定》；鎂含量：測定方法參照GB 5009.241—2017《食品安全國家標準食品中鎂的測定》；錳含量：測定方法參照GB 5009.242—2017《食品安全國家標準食品中錳的測定》；鈉含量：測定方法參照GB 5009.91—2017《食品安全國家標準食品中鉀、鈉的測定》；鐵含量：測定方法參照GB 5009.90—2016《食品安全國家標準食品中鐵的測定》；銅含量：測定方法參照GB 5009.13—2017《食品安全國家標準食品中銅的測定》；鋅含量：測定方法參照GB 5009.14—2017《食品安全國家標準食品中鋅的測定》；氨基酸組成：測定方法參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》；維生素B1；測定方法參照GB 5009.84—2016《食品安全國家標準食品中維生素B1的測定（含第一號修改單）》第一法；維生素B2：測定方法參照GB 5009.85—2016《食品安全國家標準食品中維生素B2的測定》第一法；維生素B6：測定方法參照GB 5009.154—2016《食品安全國家標準食品中維生素B6的測定》第一法；維生素E：測定方法參照GB 5009.82—2016《食品安全國家標準食品中維生素A、D、E 的測定》第一法；煙酸：測定方法參照GB 5009.89—2016《食品安全國家標準食品中煙酸和煙酰胺的測定》第一法；葉酸：測定方法參照GB 5009.211—2022《食品安全國家標準食品中葉酸的測定》。

1.4 數據統計與分析

采用Excel、Design-Expert 13.0.1.0 軟件進行數據分析，Origin 2019 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵溫度單因素試驗

在JCM1149 接種量為1.4×107CFU/g、發酵時間為20 h 的條件下，不同發酵溫度對JCM1149 酸面團中多酚含量的影響見圖1。

圖1 發酵溫度對JCM1149 酸面團多酚含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the content of total polyphenols in the sour dough fermented with JCM1149

由圖1 可知，微生物在發酵酸面團的過程中，代謝產生的蛋白酶、纖維素酶和果膠酶可從不溶解基質中釋放出結合酚類化合物，并將其水解為游離形式，從而提高發酵產物中的多酚含量[17]。結合發酵溫度對酸面團多酚含量的影響，最終選用30、35、40 ℃的溫度范圍進行后續響應面發酵試驗。

2.1.2 發酵時間單因素試驗

在發酵溫度為35 ℃、JCM1149 接種量為1.4×107CFU/g 時，發酵時間對JCM1149 酸面團中總多酚含量的影響見圖2。

圖2 發酵時間對JCM1149 酸面團多酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the content of total polyphenols in the sour dough fermented with JCM1149

如圖2所示，隨著發酵時間逐漸延長，酸面團內的微生物開始大量繁殖，分泌的酶量增加，促進了多酚類化合物的形成[18]，并在發酵時間為20 h 時達到最大值，之后，由于發酵菌株的生長活力開始下降，部分菌株死亡，細胞內的多種酶被釋放出來，導致了酸面團內的多酚物質被氧化、消化或降解[19]。結合發酵時間對酸面團多酚含量的影響，選用16、20、24 h 的發酵時間進行后續響應面試驗。

2.1.3 JCM1149 接種量單因素試驗

JCM1149 接種量對JCM1149 酸面團多酚含量的影響見圖3。

圖3 JCM1149 接種量對JCM1149 酸面團多酚含量的影響Fig.3 Effect of JCM1149 inoculum amount on the content of total polyphenols in the sour dough fermented with JCM1149

由圖3 可知，在發酵過程中，微生物能以芳香氨基酸（如酪氨酸和苯丙氨酸）為前體物質，在生物酶的作用下合成多酚、黃酮等次級產物[20]。當JCM1149 接種量增加，超出了適度范圍，此時由于發酵菌數量較多，使得酸面團培養基無法提供足夠的生長底物，反而增加了酒精和酸類產物的積累，限制了多酚、黃酮等產物的合成[21]。因此，選用1.4×106、1.4×107、1.4×108CFU/g的JCM1149 接種量進行后續響應面試驗。

2.2 響應面優化小麥糊粉層粉酸面團發酵工藝

2.2.1 響應面優化試驗結果

以JCM1149 糊粉層粉酸面團多酚含量（R1）為響應值，建立小麥糊粉層粉酸面團的發酵工藝，試驗設計及結果如表2所示。

表2 響應面試驗結果Table 2 Result of response surface

對試驗結果進行多項回歸擬合，得到回歸方程：多酚含量=-16.369 43+0.684 6A+0.164 2B+0.214 9C+0.003 0AB+0.003 4AC-0.006 1BC-0.010 9A2-0.005 4B2-0.156 4C2。

響應面二次模型的變量回歸分析見表3。

表3 響應面二次模型的變量回歸分析Table 3 Variable regression analysis of response surface quadratic model

由表3 可知，本試驗模型F值為315.93，p值＜0.000 1，說明回歸方程模擬性極顯著，失擬項p值為0.078 4＞0.05，說明方程擬合性良好，因此模型可靠。R2=0.997 5，R2Adj=0.994 4，說明試驗擬合性良好，試驗誤差較小，可以良好地反映試驗各因素與響應值之間的關系。得出主次因素為發酵時間＞發酵溫度＞JCM1149 接種量，響應值為多酚含量時，發酵的最佳條件為發酵時間22 h、發酵溫度38 ℃、JCM1149 接菌量1.4×107CFU/g，發酵后JCM1149 酸面團多酚含量為（2.31±0.01）mg/g。

2.2.2 響應面試驗各因素交互作用

響應面試驗中不同因素間交互作用見圖4。

不同因素間的交互作用AB、AC、BC對響應值均有顯著性影響（p＜0.05），由圖4 可知，各因素坐標點均位于響應面及等高線中心區域，進一步表明該模型擬合性良好，各因素對多酚含量有顯著提升作用。

2.3 植物乳桿菌發酵對小麥糊粉層粉營養物含量的影響

2.3.1 植物乳桿菌發酵對小麥糊粉層粉粗蛋白質及膳食纖維含量的影響

小麥糊粉層粉的蛋白質及膳食纖維含量見表4。

表4 小麥糊粉層粉的蛋白質及膳食纖維含量Table 4 Protein and dietary fiber content in the powder of wheat aleurone layer

由表4 可知，經植物乳桿菌發酵，小麥糊粉層粉中蛋白質含量有所降低，有研究表明，基質在發酵過程中粗蛋白含量出現小幅度下降，可能是由于基質中存在的霉菌將蛋白類物質轉化為無機氨態氮[22]，并且在發酵過程中，植物乳桿菌的生長繁殖也會消耗一定量的蛋白，因此，乳酸菌發酵導致的粗蛋白含量變化是微生物消耗蛋白和產生菌體蛋白的共同結果。

研究發現，不溶性膳食纖維會明顯降低面粉制品的產品性質，如硬度增加、色澤下降、口感粗糙等[23]。在膳食纖維含量分析中，發酵過的小麥糊粉層粉與未發酵相比，不溶性膳食纖維和總膳食纖維含量明顯降低，而可溶性膳食纖維含量明顯增加，這是因為在發酵過程中，纖維組分的化學性質發生變化，部分不溶性膳食纖維被轉化為可溶性膳食纖維，并且乳酸菌發酵可以激活雜糧基質中的天然纖維素酶，其中內切葡聚糖酶可將不溶性膳食纖維長鏈降解為小分子的可溶性膳食纖維[24-25]，乳酸菌在生長過程中產生的纖維素水解酶如β-葡聚糖酶和木聚糖酶可以降解麩皮類基質中纖維素成分的β-糖苷鍵，從而增加糊粉層中可溶性膳食纖維的含量。此外，乳酸菌發酵后，基質中乳酸含量增加，pH 值降低，在酸性條件下糖苷鍵斷裂產生新的還原性末端，降低了纖維類大分子的聚合度，同時增加了可溶性膳食纖維的含量[26]。這一變化使得纖維組分功能更優，且面團的加工適應性更好。

2.3.2 植物乳桿菌發酵對小麥糊粉層粉礦物質含量的影響

小麥糊粉層粉的礦物質含量見表5。

表5 小麥糊粉層粉的礦物質含量Table 5 Mineral content in the powder of wheat aleurone layer

由表5 可知，在小麥糊粉層中可檢測出多種礦物質成分，其中，鎂元素含量最高，其次是鈣，鈉元素相對較低，通過植物乳桿菌發酵，多數礦物質含量明顯上升，鐵元素與鉀元素含量略微降低，這其中包含了發酵與樣品凍干過程中水分變化造成的影響，以及部分微量元素隨水分流失而產生的差異。但在更多情況下，礦物質含量的變化主要是因為糊粉層粉中植酸含量以及植酸酶活性變化。植酸是谷物中主要的抗營養因子之一，在小麥、黑麥和水稻中主要存在于糊粉層組織，約占總植酸含量的90%[27]，植酸對營養屬性帶來的負面影響主要來自于它與鐵、鈣、鎂、鋅、錳等金屬離子都能形成不可溶解的螯合物，其中植酸與鋅形成的螯合物最為穩定，正因這種螯合特性，導致金屬離子流動性變差，妨礙人體吸收。植酸酶可將植酸去磷酸化，將植酸的化學結構由穩定的六磷酸結構降解為游離的無機磷酸鹽和肌醇磷酸酯[28]，從而釋放被植酸螯合的金屬離子，恢復其溶解性并提高生物利用率。植酸酶存在于谷物、乳酸菌和酵母菌中，且常伴隨環境表現出不同活性，而在發酵過程中，碳水化合物在沒有外部電子受體的情況下被氧化以釋放能量，同時，發酵過程中pH值逐漸降低，植酸酶活性在某一時刻達到最高，從而使原料中植酸含量明顯減少，礦物質含量增加，因此，酸面團發酵是溶解小麥面團中礦物質的有效手段。

2.3.3 植物乳桿菌發酵對小麥糊粉層粉B 族維生素含量的影響

維生素是維持人體代謝的重要營養素，但因在人體內合成受限，往往通過食物從外界獲取。谷物是維生素的優質天然來源，尤其是核黃素、煙酸、葉酸等B 族維生素含量豐富，對維持機體維生素平衡具有一定的積極作用[29]。B 族維生素含量的測定結果見圖5。

圖5 小麥糊粉層粉的B 族維生素含量Fig.5 Content of B vitamins in the powder of wheat aleurone layer

由圖5 可知，在檢測出的維生素中，煙酸和維生素E 含量最高，經植物乳桿菌發酵處理，含量較之前相比分別提升了50.90% 和79.29%，此外VB1、VB2、VB6含量均有明顯提升，這可能由于發酵過程中有機酸不斷積累，造成酸度下降，維生素對發酵時期pH 值具有較強依賴性，B 族維生素產生的最佳pH6.5 左右[30]。在此過程中，葉酸含量無明顯變化，不同菌株對葉酸含量影響的差異性較大，具體原因有待進一步研究。

2.3.4 植物乳桿菌發酵對小麥糊粉層粉游離氨基酸含量的影響

氨基酸是蛋白質的基本組成單位，其含量和種類常作為食品營養價值和風味的重要評價指標。通過對游離氨基酸含量的檢測，結果如表6所示。

表6 小麥糊粉層粉發酵前后氨基酸含量Table 6 Content of amino acids in the powder of wheat aleurone layer before and after fermentation mg/g

由表6 可知，通過優化過后的發酵條件對小麥糊粉層進行發酵處理，其氨基酸總量和必需氨基酸含量相比發酵前分別提升了5.46% 和18.19%，其中，蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）含量與發酵前相比均顯著提升（P＜0.05）。

氨基酸去向見圖6。

圖6 氨基酸去向Fig.6 Fates of amino acids

由圖6 可知，蛋白質分解為多肽，在肽酶的作用下分解為Val、Leu、Phe，蛋白質分解主要由于發酵過程中酸度上升，糊粉層組分中內源性蛋白酶被激活導致的，Val、Leu 為支鏈氨基酸，Leu 能更快地分解、轉化為葡萄糖，減少運動過程中肌肉損傷和延遲疲勞[31]，而Val 作為肌肉代謝和協調所必需，在保持身體氮平衡上具有重要的作用[32]，蛋白質分解導致Val、Leu 含量上升，這也與粗蛋白含量下降結果一致。Lys 和Thr 通過三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA），由草酰乙酸分解轉化而來。Ser 通過糖酵解途徑，以3-磷酸甘油酸為碳骨架合成而來，作為一種功能性氨基酸，在調控機體免疫功能、抗氧化應激和治療代謝疾病等方面發揮著重要的生物學作用[33]。Ile 作為動物重要的必需氨基酸，能夠顯著提高小腸的絨毛高度，促進腸道的吸收功能和屏障功能[34]。Phe 和Tyr 作為芳香族氨基酸，與發酵面團的風味密切相關，表明乳酸菌發酵能夠顯著提升食品的風味物質含量。此外，天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）經植物乳桿菌發酵后含量顯著降低，這可能是由于發酵過程中微生物生長消耗以及發酵后期多種可揮發性酸形成。通過對氨基酸含量分析表明，植物乳桿菌發酵能夠一定程度上提升小麥糊粉層的營養功能和感官風味。

3 結論

本研究以小麥糊粉層粉為原料，以植物乳桿菌JCW1149 為發酵劑進行酸面團發酵，以小麥糊粉層粉多酚含量為指標，通過單因素及響應面試驗得出最佳的發酵條件為發酵時間22 h、發酵溫度38 ℃、JCM1149接種量為1.4×107CFU/g，在此條件下測得的多酚含量為（2.31±0.01）mg/g，對今后糊粉層粉的生產應用具有參考意義。通過對比發酵前后營養物質含量發現，發酵后蛋白含量下降，可溶性膳食纖維含量提高，不溶性膳食纖維含量下降，總膳食纖維含量降低；多數礦物質含量明顯上升，鐵元素與鉀元素含量略微降低，表明植物乳桿菌發酵對提升礦物質含量具有一定的促進作用。植物乳桿菌發酵處理能夠明顯提升維生素含量，促進維生素的轉化，有效提高糊粉層粉的營養價值。對游離氨基酸含量進行測定，結果表明植物乳桿菌發酵能夠促進粗蛋白分解，從而釋放多種功能性氨基酸，且芳香族氨基酸含量明顯提升，表明發酵處理對糊粉層食品的風味有一定提升。綜上，植物乳桿菌發酵對小麥糊粉層粉的實際應用有一定促進作用，對于小麥制品的流變特性有一定程度的改良效果，且發酵后的糊粉層粉香氣濃郁，為后續將糊粉層粉的加工及應用提供參考。