柿子酵素發酵工藝優化及品質評價

田文靜，武亞帥，陳昊，黃河，趙東瑞，馬長路*

（1.北京農業職業學院食品與生物工程系，北京 102442；2.北京工商大學食品質量與安全北京實驗室，北京 100048）

柿子，為柿樹科柿屬植物的果實。我國是柿屬植物資源最為豐富的國家，柿子在我國分布范圍廣泛，其年產量位居世界第一[1-2]。柿子風味獨特，深受國人喜愛。同時，柿子富含多種功能成分，如多酚類、黃酮類、丹寧類、氨基酸、維生素、礦物質等[3-6]，對維持機體穩態具有重要促進作用。研究表明，柿果中富含的多酚類物質具有抗氧化活性，可有效預防動脈粥樣硬化、心腦血管等疾病[7]。這為柿子及其相關功能食品的開發應用提供了良好的基礎。

酵素是由一種或者多種水果、蔬菜、菌類等日常生活中的食用原料經過多種益生菌發酵制得，含有豐富的酶、礦物質、維生素、抗氧化物質等功能成分[8-10]。目前，酵素可依據原料分類，主要包括果蔬酵素、谷物類酵素、菌菇類酵素等。其中，果蔬酵素由于其口感清爽、營養豐富，深受人們認可[11-14]。同時，果蔬等植物性食品，雖營養豐富，但貯藏性差，且其功能成分的生物利用度較低。而果蔬酵素為解決上述問題提供了思路。果蔬經過益生菌發酵制成的果蔬酵素，富含大量具有益生功能的次級代謝產物，極大改善果蔬功能成分的利用度[15-17]。

目前，盡管我國柿子資源豐富，為柿子的加工生產提供了原料保障，但由于柿子單寧含量較高，有澀味，不宜直接食用；且柿果的水分、糖、多酚含量都較高，采摘后容易腐爛、褐變，給柿果的運輸和貯藏帶來困難[18-19]。此外，我國柿子加工程度較低、加工產品品類較少，主要有柿干、柿醋、柿酒等，在市場上也不具備優勢。因此，柿子加工的新途徑和新產品成為亟待解決的問題。

基于柿子的優良風味、功能屬性及資源豐富性，本研究擬以“磨盤柿”為主要原料，基于功能品質參數及感官評價結果，優化發酵工藝，制備益生菌發酵柿子酵素；并對柿子酵素的風味品質和功能品質進行評價，以期為構建柿子酵素的綜合評價體系及柿子的高值化利用和精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

磨盤柿，購于北京市房山區張坊鎮農戶；乳酸菌復合發酵劑：安琪酵母股份有限公司；2，2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS+]自由基清除能力測定試劑盒、2，2-聯苯基-1-苦基肼基（2，2- diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定試劑盒、羥基自由基清除能力測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司；風味物質標準品（分析純）：百靈威科技（北京）有限公司；有機酸標準品（分析純）：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器

電子分析天平（BL-2200H）、紫外可見分光光度計（UV 1780）：日本島津儀器有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：河南省鞏義市予華儀器有限公司；雷磁酸度計（PSHJ-5）：上海精密科學儀器有限公司；恒溫培養箱（DH5000BⅡ）：天津市泰斯特儀器有限公司；手持糖度儀（TD-80）：南京南達分析儀器應用研究所；紅外線干燥箱（102-1）：北京市興爭儀器設備廠；酶標儀（SpectraMax M2e）：美國Molecular Devices 公司；高效液相色譜儀（UltiMate 3000）：美國Thermo 公司；嗅聞儀（ODP C200）：德國GERSTEL 公司；渦旋儀（VORTEX 2）：德國IKA 公司；氣相色譜-質譜聯用儀（7890B-5977A）：美國Agilent 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 柿子酵素生產工藝

柿子酵素生產工藝流程見圖1。

圖1 工藝流程圖Fig.1 The process flow chart

操作要點為：1）預處理，選取新鮮、成熟、無腐敗變質的柿果沖洗清潔干凈后，瀝干水分，用75% 酒精均勻噴灑，密封放置24 h，進行脫澀，再除去柿梗柿蒂等雜物；2）加水打漿，將預處理后的柿果加入純凈水打碎制漿（加水量為柿果肉質量的2 倍），同時加入0.4%的VC護色，制備成柿子漿；3）調糖，在柿子漿中添加白砂糖，將其糖度調整至20%；4）滅菌，將柿子漿以95 ℃溫水浴處理10～15 min，以殺滅柿子漿中的微生物；5）接種發酵，將殺菌后的柿子漿冷卻至30～40 ℃，接種乳酸菌復合發酵劑，密封，并放置于30～40 ℃恒溫箱進行發酵。其中，接種的乳酸菌復合發酵劑的量為每100 g柿子漿中添加0.05 g 乳酸菌復合發酵劑（植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜熱鏈球菌活菌數的比值為1∶2∶1∶3）；6）過濾除菌，采用100 目篩過濾發酵柿子漿，除去濾渣，分離出柿子酵素發酵原液，然后使用0.22 μm 醋酸纖維酯微孔濾膜對柿子酵素發酵原液進行過濾除菌，即得柿子酵素成品。

1.3.2 柿子酵素工藝優化

以SOD 活力為考察指標，采用單因素試驗對白砂糖添加量（1%、5%、10%、20%、30%、40%）、發酵劑接種量（0.01%、0.03%、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%）、發酵溫度（10、20、30、40、50、60 ℃）、發酵時間（1、3、6、9、12、15 d）4 個參數水平進行優化。在此基礎上，以SOD活力及感官評價為考察指標，采用正交試驗，確定柿子酵素的最適發酵工藝參數。

1.3.3 理化成分測定

柿子酵素產品理化指標測定中，pH 值采用pH 計測定；糖度采用手持糖度計測定；總酸含量測定參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》[20]；總酚測定采用福林酚法，參照文獻[21]方法，以沒食子酸為標準品，繪制沒食子酸標準曲線，樣品總酚含量以沒食子酸當量表示。

1.3.4 抗氧化能力測定

取100 μL 樣品，采用ABTS+自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力、羥基自由基清除能力、SOD 活力、CAT 活力試劑盒方法進行測定。

1.3.5 有機酸測定

有機酸含量測定參照GB 5009.157—2016《食品安全國家標準食品中有機酸的測定》[22]。分別配制有機酸標準母液，依次稀釋配制標準工作液，以標準工作液含量-響應值擬合繪制標準曲線。

1.3.6 固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）提取條件

取10 mL 柿子酵素樣品，加入頂空進樣瓶中，加入去離子水稀釋1 倍，并加鹽至飽和；加入攪拌子，將頂空進樣瓶密封好，置于45 ℃恒溫水浴鍋中平衡15 min，轉速為600 r/min；選取涂層為50/30 mm DVB/CAR/PDMS 的萃取纖維在45 ℃、600 r/min 條件下萃取50 min；萃取完畢后取出纖維頭，插入氣相色譜儀進樣口，解吸5 min，解吸溫度為250 ℃，用于氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析。

1.3.7 氣相色譜-質譜-嗅聞（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）分析條件

氣相色譜條件：色譜柱型號為DB-WAX 毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為He（99.999%）；恒流氣相色譜柱流速1.5 mL/min；不分流模式進樣1 μL，進樣口溫度為250 ℃；升溫程序為初溫40 ℃，以10 ℃/min升溫速率升至50 ℃，并保持20 min，再以1 ℃/min 升溫速率升至70 ℃，并保持10 min，后以3 ℃/min 升溫速率升至250 ℃，并保持15 min。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；傳輸管線溫度為250 ℃；定性采用Full Scan 掃描模式；掃描質量范圍m/z 45～350。

嗅聞儀條件：嗅聞儀傳輸線及嗅聞口溫度為250 ℃。評價小組人員進行氣相色譜-嗅聞（gas chromatographyolfactometry，GC-O）分析，記錄色譜流出物保留時間與香氣特征。

1.3.8 定性分析

提取分離得到的風味物質采用NIST14 譜庫檢索進行初步定性，進一步通過與標準品在同樣GC-MS-O分析條件下得到的質譜圖、香氣特征對比進行定性。

1.3.9 風味物質香氣表達評價

按照1.3.6、1.3.7、1.3.8 所述方法提取并分析風味物質。進樣分析前，柿子酵素產品以2 倍為稀釋倍數依次進行稀釋（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256），隨后進樣分析。目標風味物質的稀釋因子（flavor dilution，FD）為在進行GC-O 分析時能被嗅覺感知的最大稀釋倍數。

1.3.10 感官評價

選取30 名經專業訓練的評價人員（其中男女均為15 人，年齡均為18～25 歲）組成感官評價小組，對柿子酵素的感官屬性進行評價，分別為色澤、滋味（酸味、甜味）、口感（細膩感、醇厚感）、風味（果香、酒香、甜香）。并在4 個感官評價屬性包含的8 個類別上分別進行打分。感官評分標準見表1。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory scoring criteria

1.4 數據分析

每個獨立試驗均進行3 次以上平行試驗。結果以均值±標準差表示。應用SPSS 22.0 對感官評價結果進行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 柿子酵素發酵工藝優化

2.1.1 柿子酵素發酵工藝單因素優化結果分析

SOD 能專一地清除體內有害的自由基，以解除自由基氧化體內的某些組成成分而造成的機體損害（如使脂質過氧化，導致人體衰老，加速組織細胞凋亡并可能引起腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥等病變），因而，SOD活性現已成為抗氧化功能食品的一個重要指標[23-24]。

本研究采用單因素試驗，以柿子酵素產品的SOD活力為考察指標，分別對糖添加量、發酵劑接種量、發酵溫度、發酵時間進行參數優化，結果如圖2所示。

圖2 單因素優化試驗Fig.2 Single factor optimizing test

由圖2A 可知，在其他因素水平一定的條件下，白砂糖添加量對柿子酵素產品的SOD 活力具有顯著影響（P＜0.05）。隨著白砂糖添加量的逐步增加，柿子酵素產品的SOD 活力呈現先上升后下降的變化趨勢。其中，白砂糖添加量水平為10%、20% 時，對應柿子酵素產品的SOD 活力顯著高于其他4 個水平。因此，最終選擇白砂糖添加量10%、20%、30%作為最優水平范圍。

由圖2B 可知，在其他因素水平一定的條件下，發酵劑接種量對柿子酵素產品的SOD 活力具有顯著影響（P＜0.05）。隨著發酵劑接種量的逐步增加，柿子酵素產品的SOD 活力呈現先上升后下降的變化趨勢。其中，發酵劑接種量為0.05%、0.10%、0.20% 時，對應柿子酵素產品的SOD 活力顯著高于其他3 個水平。依據結果，最終選擇發酵劑接種量0.05%、0.10%、0.20%作為后續正交試驗的水平范圍。

由圖2C 可知，在其他因素水平一定的條件下，發酵溫度對柿子酵素產品的SOD 活力具有顯著影響（P＜0.05）。隨著發酵溫度的逐步提升，柿子酵素產品的SOD 活力呈現先上升后下降的變化趨勢。其中，發酵溫度為20、30、40 ℃時，對應柿子酵素產品的SOD 活力顯著高于其他3 個水平。依據結果，最終選擇發酵溫度30 ℃，作為后續正交試驗的水平基準。

由圖2D 可知，在其他因素水平一定的條件下，發酵時間對柿子酵素產品的SOD 活力具有顯著影響（P＜0.05）。隨著發酵時間的逐步延長，柿子酵素產品的SOD 活力呈現先上升后下降的變化趨勢。其中，發酵時間水平為3、6、9 d 時，對應柿子酵素產品的SOD 活力顯著高于其他3 個水平。依據結果，最終選擇發酵時間6 d，作為后續正交試驗的水平基準。

2.1.2 正交試驗優化結果分析

在單因素試驗基礎上，確定正交試驗的因素和水平如表2。采用正交試驗，分別以柿子酵素產品的SOD 活力、感官評價結果為考察指標，對白砂糖添加量、發酵劑接種量、發酵溫度和發酵時間進行進一步參數優化，結果如表3、表4。

表2 正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 SOD 活力正交試驗Table 3 Orthogonal test of SOD enzyme activity

表4 感官評價正交試驗Table 4 Orthogonal test table of sensory evaluation

由表3 可知，白砂糖添加量（A）、發酵劑接種量（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）均對柿子酵素產品的SOD 活力產生影響。極差（R）結果顯示，4 個因素的影響度大小排序為發酵溫度（C）＞發酵時間（D）＞發酵劑接種量（B）＞白砂糖添加量（A）。依據SOD 活力正交試驗結果，最優水平組合為A1B2C1D3，即白砂糖添加量為10%，發酵劑接種量為0.10%，發酵溫度為30 ℃，發酵時間為7 d。

由表4 可知，白砂糖添加量（A）、發酵劑接種量（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）均對柿子酵素產品的感官產生影響。極差（R）結果顯示，4 個因素的影響度大小排序為發酵溫度（C）＞發酵劑接種量（B）＞白砂糖添加量（A）＞發酵時間（D）。依據感官評價正交試驗結果，最優水平組合為A1B2C1D2，即白砂糖添加量為10%，發酵劑接種量為0.10%，發酵溫度為30 ℃，發酵時間為6 d。

基于上述試驗結果，分別以A1B2C1D3（SOD 活力最優水平組合）和A1B2C1D2（感官評價最優水平組合）進行益生菌柿子酵素產品制備。分別對制備后的柿子酵素產品進行SOD 活力的測定及感官評價，結果如表5、圖3所示。

表5 最優組合SOD 活力及感官評價結果Table 5 SOD enzyme activity and sensory evaluation results for the optimal combination

圖3 感官評價雷達圖Fig.3 Sensory evaluation radar map

由表5 可知，A1B2C1D2（感官評價最優水平組合）水平條件下，制備的柿子酵素樣品的感官評分顯著高于A1B2C1D3（SOD 活力最優水平組合）水平組合（P＜0.05），達到74.00±2.65。由圖3 各感官屬性評分結果可知，A1B2C1D2水平條件下制備的柿子酵素樣品，其感官品質更加均衡；而A1B2C1D3水平條件下制備的柿子酵素產品，其酸味較突出，感官品質均衡性稍差于A1B2C1D2水平條件下制備的柿子酵素樣品。而就SOD 活力而言，兩種組合制備的柿子酵素樣品無顯著差異。

綜合考慮，最終確定白砂糖添加量為10%，發酵劑接種量為0.10%，發酵溫度為30 ℃，發酵時間為6 d 作為柿子酵素發酵制備的最優工藝。

2.2 柿子酵素的理化性質、抗氧化性能和有機酸分布

對最優工藝條件下制備的柿子酵素樣品的指標性能進行測定，包括pH 值、糖度、總酸、總酚、抗氧化性能（ABTS+自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力、羥基自由基清除能力、CAT 活力）、有機酸分布。有機酸定量參數見表6，指標性能結果如表7所示。

表6 有機酸定量參數Table 6 Quantitative parameters for organic acids

表7 指標測定結果Table 7 Index measurement results

表7 結果顯示，在最優工藝條件下制備的柿子酵素產品，總酚含量達到（247.33±4.15）mg 沒食子酸/kg，對產品的抗氧化性能、感官品質有直接貢獻。糖度為（8.93±0.65）°Bx，總酸含量為（8.57±0.38）g/L，這為感官品質的均衡性提供保證。同時，在最優工藝條件下制備的柿子酵素樣品，其抗氧化性能優良，脂溶性體系DPPH 自由基清除率達到（90.23±4.40）%，水溶性體系ABTS+自由基清除率達到（94.72±2.81）%，而CAT 活力為（426.62±6.90）U/mL，羥基自由基清除率達到（45.18±4.76）%。與柿子醋、柿子酒、蘋果酵素等相比，其抗氧化性能較好[4，17，25]。優良的抗氧化性一方面有助于穩定產品品質，另一方面能夠提供功效活性。此外，其有機酸含量分布中，乳酸、乙酸含量較高，顯著高于草酸、蘋果酸、琥珀酸（P＜0.05）。有機酸一方面能夠參與機體物質代謝、能量代謝、體現功效活性；另一方面為促進益生菌在腸道定殖、維持腸道穩態有積極作用[26]；同時適量的有機酸還對感官品質有正面貢獻，能夠增加滋味的醇厚感和風味豐富性。

2.3 香氣評價結果分析

本研究借助SPME 結合GC-MS-O，采用稀釋評價法，對最優水平條件下制備的柿子酵素樣品的風味物質進行篩選鑒定及香氣表達評價，鑒定方法為香氣特征比對、質譜比對和標準品比對，結果見表8。

表8 風味物質鑒定分析及香氣表達評價Table 8 Identification analysis and aroma expression evaluation on aroma compounds

由表8 可知，共計篩選鑒定出48 種風味物質，包括酯類14 種、醇類11 種、酸類9 種、芳香族類9 種、呋喃類3 種、酮類1 種、含硫化合物1 種。其中，從風味物質種類分布來看，酯類、醇類、酸類、芳香族類風味物質種類相對較多，是柿子酵素的主體風味物質。這與柿子醋、柿子酒的風味物質組成相似[2，4，16，20]。而從香氣表達結果來看，按風味物質類別，酯類風味物質（FD=1 224）的香氣表達最強，對產品的風味品質有決定性貢獻，主要香氣特征為果香、甜香。其后依次是酸類風味物質（FD=568，主要香氣特征為奶酪香）、芳香族類風味物質（FD=484，主要香氣特征為花香、甜香）、醇類風味物質（FD=130，主要香氣特征為糧香、果香、酒香）、含硫風味物質（FD=32，主要香氣特征為菜香）、酮類風味物質（FD=16，主要香氣特征為奶香）、呋喃類風味物質（FD=10，主要香氣特征為焦香）。

而在鑒定出的風味物質中，己酸乙酯（FD=256，香氣特征為果香）、辛酸乙酯（FD=256，香氣特征為甜香）的香氣貢獻最大。同時，苯乙醇（FD=128，香氣特征為花香）、苯乙酸乙酯（FD=128，香氣特征為花香）、乙酸（FD=128，香氣特征為醋味）、丁酸（FD=128，香氣特征為奶酪香）、辛酸（FD=128，香氣特征為奶酪香）、丁酸乙酯（FD=128，香氣特征為香蕉香）、3-甲基丁酸乙酯（FD=128，香氣特征為甜香）、庚酸乙酯（FD=128，香氣特征為果香）的香氣表達強度也較強，是柿子酵素的重要風味物質。上述風味物質相互作用，共同構成柿子酵素的主體風味，使柿子酵素樣品的香氣層次豐富，風味品質優良。

3 結論

本研究以“磨盤柿”為主要原料，借助單因素及正交試驗，以功能品質（SOD 活力）和感官品質（感官評分）為考察指標，對益生菌柿子酵素的發酵工藝進行優化，最終確定白砂糖添加量為10%，發酵劑接種量為0.10%，發酵溫度為30 ℃，發酵時間為6 d 作為柿子酵素發酵制備的最優水平。在最優水平下制備柿子酵素產品，并對其理化性質、抗氧化性能和有機酸進行測定，結果顯示，柿子酵素的總酚含量為（247.33±4.15）mg 沒食子酸/kg，對產品的抗氧化性能、感官品質有直接貢獻；糖度為（8.93±0.65）°Bx，總酸含量為（8.57±0.38）g/L，為感官品質的均衡性提供了保證。同時，柿子酵素樣品的抗氧化性能優良，DPPH 自由基清除率達到（90.23±4.40）%，ABTS+自由基清除率達到（94.72±2.81）%，而CAT 活力為（426.62±6.90）U/mL，羥基自由基清除率達到（45.18±4.76）%。優良的抗氧化性一方面有助于穩定產品品質，另一方面能夠提供功效活性。此外，在有機酸含量分布中，乳酸、乙酸含量較高，顯著高于草酸、蘋果酸、琥珀酸（P＜0.05），其對柿子酵素的感官品質有正面貢獻，能夠增加滋味的醇厚感和風味豐富性。柿子酵素產品的風味評價結果顯示，酯類、醇類、酸類、芳香族類風味物質種類相對較多，是柿子酵素的主體風味物質，其中，己酸乙酯和辛酸乙酯的香氣貢獻最大；同時，苯乙醇、苯乙酸乙酯、乙酸、丁酸、辛酸、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯的香氣表達強度也較強，是柿子酵素的重要風味物質。多種風味物質相互作用，共同構成柿子酵素的主體風味，使本柿子酵素產品的香氣層次豐富，風味品質優良。本研究為柿子的高值化利用和精深加工提供參考。