發芽小麥高溫α-淀粉酶擠壓膨化工藝優化

馬培軒，武蕊，王玉茜，徐均，吳同華，張智，單良*

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；3.新疆沙棘精深加工工程技術研究中心，新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州 845350；4.徐州市龍頭山釀造有限公司，江蘇徐州 221000）

小麥（TriticumaestivumL.）作為醬油、黃酒、食醋等釀造食品中常用的淀粉質原料之一，在釀造過程中能夠為微生物提供生長代謝所需的碳源，并降解為小分子糖類、醇類、有機酸和脂類，其中還原糖是釀造食品中滋味和色澤的重要前體物質，經過復雜的生化反應，能夠賦予釀造食品獨特的風味和色澤[1-2]。阿魏酸（ferulic acid，FA）又稱3-甲氧基-4-羥基肉桂酸，是釀造食品中重要的風味物質來源之一，其在阿魏酸脫羧酶和4-乙烯基愈創木酚還原酶的共同作用下可以生成4-乙基愈創木酚改善釀造食品的風味[3-4]；此外，阿魏酸還具有抗氧化、抗菌消炎、抑制腫瘤等多種功能，能夠提高釀造食品的營養價值[4-7]。傳統釀造過程中常用的生面粉和小麥粉等原料還原糖含量低，阿魏酸等酚酸類物質主要以結合態的形式存在于種皮和胚中難以被釋放，不易在釀造過程中被微生物轉化利用，從而造成釀造食品風味和口感差等問題[8]。

谷物經適度發芽后所含的淀粉酶、蛋白酶、苯丙氨酸解氨酶等被激活和釋放，大分子物質被水解成還原糖、氨基酸、黃酮和多酚等物質，提高了谷物的生物利用率和營養價值[9-12]。糙米經發芽后還原糖含量提高了4.93 倍，蛋白質含量提高了34.74%[13]。小麥經發芽處理后，總酚含量顯著提升[3]。加酶擠壓技術是一種集混合、加熱、酶解、殺菌和成型等為一體的新型加工技術，利用擠壓機體作為連續式酶反應器，在酶制劑的參與下，實現對物料的連續式加工過程；和傳統的預處理方式相比，省去了蒸煮、殺菌等工序，加酶擠壓過程物料中的淀粉、蛋白質、脂肪等大分子物質發生降解，并形成疏松多孔的結構，增加微生物作用面積的同時促進了阿魏酸等酚酸的溶出，更有利于后續釀造過程中被微生物轉化利用[14-17]。大麥經加酶擠壓技術處理后，其擠出物的糊化度和還原糖含量可達到96.78%和15.98%[18]。目前，國內外釀造行業利用發芽或加酶擠壓膨化技術對小麥原料進行單一預處理的研究已有報道，然而，利用高溫α-淀粉酶擠壓膨化處理發芽小麥提高其原料中還原糖和阿魏酸含量鮮有報道。

本研究將小麥在適宜條件下發芽，然后對發芽小麥進行高溫α-淀粉酶擠壓膨化處理，以還原糖和阿魏酸含量為指標，確定最佳工藝條件，然后通過冷場發射掃描電鏡（cold field emission scanning electron microscope，Cold FESEM）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、高效體積排阻色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）表征，初步探究發芽后續高溫α-淀粉酶擠壓膨化處理對發芽小麥中還原糖和阿魏酸含量的影響機制，強化和加速小麥淀粉的分解、提高還原糖和阿魏酸的含量，以期為小麥原料在釀造食品工業中的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥：河南楊家糧倉貿易有限公司；耐高溫α-淀粉酶（酶活力40 000 U/g，有效溫度范圍90～100 ℃）：北京索萊寶科技有限公司；次氯酸鈉、溴化鉀、二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑、溴甲酚綠、碘、碘化鉀、石油醚（沸程30～60 ℃）、硼酸、甲基紅、硫酸鉀、硫酸銅、無水碳酸鈉、濃硫酸、無水乙醇、三氯甲烷、鹽酸、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、亞甲基藍、無水葡萄糖、甲醇、硫酸鈉、氫氧化鈉、疊氮化鈉、硝酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PTW24/25D 雙螺桿擠壓機：美國熱電公司；AX124ZH/E 電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；FW80 高速萬能粉碎機：北京市永光明醫療儀器有限公司；YCHH0301 電動振篩機：宜昌市夷陵區華恒設備制造廠；THZ-82B 氣浴恒溫振蕩器：常州翔天實驗儀器廠；DK-8-D 電熱恒溫水槽、HWS-150 恒溫恒濕培養箱、DHG-9203A 電熱鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；T6 新世紀紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；L580 低速離心機：上海盧相儀離心機儀器有限公司；SH220F 石墨消解儀、K1100 全自動凱氏定氮儀：山東海能科學儀器有限公司；冷場發射掃描電子顯微鏡SU8100：日本株式會社日立高新技術；Nicolet 6700 全反射傅里葉紅外光譜儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；1525EF 高效液相色譜儀：美國沃特世公司。

1.3 試驗方法

工藝流程：小麥預處理→發芽（25 ℃、60 h）→烘干（60 ℃、12 h）→粉碎/過篩（60 目）→加酶/水分調節→密封靜置（4 ℃）→擠壓膨化→烘干（65 ℃、12 h）→粉碎/過篩（60 目）→密封冷藏。

1.3.1 發芽小麥的制備

以還原糖和阿魏酸為指標優化小麥的最佳發芽條件[19]。挑選籽粒飽滿、大小均勻、無破損、無蟲蝕的成熟小麥籽粒，去除雜質后用清水清洗3 遍去除表面浮塵，用質量濃度為0.50% 的次氯酸鈉溶液浸泡5 min后清水洗滌3 次去除表面殘留。加入小麥干重5 倍的蒸餾水浸泡（30 ℃、8 h），將浸泡好的小麥籽粒均勻地鋪在托盤內的4 層紗布上，在小麥籽粒上方再覆蓋2 層紗布用來遮光保濕。放入恒溫恒濕培養箱中進行發芽（25 ℃、60 h），將發芽后的小麥立即置于電熱鼓風干燥箱中60 ℃干燥12 h 至恒重，烘干后的小麥樣品粉碎過60 目篩，收集后置于密封袋中室溫保存備用。

1.3.2 加酶擠壓膨化工藝操作要點

參考文獻[18]方法，略作修改。稱取一定量耐高溫α-淀粉酶與35 ℃蒸餾水配制成懸濁液后與發芽小麥粉混合均勻，于4 ℃靜置過夜使得水分平衡。在不同條件下使用雙螺桿擠壓膨化機進行擠壓膨化，收集擠出物放置于電熱鼓風干燥箱中65 ℃干燥12 h 至恒重，烘干后的擠出物粉碎過60 目篩，密封備用。

1.3.3 指標測定

水分采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中直接干燥法測定；粗蛋白采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定；粗脂肪采用GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》中酸水解法測定；總淀粉采用GB 5009.9—2016《食品安全國家標準食品中淀粉的測定》中酶水解法測定；還原糖、阿魏酸含量參考文獻[20-21]方法測定。

1.3.4 發芽及加酶擠壓小麥粉的微觀結構分析

將待測樣品粉末均勻黏貼在樣品臺的導電膠上，用吸耳球吹掉多余及松動的樣品粉末。將樣品粉末表面鍍導電金膜后置于冷場發射掃描電子顯微鏡（3 kV）內分別于100 倍、500 倍、1 000 倍觀察樣品微觀結構形態。

1.3.5 發芽及加酶擠壓小麥粉的傅里葉轉換紅外光譜分析

參照文獻[18]方法。將待測樣品和KBr 進行干燥處理后，按質量比1∶50 充分研磨混勻后壓成透明薄片，使用傅里葉紅外光譜儀進行掃描，掃描范圍：4 000～450 cm-1，累計掃描次數為32 次，扣除以空氣為空白背景圖譜。使用Omnic 8.2 軟件對圖譜進行分析處理。

1.3.6 發芽及加酶擠壓小麥淀粉的分子量分布分析

用堿法[22]提取出各樣品中的淀粉，將各淀粉樣品用0.10 mol/L 硝酸鈉溶液配制成10 mg/mL 的淀粉溶液于沸水浴中攪拌2 h，過0.45 μm 的水系濾膜后使用高效液相色譜儀進行測定，色譜條件為：流動相為含有0.02% 疊氮化鈉的0.10 mol/L 硝酸鈉溶液，流速為0.80 mL/min，柱溫為60 ℃。

1.3.7 發芽小麥高溫α-淀粉酶擠壓膨化預處理單因素試驗設計

固定Ⅰ區、Ⅱ區、Ⅲ區機筒溫度分別為50、60、70 ℃，僅對末端機筒溫度進行篩選。

1.3.7.1 物料水分對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響

以發芽小麥粉為原料，物料水分分別為24%、26%、28%、30%、32%，固定末端機筒溫度為90 ℃，加酶量為0.14%，螺桿轉速為100 r/min，研究物料水分對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響。

1.3.7.2 加酶量對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響

以發芽小麥粉為原料，加酶量分別為0.02%、0.06%、0.10%、0.14%、0.18%，固定末端機筒溫度為90 ℃，物料水分為30%，螺桿轉速為100 r/min，研究加酶量對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響。

1.3.7.3 末端機筒溫度對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響

以發芽小麥粉為原料，末端機筒溫度分別為80、90、100、110、120 ℃，固定物料水分為30%，加酶量為0.14%，螺桿轉速為100 r/min，研究末端機筒溫度對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響。

1.3.7.4 螺桿轉速對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響

以發芽小麥粉為原料，螺桿轉速分別為80、100、120、140、160 r/min，固定末端機筒溫度為90 ℃，物料水分為30%，加酶量為0.14%，研究螺桿轉速對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響。

1.3.8 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇物料水分、加酶量、末端機筒溫度、螺桿轉速4 個因素開展正交試驗，試驗因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.4 數據分析

每組測定指標設置3 個平行，取平均值。利用Origin 2019b、SPSS 26 統計軟件進行數據、圖形處理分析。

2 結果與討論

2.1 發芽小麥高溫α-淀粉酶擠壓膨化預處理單因素試驗結果

2.1.1 物料水分對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響

物料水分對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響見圖1。

圖1 物料水分對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響Fig.1 Effect of material moisture on reducing sugar and ferulic acid in germinated wheat extrudate

由圖1 可知，物料水分過高或過低都會影響擠出物中還原糖和阿魏酸含量。物料水分為30%時，擠出物的還原糖含量、阿魏酸含量均最高，分別為38.09%和3.83 mg/g。物料水分含量過低時，淀粉在機體中受到高溫、高壓、高剪切的作用容易出現美拉德反應和焦糖化反應，導致還原糖和阿魏酸損失。隨著物料水分含量不斷增加，擠壓機內摩擦力逐漸減小，導致機筒導熱性增加使淀粉酶失活；阿魏酸在高溫、高壓、高剪切擠壓條件下會發生水解、聚合導致其損失[23-24]。因此選擇物料水分28%、30%、32%進行后續試驗。

2.1.2 加酶量對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響

加酶量對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響見圖2。

圖2 加酶量對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on reducing sugar and ferulic acid in germinated wheat extrudate

由圖2 可知，隨著耐高溫α-淀粉酶加酶量的增加，擠出物中還原糖和阿魏酸含量呈現先上升后下降的趨勢。當加酶量為0.10%時，阿魏酸含量達到最高值3.83 mg/g；當加酶量為0.14%時，還原糖含量最高，為38.12%。加酶量在0.02%～0.10%時，還原糖和阿魏酸含量均呈現上升趨勢，可能是由于在一定底物濃度時，淀粉水解度會隨著耐高溫α-淀粉酶增加而增大；同時，耐高溫α-淀粉酶的增加間接保護了溶出的阿魏酸不被降解[25]。耐高溫α-淀粉酶的過量添加不會提高酶解效果，這與曾子聰[26]在糙米擠壓過程中觀察到的規律相似。因此選擇加酶量0.10%、0.14%、0.18% 進行后續試驗。

2.1.3 末端機筒溫度對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響

末端機筒溫度對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響見圖3。

圖3 末端機筒溫度對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響Fig.3 Effect of barrel end temperature on reducing sugar and ferulic acid in germinated wheat extrudate

由圖3 可知，末端機筒溫度在80～90 ℃內，擠出物中還原糖和阿魏酸含量呈現上升趨勢，當溫度到達90 ℃時，還原糖含量達到最高值38.43%，此時阿魏酸含量為3.82 mg/g。隨著末端機筒溫度的持續升高，擠出物中還原糖和阿魏酸含量呈現下降趨勢，出現這種現象的原因可能是溫度較低時，耐高溫α-淀粉酶酶活較低不能很好的作用于發芽小麥粉，發芽小麥粉組織結構不能完全破壞導致其淀粉水解度和阿魏酸的溶出率較低[27]。相反，溫度過高時，耐高溫α-淀粉酶容易失活、發芽小麥粉發生美拉德反應甚至焦糊現象，導致還原糖和阿魏酸的損失[23-24，27-28]。因此選擇末端機筒溫度80、90、100 ℃進行后續試驗。

2.1.4 螺桿轉速對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響

螺桿轉速對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響見圖4。

圖4 螺桿轉速對發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量的影響Fig.4 Effect of screw speed on reducing sugar and ferulic acid in germinated wheat extrudate

由圖4 可知，螺桿轉速對還原糖和阿魏酸含量的影響較為明顯。螺桿轉速過低時，機筒內物料停留時間過長，導致物料出現焦糊等現象使得還原糖和阿魏酸含量降低。當螺桿轉速達到100 r/min，還原糖和阿魏酸含量均達到最大值，分別為38.23%和3.82 mg/g。隨著螺桿轉速的不斷提高，縮短了機筒內物料與耐高溫α-淀粉酶的作用時間，但增強了物料與酶的混合，使阿魏酸得以保留。這與Chiu 等[29]和Sharma 等[30]在玉米山藥混合物及大麥在擠壓過程中觀察到的規律相似。

2.2 發芽小麥高溫α-淀粉酶擠壓膨化預處理工藝正交試驗結果

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Orthogonal experiment results

表2 表明，以還原糖含量為評價指標，根據Ra可得出影響發芽小麥粉擠出物中還原糖含量的因素主次順序為C＞A＞B＞D，即末端機筒溫度＞物料水分＞加酶量＞螺桿轉速，最優組合為A2B3C2D1。以阿魏酸含量為評價指標，根據Rb可得出影響發芽小麥粉擠出物中阿魏酸含量的主次因素順序為C＞A＞D＞B，即末端機筒溫度＞物料水分＞螺桿轉速＞加酶量，最優組合為A2B3C2D1。

結合以上兩種評價指標結果，綜合分析得到最優組合為正交試驗第5 組，且末端機筒溫度是發芽小麥粉擠出物的主要因素。因此，最終確定發芽小麥粉加酶擠壓最佳工藝參數為物料水分30%、耐高溫α-淀粉酶加酶量0.18%、末端機筒溫度90 ℃、螺桿轉速80 r/min，在此條件下進行驗證試驗，得到的發芽小麥粉擠出物中還原糖和阿魏酸含量分別為38.39%和3.78 mg/g。

2.3 發芽及加酶擠壓對小麥粉基本成分的影響

小麥粉、發芽小麥粉及加酶擠壓發芽小麥粉的基本成分對比見表3。

表3 小麥粉、發芽小麥粉及加酶擠壓發芽小麥粉的基本成分對比Table 3 Proximate composition of wheat meal，germinated wheat meal，and high temperature α-amylase-extrusion puffing-treated germinated wheat meal

由表3 可知，小麥經過發芽處理后，粗蛋白含量、總淀粉含量、粗脂肪含量均呈現下降趨勢，發芽后的小麥，粗蛋白、總淀粉、粗脂肪含量分別下降到14.32%、32.69%、1.14%，還原糖、阿魏酸含量分別增加到31.74%、2.72 mg/g，這主要歸因于小麥發芽過程中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等活力的增加導致的相應水解反應[31]。

發芽小麥粉經過加酶擠壓膨化后，粗蛋白含量、總淀粉含量、粗脂肪含量均呈現下降趨勢，加酶擠壓膨化后的發芽小麥粉，粗蛋白、總淀粉、粗脂肪含量分別下降到13.56%、27.54%、0.86%。這可能是由于在加酶擠壓過程中淀粉分子降解成糊精及小分子糖類，蛋白質受熱變性使氨基酸殘基暴露，導致蛋白質、淀粉、脂肪之間發生復合反應[32]。在加酶擠壓膨化過程中，耐高溫α-淀粉酶作用于發芽小麥淀粉產生大量還原糖，在耐高溫α-淀粉酶間接保護下阿魏酸不被降解，同時擠壓膨化破壞了發芽小麥的組織結構增加了阿魏酸的溶出率[23]，發芽小麥粉經加酶加壓膨化后，還原糖、阿魏酸含量分別增加到38.39%、3.78 mg/g。

2.4 發芽及加酶擠壓對小麥粉微觀結構的影響

小麥粉、發芽小麥粉及加酶擠壓發芽小麥粉微觀結構見圖5。

圖5 小麥粉、發芽小麥粉及加酶擠壓發芽小麥粉微觀結構Fig.5 Microstructures of wheat meal，germinated wheat meal，and high temperature α-amylase-extrusion puffing-treated germinated wheat meal

小麥粉淀粉顆粒較大且表面光滑呈橢圓狀（圖5 A1～圖5A3），經過發芽處理后，部分淀粉顆粒呈現破碎狀，說明發芽處理有利于小麥淀粉顆粒的部分水解（圖5B1～圖5B3），發芽過程中蛋白酶、淀粉酶、苯丙酰胺酶等被激活和釋放促使相應大分子物質發生水解并使得還原糖、多酚等小分子物質得以增加。加酶擠壓膨化處理后淀粉顆粒幾乎全部發生水解，橢圓狀淀粉形態遭到破壞導致了原有淀粉顆粒的破碎并聚集形成不規則結構（圖5C2），經過進一步放大，可以觀察到經過加酶擠壓處理后的發芽小麥粉中淀粉顆粒被水解呈現疏松多孔結構（圖5C3），這可能是由于加酶擠壓膨化過程中耐高溫α-淀粉酶作用于發芽小麥淀粉使其完全水解成了小分子糖類，同時由于高溫、高壓、高剪切的擠壓作用也使得發芽小麥組織結構遭到破壞極大的促進了阿魏酸的溶出。

2.5 發芽及加酶擠壓對小麥粉官能團和結晶結構的影響

小麥粉、發芽小麥粉及加酶擠壓發芽小麥粉紅外光譜見圖6，小麥粉、發芽小麥粉及加酶擠壓發芽小麥粉吸光度比值對比見圖7。

圖6 小麥粉、發芽小麥粉及加酶擠壓發芽小麥粉紅外光譜Fig.6 Infrared spectra of wheat meal，germinated wheat meal，and high temperature α-amylase-extrusion puffing-treated germinated wheat meal

圖7 小麥粉、發芽小麥粉及加酶擠壓發芽小麥粉吸光度比值對比Fig.7 Absorbance ratios of wheat meal，germinated wheat meal，and high temperature α-amylase-extrusion puffing-treated germinated wheat meal

2.6 發芽及加酶擠壓對小麥淀粉分子量分布的影響

小麥粉、發芽小麥粉及加酶擠壓發芽小麥粉的分子量分布見圖8。

圖8 小麥粉、發芽小麥粉及加酶擠壓發芽小麥粉的分子量分布Fig.8 Molecular weight distribution of wheat meal，germinated wheat meal，and high temperature α-amylase-extrusion puffingtreated germinated wheat meal

根據凝膠排阻色譜原理，出峰時間越早表示該物質的分子量越大，峰面積越大則說明該分子量占比越高。由圖8 可知，3 種樣品中小麥粉的出峰時間最早，重均分子量最大的淀粉分子Mw=2.84×106Da 所占比例為11.22%，重均分子量較大的淀粉分子Mw=2.51×105Da 所占的比例最高為88.78%，這可能是由于小麥淀粉中支鏈淀粉難溶于0.10 mol/L 硝酸鈉溶液所導致分子量分布中支鏈淀粉占比較小。發芽小麥中淀粉分別在13.47、15.25、19.43 min 3 個時間點處有波峰，Mw分別為2.90×106、1.86×105、767 Da，說明小麥在發芽過程中支鏈、直鏈淀粉被部分分解成小分子的還原糖等物質導致其分子量降低。加酶擠壓小麥粉的保留時間為19.73 min，Mw＝662 Da 所占比例為100%，說明耐高溫α-淀粉酶對發芽小麥中淀粉等大分子物質進一步水解并使其完全水解成還原糖、可溶性糊精等小分子物質[18]，同時，由于有α-淀粉酶的存在，擠壓過程中被釋放的阿魏酸也得到了一定的保護[27]。

3 結論

以發芽小麥為原料，優化高溫α-淀粉酶擠壓膨化技術對發芽小麥進行預處理，通過單因素試驗篩選出物料水分、加酶量、末端機筒溫度、螺桿轉速的適宜水平，然后以擠出物中的還原糖和阿魏酸含量為指標進行正交試驗，確定最佳工藝條件為物料水分30%、加酶量0.18%、末端機筒溫度90 ℃、螺桿轉速80 r/min，在此條件下，擠出物中的還原糖和阿魏酸含量分別為38.39% 和3.78 mg/g，與小麥原料和單一萌發處理相比，還原糖含量分別提高481.67% 和20.95%，阿魏酸含量分別提高131.90% 和38.97%。發芽小麥的淀粉結構被破壞，結晶度、短程有序度、重均分子量降低，淀粉的水解度得到顯著提高。高溫α-淀粉酶擠壓膨化處理發芽小麥是一種較好的預處理方式，高溫α-淀粉酶擠壓膨化處理發芽小麥能夠促進還原糖的生成和阿魏酸的釋放，為后續發酵食品的生產提供更好的發酵條件和更多的風味前體物質。