微生物阿魏酸酯酶及其在食品中的應用研究進展

陳舒薇，王丹蕓，婁婷婷，吳子健，張宏宇*，王素英，李炳娟，張得光，楊金山

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；3.天津海關動植物與食品檢測中心，天津 300461）

阿魏酸（ferulic acid，FA）又稱4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，具有較好的抗氧化性，能夠清除自由基[1]。在乳制品中，FA 可與酪蛋白交聯提高牛奶的穩定性。FA也可與細胞壁多糖交聯提高生物利用率調節免疫反應。FA 常以單體或二聚體形式存在于共生科單子葉科（如小麥、水稻、大麥、燕麥、玉米、高粱和甘蔗）的植物細胞壁多糖網絡和甜菜粕、谷殼、米糠等食品加工材料中，可以使植物細胞壁多糖彼此交聯并與木質素交聯，從而限制多糖水解酶對這些底物的水解[2]。

阿魏酸酯酶（feruloyl esterases，FAEs）是羧酸酯酶的一個亞類，可通過水解羥基肉桂酸和阿拉伯木聚糖之間的酯鍵，釋放游離的羥基肉桂酸如FA，同時可充當輔助酶，協助其他酶在生物質轉化中進入其作用位點。FAEs 大多來源于真菌[3-5]、細菌[6-7]以及放線菌[8]等微生物，少數來源于植物。FAEs 的水解或酯交換產物具有降血脂、抗血栓、抗菌消炎、疏散血小板、清除自由基、提高免疫力、預防阿爾茲海默癥等功效[9]，可作為添加劑和抗氧化劑等用于酒類、面包、茶葉的生產[1]。

自1987年被發現以來[10]，關于FAEs 的新酶挖掘、性質鑒定、構效關系解析以及分子改造等方面的研究不斷被報道。基于此，本文總結近年來FAEs 的來源、結構、分類、催化機理和分子改造等方面的研究進展，并重點討論FAEs 在食品領域的應用現狀及前景，以期為FAEs 的進一步挖掘和應用提供參考。

1 阿魏酸酯酶概述

1.1 阿魏酸酯酶的來源

1987年，Mackenzie 等[10]首次在橄欖色鏈霉菌（Streptomycesolitrochromogenes）中發現了FAEs，1991年Faulds 等[11]將其分離純化。研究發現，原核生物（細菌）和真核生物（真菌和植物）中均含有FAEs，其中真菌來源的FAEs 占據主要地位，植物FAEs 的相關報道較少，僅有的研究報道均以來源于大麥芽的FAEs 為研究對象。目前已得到功能驗證及表征的FAEs 見表1。

表1 近5年不同來源的FAEs 及其底物譜Table 1 Feruloyl esterases from different sources and their substrate spectra identified in recent five years

目前已發現的FAEs 來源真菌主要包括黑曲霉（Aspergillusniger）[3]、黃曲霉（Aspergillusflavus）、土曲霉（Aspergillusterreus）[4]、裂褶菌（Schizophyllumcommune）、紫孢側耳菌（Pleurotussapidus）、太瑞斯梭孢殼霉（Thielaviaterrestris）[5]、米麴菌（Aspergillusoryzae）、嗜熱毛殼菌（Chaetomiumthermophilum）[25]、纖維素分解菌（Talaromycescellulolyticus）[4]、尖刀鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、嗜熱鐮孢菌（Scytalidiumthermophilum）[27]、宇佐美曲霉（Aspergillususamii）[29]、立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）、絲狀真菌柄孢霉（Podosporaanserina）[24]、微細正青霉（Eupenicilliumparvum）[19]、嗜熱毀絲霉（Myceliophthorathermophila）[20]、產紫青霉（Penicilliumpurpurogenum）[3]、韋臘鏈霉菌（Streptomyceswerraensis）以及產黃青霉（Penicilliumchrysogenum）[21]等。FAEs 的來源細菌主要包括普雷沃氏菌（Prevotellasp.）[6]、大腸桿菌（Escherichiacoli）、嗜熱纖維梭菌（Clostridiumthermocellum）、梭狀芽孢桿菌（Clostridiumsp.）、卷曲乳桿菌（Lactobacilluscrispatus）[7]、吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderiapyrrocinia）[22]、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）[15]、淀粉乳桿菌（Lactobacillusamylovorus）[26]、嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）[30]、約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）[6]、法氏乳桿菌（Lactobacillusfarciminis）、短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）[23]、熱葡萄糖苷地芽孢桿菌（Geobacillusthermoglucosidasius）[17]、纖維堆囊菌（Sorangiumcellulosum）和腸擬桿菌（Bacteroidesintestinalis）等。FAEs 的來源放線菌主要包括橄欖色鏈霉菌（Streptomycesolivaceus）和肉桂鏈霉菌（Streptomycescinnamoneus）[8]等。基于宏基因組分析的FAEs 的來源微生物包括瘤胃微生物[6]、白蟻腸道微生物、堆肥微生物、土壤微生物[28]和馬糞便微生物。

1.2 阿魏酸酯酶的分類

FAEs 可水解多種底物，如MFA、MCA、ChA/CGA、RA等，FAEs 環內氨基酸殘基、催化位點附近的結構以及底物結合位點的差異使FAEs 具有不同的底物譜。最早的FAEs 分為A 型和B 型，該方法主要依據FAEs 酯化釋放阿魏酸二聚體進行分類。后來，FAEs 被分為A、B、C、D 4 類，該分類方法依據FAEs 對4 種模式底物的水解特性及釋放二阿魏酸的能力（見表2 和圖1）。但該分類方法不包括部分細菌來源的FAEs，這部分FAEs 被歸類為E 類。

圖1 羥基肉桂酸、羥基肉桂酸酯及阿魏酸二聚體結構Fig.1 Structures of hydroxycinnamic acid，hydroxycinnamic acid ester，and ferulic acid dimer

表2 FAEs 的分類Table 2 Classification of feruloyl esterases

2 阿魏酸酯酶的結構及其催化機制

2.1 阿魏酸酯酶的三維結構

FAEs 為高度分化的酯酶，在結構上有明顯差異。目前，包括來源于嗜熱纖維梭菌[31]、黑曲霉[32]、米麴菌、肉桂鏈霉菌、植物乳桿菌、尖刀鐮孢菌[33]、熱葡萄糖苷地芽孢桿菌[34]以及腸擬桿菌[35]等的FAEs 已經獲得晶體結構。不同來源的FAEs 屬于不同家族，但大多遵循Ser-His-Asp 三聯體的催化機制并以絲氨酸（Ser）為親核中心。圖2 列舉了3 種不同來源的FAEs 晶體結構。

圖2 不同來源的FAEs 晶體結構Fig.2 Crystal structures of different feruloyl esterases

2001年，來源于嗜熱纖維梭菌的FAEs 晶體結構首次被解析，其催化三聯體為Ser954-Asp1018-His1058，屬于α/β 水解酶[36]。2004年Hermoso 等[37]解析了AnFaeA 的晶體結構，其來源于黑曲霉，催化三聯體為Ser133-Asp194-His247，活性位點由蓋子結構（殘基68-80）和環（殘基226-244）組成。2018年Misugi等[8]解析了肉桂鏈霉菌來源的FAEs 結構，其三聯體為Ser191-Asp214-His268，loop 環（Lys142-Asp152）組成疏水口袋。2011年，Udatha 等[38]報道了324 個FAEs 序列的Ser-Asp-His 催化三聯體。有報道顯示，在紫孢側耳菌中發現了罕見的Ser-His-Glu 催化三聯體水解機制，該三聯體由親核絲氨酸、絕對保守的組氨酸和酸性殘基（天冬氨酸或谷氨酸）組成，天冬氨酸和谷氨酸都可以作為水解催化三聯體中的質子受體，這種機制在FAEs 中很罕見，多見于α/β 水解酶超家族。

目前，較多關于黑曲霉來源的FAEs 文獻被報道。Hermoso 等[37]已解析來源于黑曲霉的AnFaeA（PDB：1USW）。來源于黑曲霉的FAEs 催化位點構象見圖3。

圖3 來源于黑曲霉的FAEs 催化位點構象Fig.3 Conformation of catalytic site of feruloyl esterases from Aspergillus niger

AnFaeA 的構象采用α/β 水解酶折疊構象，由一組主要的9 鏈混合β 折疊、兩組次要的2 鏈β 折疊和7 個α 螺旋組成。AnFaeA 存在3 個二硫鍵，其中Cys29-Cys258 形成了一個包埋Trp 殘基的疏水口袋。AnFaeA 的催化三聯體為Ser133-Asp194-His247，Ser殘基具有構成親核的共有序列GXSXG。AnFaeA 有類似于脂肪酶蓋子結構（Lid）的α-螺旋結構（68～80 位殘基），但相較脂肪酶蓋子結構，AnFaeA 具有更高比例的極性氨基酸殘基和α-螺旋結構糖基化修飾（N79 YTL）。這使AnFaeA 不具有脂肪酶相應結構的“開-關”活性中心的功能，也不具備“界面激活”的催化特性。

2.2 阿魏酸酯酶的催化機理

FAEs 常使用阿魏酰寡糖（如阿魏酸-Ara-Xyl1-3、阿魏酸-Ara 1-3、對香豆酰Ara-Xyl1-3）、羥基肉桂酸模型底物（甲基、乙基、對硝基苯基、α-萘基阿魏酸）、短鏈脂肪酸模型底物（如α-乙酸萘酯、乙酸傘形花酯和丁酸傘形花酯）作為活性測定底物。但該模型只顯示該酶是否具有活性，而不顯示它們是否對FA 或羥基肉桂酸具有特異性。自然界中FAEs 可以以麥麩、玉米秸稈等植物生物質為底物，水解羥基肉桂酸和木聚糖相連的酯鍵釋放羥基肉桂酸，也可以水解生成酚類化合物。在麥麩、玉米秸稈等農業生產廢棄物中，酯鍵將羥基肉桂酸和阿魏酸二聚體與木聚糖相連，具體見圖4。

圖4 羥基肉桂酸和阿魏酸二聚體連接阿拉伯木聚糖酯Fig.4 Linkage of hydroxycinnamic acid and diferulic acid with arabinoxylan ester

FAEs 催化機制與絲氨酸蛋白酶家族一致，常使用絲氨酸親核攻擊反應。催化過程分為酰化和脫酰兩個步驟，脫酰步驟決定了催化效率。FAEs 的催化機理見圖5。

圖5 FAEs 的催化機理Fig.5 Catalytic mechanism of feruloyl esterases

酰化過程起始于絲氨酸中的羥基氧親核攻擊底物酯鍵中的羰基碳，隨后絲氨酸的質子轉移到組氨酸咪唑基團。羰基氧（氧陰離子）與兩個NH 基團（氧陰離子洞）通過靜電作用維持穩態；質子化的組氨酸與天冬氨酸形成氫鍵。此時底物酯與三元催化體構成過渡態四面體。隨后，質子化的組氨酸將質子傳遞給底物酯中的氧，此時四面體穩態破壞，形成酰基-酶中間體，進入脫酰過程。脫酰過程：形成中間體后弱親核試劑（水、低聚寡糖、醇類物質）攻擊酰基-酶中間體中的羰基碳，隨后組氨酸奪取弱親核試劑中的質子，形成新的過渡態四面體。之后質子被質子化的組氨酸轉移到絲氨酸的羥基氧中，新的四面體解體釋放底物。

3 阿魏酸酯酶的工程化改造及高通量篩選

天然來源的FAEs 熱穩定性差、催化活力弱，因此FAEs 的分子改造獲得了廣泛的研究。目前，FAEs 的改造策略主要包括定向進化、半理性設計以及理性設計。部分FAEs 分子改造的代表性成果見表3。

表3 部分FAEs 分子改造的代表性成果Table 3 Representative results of molecular modification of feruloyl esterases

3.1 阿魏酸酯酶的定向進化

定向進化方法主要分為基于非重組的體外隨機進化、基于重組的體外隨機進化和基于重組的體內隨機進化。基于非重組的體外隨機進化如易錯PCR（errorprone PCR，epPCR）、基于重組的體外隨機進化如DNA改組（DNA shuffling）[47]、基于重組的體內隨機進化如多元基因組工程（multiplex automated genome engineering，MAGE）、多元質粒工程（multiplex iterative plasmid engineering，MIPE）等，以上策略均已廣泛應用。ep-PCR 也稱隨機突變，指在擴增目的基因的同時引入堿基錯配，控制DNA 突變頻率是關鍵。epPCR 理想堿基置換率依賴于隨機突變的DNA 片段長度，DNA 突變頻率一般為每1 000 個堿基0.25～20 個置換。Varriale等[44]通過epPCR 技術進行定向進化試驗以獲得比野生酶活性更高的變體。最佳變體L432I 粗上清液可水解除MSA 外的所有受試底物，其對MpCA、MFA 和MCA 的水解活性高于野生型FoFaeC。

DNA 改組技術又稱有性PCR，通過組合親本基因群中的突變以獲取最佳突變組合的酶。DNA 改組不僅可加速積累有益突變，而且可使酶的兩個或更多的已優化性質合為一體。Li 等[41]采用DNA 改組技術，從由4 種同源親本FAEs 構建的DNA 改組文庫中篩選出熱穩定性增強的嵌合體FAEs，加入2～4 個有益突變后，與親本酶相比嵌合體65 ℃下的半衰期增加了22 倍，FA 的釋放量增加了12.8 倍。

3.2 阿魏酸酯酶的半理性設計

半理性設計采用非隨機方式更有針對性地改造蛋白質、提高篩選效率，包括蛋白質序列比對、晶體結構分析等。半理性設計的關鍵是通過計算機模擬獲得潛在的有益突變位點，再利用適當的飽和突變技術構建突變文庫。飽和突變技術包括基因位點飽和誘變技術（gene site saturation mutagenesis，GSSM）、組合活性中心飽和突變技術（combinatorial active site saturation test，CAST）、迭代飽和突變技術（iterative saturation mutagenesis，ISM）等。Yin 等[48]通過ISM 技術，根據BFITTER 軟件分析的B 因子值和PoPMuSiC 算法預測的ΔG 值，對Ser33 和Asn92 兩種氨基酸進行飽和突變。通過序列篩選法初步篩選出15 個變異株，最佳變異株S33E/N92R 在50 ℃下的半衰期為野生型FAEs的3.6 倍。可見ISM 技術顯著提升了FAEs 的熱穩定性，有望在工業應用中促進植物生物質材料在高溫下的酶降解。

3.3 阿魏酸酯酶的理性設計

理性設計是指通過計算機建模預測蛋白質活性位點以及突變對目標蛋白穩定性、折疊以及與底物結合的影響。理性設計通過蛋白質設計指導和模擬篩選試驗，提高試驗的成功率，方法主要有同源比對、蛋白質表面電荷優化、設計二硫鍵等。Yin 等[29]使用MODIP和DbD 計算工具，預測二硫鍵，同時使用MD 模擬設計額外的二硫鍵，探究二硫鍵對來源于宇佐美曲霉的FAEs 熱穩定性的影響。研究表明，引入二硫鍵后變異體在55 ℃下的半衰期為188 min，與野生型相比提高了12.5 倍。消除天然二硫鍵后蛋白的熱穩定性至少降低10 ℃。結果證實，二硫鍵對FAEs 的熱穩定性有顯著貢獻。Antonopoulou 等[45]采用小分子對接模擬技術對來源于尖刀鐮孢菌的FAEs 進行理性設計。結果表明，突變體對于4 種模型底物的親和力提高，但對含有羥基取代底物的催化效率和轉化率降低。

生物合成技術如定向進化、半理性設計、理性設計等可增加FAEs 的多樣性，但如何從大量的突變體中篩選有益突變仍是亟需解決的問題。其篩選方法主要分為功能篩選和序列篩選。功能篩選包括表型檢測法、異源互補法、誘導基因表達法，根據宿主菌外在表征（水解圈、抑菌圈、顏色反應）篩選陽性克隆子。該方法要求目的蛋白和底物的反應易于鑒定，編碼基因在外源宿主細胞中充分表達。其中表型檢測法是使用最多的方法，可通過設計顯色底物、熒光探針[49]高通量篩選FAEs。目前，有研究用單體羥基肉桂酸酯模型底物檢測發色團（如對硝基苯基、α-萘基阿魏酸酯）的釋放或底物（如甲基、阿魏酸乙酯）的還原，也有研究以熒光物質為底物（如CNPF[41]、4NTC-Fe[44]）使用顯色法進行篩選，此類方法可能會造成底物和產物之間的光譜重疊，但快速且易于執行。反相高效液相色譜法是檢測FA 和羥基肉桂酸從阿魏酰化多糖和寡糖中釋放的最常用技術。但它非常耗時，并且通常需要在分析之前先進行分離或提取步驟，因此也有研究使用高效薄層色譜法和電化學傳感器法進行酶促篩選。序列篩選包括PCR 法、生物信息學法，可依據序列的相似性，以相關功能基因的保守序列為基礎設計PCR 引物，然后通過PCR 擴增篩選期望的目標克隆。該方法不依賴外源基因在宿主細胞中的表達，但較難發現新型基因。

4 阿魏酸酯酶在食品領域中的應用

4.1 阿魏酸酯酶在面團發酵中的應用

小麥粉是許多烘焙產品的主要成分，阿拉伯木聚糖是面團改良的主要目標，由水溶性阿拉伯木聚糖（water-extractable arabinoxylan，WEAX）和不溶性阿拉伯木聚糖（water-unextractable arabinoxylan，WUAX）組成。FAEs 可作為輔助酶與木聚糖酶、纖維素酶協同作用增加阿拉伯木聚糖含量和面團體積[50]。Schulz等[12]將FAEs 與具有木聚糖酶活性的α-淀粉酶和半纖維素酶聯合使用進行烘焙，結果表明在面團制備過程中添加低活性FAEs 后，面包體積增加，reSwFAED 和多糖降解酶處理后面包體積增加的原因可能是WUAX 轉化為WEAX。與WEAX 相比，WUAX 對烘焙產品有負面影響，因為它們吸附水分并阻礙面筋網絡的形成。

4.2 阿魏酸酯酶在酒類釀造中的應用

衡量啤酒質量的標準有香氣、麥汁過濾速度、風味穩定性等。FAEs 可與木聚糖酶協同應用，以促進大米和其他谷物釋放FA 等香氣成分，在發酵和老化過程中轉化為芳香族衍生物。Uno 等[51]對發酵清酒中FAEs 活性進行測定，發現FA 的濃度在接種后9～12 d達到最高。造成麥汁過濾速度較慢的原因主要是麥芽中的阿拉伯木聚糖發生氧化交聯反應，在大麥麥芽糖化階段添加FAEs 可提高麥芽的過濾性能。通過清除過氧自由基或提高酚酸含量可以增強啤酒風味穩定性，也可通過添加FA 清除啤酒中的羰自由基和過氧自由基，抑制羰基化合物形成，提高啤酒抗氧化力。Szwagjier[52]在麥芽糖化過程中添加FAEs，使麥汁中游離酚酸和FA 含量升高，大大提高了麥汁的抗氧化能力。

4.3 阿魏酸酯酶在膳食纖維補充劑中的應用

FAEs 或產FAEs 的乳酸菌可制作成酶制劑直接服用，提高人體對膳食的生物利用度。細菌細胞在消化道內易被降解，因此可用微膠囊包封技術保持FAEs活性。Tomaro-Duchesneau 等[53]和Bhathena 等[54]的研究均利用海藻酸鹽-聚賴氨酸-海藻酸鹽微膠囊包封FAEs 生產菌，結果證實，游離發酵乳桿菌和微膠囊化發酵乳桿菌活力差異顯著，證明了FAEs 在膳食纖維補充劑方面的工業潛力。

4.4 阿魏酸酯酶在茶葉中的應用

冠突散囊菌是黑毛茶、茯苓茶、黑茶等茶葉發酵過程中的優勢菌種，有降脂、抗腹瀉、降膽固醇、抑菌等保健功能。劉閆等[55]對冠突散囊菌的功效成分進行研究，認為FAEs 可破壞茶葉細胞壁的細胞骨架結構，產生游離FA。冠突散囊菌發酵黑毛茶后FA 產量與當歸、佛手散中FA 含量接近，證實了黑毛茶中冠突散囊菌在產FAEs 方面的潛力。陳錦[56]從茯苓茶中篩選出產FAEs 最優冠突散囊菌，對茯苓茶中冠突散囊菌產FA 含量及其抗氧化作用進行研究。冠突散囊菌產FA可達44.87 μg/g，其FA 含量與抗氧化能力呈正相關，能用于制備抗氧化性高的新型茶葉。雷林超[57]通過FAEs 與木聚糖酶的協同作用，促進黑茶中木質纖維的降解，以制備富含FA 的新型黑茶茶葉。發酵后FA 可達28.77 μg/g。

4.5 阿魏酸酯酶在低聚木糖制備中的應用

低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）具有降血脂、降血壓、抗血栓、抗癌等功效，也能改善腸道菌群、預防腹瀉，常作為甜味劑、穩定劑、乳化劑和益生元，廣泛應用在食品中，FAEs 可作為輔助酶高效生產XOS。ávila 等[58]將FAEs 與木聚糖內切酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶共同降解甘蔗秸稈和咖啡殼生產XOS，產量分別為10.23 g/L 和8.45 g/L。此外，木聚糖酶/FAEs 雙功能酶[59]也被發現，Wang 等[16]將來自細菌EMSD5 的木聚糖酶/FAEs 雙功能酶在大腸桿菌中異源表達，以小麥阿拉伯木聚糖、脫漿麥麩、超細磨玉米秸稈和蒸汽爆破玉米為底物，探究FA 和XOS 在不同底物中的釋放量，發現在蒸汽爆破玉米芯中FA 釋放量最高。

5 總結

FAEs 可水解羥基肉桂酸和阿拉伯木聚糖之間的酯鍵釋放羥基肉桂酸，也可作為輔助酶，高效生產XOS，有潛力成為植物生物質綜合利用的重要工具，有較高的商業應用前景。本綜述主要總結了FAEs 的來源、結構、分類、催化機理、分子改造及其食品應用方面的研究進展。在過去幾年中，FAEs 的工業應用范圍不斷擴大，其應用主要趨向于將農業工業廢料轉化為有價值的產品，以及合成新型酯連接的羥基肉桂酸產品如保健品等。但多數天然來源FAEs 熱穩定性和催化活性較差，較難應用于工業化生產。在未來研究中，基于以下3 個方面開展進一步的研究：1）通過理性設計、半理性設計以及定向進化等策略對FAEs 進行分子改造是提高其熱穩定性和催化活性的有效途徑；2）FAEs相關酶的晶體結構數據需要進一步豐富，從而增強氨基酸殘基突變位點的選擇基礎，這也是未來研究中亟待解決的重點問題；3）由于FAEs 的底物具有多樣性，如何從大量的突變體中高通量篩選有益突變仍是亟需解決的問題。