透明質酸栓塞對動脈壁結構以及動脈血中IL-1、VEGF和MMP9表達的影響

陳愛萍 吳偉東 王瑛 古佳升

[摘 要]目的 探討透明質酸栓塞后對動脈壁的影響，以及對白介素1（IL-1）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）和血管內皮生長因子（VEGF）的表達差異。方法 將9只白兔采用隨機數字表法分為對照組、HA組和結扎組，各3例。對照組注射生理鹽水，HA組注射透明質酸栓塞血管，結扎組使用外科縫線結扎動脈血管阻斷血管血流。術前、注射后1、3、5 d抽取各組兔耳中央動脈栓塞部位遠心端血液5 ml，實時熒光PCR法檢測其動脈血中IL-1、MMP9和VEGF表達水平，并進行組間比較。第5天終止實驗，處死所有白兔，取兔耳中央動脈血管壁經HE染色后在顯微鏡下觀察。結果 QPCR結果顯示：結扎組與HA組IL-1、MMP9和VEGF的表達水平均高于對照組（P<0.05）；結扎組IL-1、MMP9和VEGF表達水平均高于HA組（P<0.05）。HE染色結果顯示：對照組動脈壁結構完整；HA組有輕微內膜增生；結扎組內膜增生嚴重，平滑肌層紊亂。結論 透明質酸注射栓塞血管或動脈結扎血管均可引起動脈血IL-1、MMP9和VEGF表達水平升高，引起動脈壁重塑，但透明質酸注射引起的栓塞較結扎動脈對IL-1、MMP9和VEGF表達水平及動脈壁重塑的影響更小。

[關鍵詞] 透明質酸；動脈栓塞；基質金屬蛋白酶

[中圖分類號] R543 [文獻標識碼] A [文章編號] 1004-4949（2024）01-0036-05

Effects of Hyaluronic Acid Embolization on the Structure of Arterial Wall and the Expression of IL-1， VEGF and MMP9 in Arterial Blood

CHEN Ai-ping1， WU Wei-dong1， WANG Ying2， GU Jia-sheng1

（1.Department of Cardiothoracic Surgery， Guangzhou Red Cross Hospital Affiliated to Jinan University， Guangzhou 510000， Guangdong， China； 2.Guangzhou Xiaoman Waist Medical Equipment Co.， LTD.， Guangzhou 510000， Guangdong， China）

[Abstract]Objective To investigate the effect of hyaluronic acid embolization on arterial wall and the expression of interleukin 1 （IL-1）， matrix metalloproteinase 9 （MMP9） and vascular endothelial growth factor （VEGF）. Methods Nine white rabbits were randomly divided into control group， HA group and ligation group， with 3 rabbits in each group. The control group was injected with normal saline， the HA group was injected with hyaluronic acid to embolize the blood vessels， and the ligation group was ligated with surgical suture to block the blood flow of the blood vessels. 5 ml blood samples were collected before operation and 1， 3 and 5 days after injection， and the expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in arterial blood were detected by real-time PCR. All white rabbits were sacrificed on the 5th day， and the vascular wall of the central artery of the rabbit ear was stained with HE and observed under a microscope. Results The QPCR results showed that expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in ligation group and HA group were higher than those in control group （P<0.05）， and the expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in the ligation group were higher than those in the HA group （P<0.05）. HE staining results showed that the arterial wall structure of the control group was intact. There was slight intimal hyperplasia in HA group. The intimal hyperplasia was severe and the smooth muscle layer was disordered in the ligation group. Conclusion The expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in arterial blood can be increased by hyaluronic acid injection embolization or artery ligation， which can lead to arterial wall remodeling. However， the embolization caused by hyaluronic acid injection has less effect on the expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF and arterial wall remodeling than that of artery ligation.

[Key words] Hyaluronic acid； Arterial embolism； Matrix metalloproteinase

目前，透明質酸（hyaluronic acid，HA）已經廣泛用于皮膚美容，但注射不當會引起皮膚壞死、腫塊、脫發等多種不良反應，其中動脈栓塞是HA注射不良反應中最嚴重的并發癥[1]。由于頭頸面部的血管解剖結構復雜，注射過程中可能導致HA進入血管，引起血管栓塞，并造成組織缺氧、壞死等不良反應[2]。近年來，HA注射后血管栓塞引起組織缺氧壞死的機制有了一定的研究成果[3，4]，但在血管微觀下的影響尚未報道。白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）均能通過不同機制參與血管重構[5-7]。HA在體外實驗中發現能促進血管內皮細胞增殖、遷移，但HA引起栓塞后，在血管內是否會通過各種機制加重血管壁的損傷重塑，尚無研究。本實驗就通過構建HA引起的動脈栓塞模型，以物理結扎為對照，評價HA栓塞后短期內血管壁在微觀下的改變以及各種細胞分子的表達水平。

1.1 實驗動物 成年實驗雄性新西蘭兔9只，周齡6周，體重3～3.5 kg（購自廣東明珠生物科技有限公司）。動物實驗通過動物倫理審批（倫理審批號：C202307-10），按照《國立衛生研究院實驗動物護理與使用指南》進行飼養。兔在室溫（25±2）℃，相對濕度（50±5）%，12 h明暗交替的環境下分籠飼養，自由攝食飲水，飼養7 d。

1.2 主要試劑與儀器 臺式高速冷凍離心機[天美儀拓實驗室設備（上海）有限公司，型號：CT14RDⅡ]；實時熒光定量PCR儀[閎龍生物科技（上海）有限公司型號CFX96，品牌：BIORAD]；顯微鏡[成貫儀器（上海）有限公司，型號：尼康CI-S]；攤烤片機（湖北安立信醫療實業有限公司，型號：ATK-7）；脫水機（型號：JJ-12J）和包埋機（型號：JB-P5）均購自武漢俊杰電子有限公司；Trizol-RNA提取試劑（湖南艾科瑞生物工程有限公司，型號：AG21101）；注射用透明質酸鈉（華熙生物科技股份有限公司，批準文號：20143132037，規格：0.5 ml∶10 mg）；熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準字H44023401，規格：3 ml）；IL-1、MMP9、VEGF和GADPH引物均由廣州伯信生物科技有限公司提供。

1.3 實驗分組 9只白兔采用完全隨機抽樣法分為對照組，HA組和結扎組，各3例。對照組注射生理鹽水、HA組注射透明質酸，結扎組使用外科縫線結扎血管。

1.4 實驗方法

1.4.1構建兔耳中央動脈栓塞模型 固定白兔，去除兔耳被毛，采用7%水合氯醛經耳緣靜脈注射麻醉，注射量3.5～4.5 ml/kg體重。待白兔完全麻醉后，留置針刺入兔耳中央動脈，緩慢均勻注射透明質酸鈉1 ml，減少血管被動擴張及材料向近端動脈的反流。注射完畢后予以加壓包扎穿刺部位，確認動脈無漏血后，采用20%熒光素鈉，劑量為15 mg/kg，經耳后靜脈外側支或耳前靜脈注射熒光素鈉，并在紫外光下觀察，確認動脈栓塞成功。對照組操作同上，僅注射生理鹽水。結扎組使用縫線結扎兔耳中央動脈，保障血流成功阻礙，其余操作同上。分別于0 d（術前）及術后1、3、5 d進行大體拍照記錄。由于第5天觀察到HA組動脈栓塞的血管開始出現通暢，于是選擇終止了實驗，處死兔后從中央動脈取樣，進行后續HE染色實驗。

1.4.2 QPCR法檢測兔耳動脈血中IL-1、MMP9和VEGF的表達 分別在0 d（術前）及術后1、3、5 d抽取各組兔耳中央動脈栓塞部位遠心端血液5 ml，置入離心管，在室溫下以3000 r/min離心12 min，靜置后收集上層清液，使用Trizol試劑提取總RNA，根據PCR逆轉錄試劑盒說明書進行逆錄。采用2-ΔΔCt法對動脈血液中IL-1、MMP9和VEGF的表達水平進行相對定量分析。反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。引物序列見表1。

1.4.3 蘇木精-伊紅染色實驗 切取兔耳中動脈組織后進行石蠟包埋，常規制片染色，在光學顯微鏡下找到目標部位，拍照。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（x-±s）表示，行t檢驗；P<0.05表示差異有統計學意義。

2.1 兔耳動脈血液IL-1、MMP9和VEGF表達水平比較 兔耳栓塞部位動脈血液取樣后，QPCR結果顯示：結扎組與HA組IL-1、MMP9和VEGF的表達水平均高于對照組（P<0.05）；結扎組IL-1、MMP9和 VEGF表達水平均高于HA組（P<0.05），見圖1。

2.2 HE染色切片結果 在對照組中，動脈內膜、中膜及外膜結構層次整齊、分界清晰，內皮細胞及中膜平滑肌細胞排列整齊有序，中膜完整。在HA組中，動脈腔內可見透明質酸殘留，少量巨噬細胞聚集，部分內膜結果破壞，內膜外出現一部分平滑肌細胞，中膜已出現在內膜內側，中膜完整。在結扎組中，動脈腔內大量紅細胞淤積，可見血栓形成，動脈內膜中大量巨噬細胞聚聚，大量的中膜生長至內膜內側，中膜結構遭到破壞，變薄稀疏，結構紊亂，外膜結構不完整，見圖2。

HA是細胞外基質的主要成分，常用于皮膚美容[8]。由于面部血管分支的復雜性及部分操作者技術不成熟操作不規范，血管栓塞事件常有報道[9-11]。研究透明質酸栓塞對血管的影響及機制具有重要意義。在生理狀態下，內皮細胞和平滑肌細胞均能產生少量IL-1，但在病理狀態下如缺氧、炎癥反應時，IL-1大量表達[12]。IL-1在血管損傷后動脈中膜平滑肌細胞的遷移過程中發揮重要作用，可抑制IL-1表達，減輕內膜增生[5， 13]，因此IL-1的表達水平在一定程度能反應內膜增生的趨勢。MMP9屬于明膠酶，可降解各種膠原和包括彈力蛋白在內的多種蛋白[14]。VEGF是血管內皮細胞特異性結合生長因子，當炎癥、缺氧等原因引起VEGF大量表達并激活后，VEGF引起血管通透性增加并促進內皮細胞和新生血管形成[15，16]。

在正常狀態下，動脈壁內膜中并不存在平滑肌細胞，在血管損傷后，平滑肌細胞遷移至內膜增生，成為內膜的主要細胞[17]。在本實驗中觀察到，對照組HE染色切片鏡下顯示動脈各層結構清晰完整。在使用HA注射或結扎引起血管栓塞后，血流動力障礙形成，血管及周圍組織缺氧，誘發炎癥反應，各種炎細胞聚集，同時IL-1、MMP9及VEGF表達升高。VEGF引起的血管通透性增加進一步誘導炎細胞聚集，同時促進平滑肌細胞及內皮細胞增生，MMP9降解動脈壁中細胞外基質各種蛋白的同時，協同IL-1促進平滑肌細胞從中膜轉移至內膜，平滑肌細胞進入中膜后繼續增生，并伴隨平滑肌細胞表型轉化，促進血栓形成或引起動脈狹窄[18]。在第5天在HE染色切片下觀察到HA組動脈的內膜中已經出現了少量的平滑肌細胞，動脈內膜中僅有少量中膜和巨噬細胞，但中膜結構仍然完整，結扎組內膜中出現了大量的平滑肌細胞和巨噬細胞，中膜結構極其紊亂且變薄，IL-1、MMP9和VEGF的表達水平較HA組更高。HA會在HA酶的作用下降解[19]，且HA引起的栓塞并不會像結扎血管那樣嚴重損傷血管[20]，因此，HA組IL-1、MMP9及VEGF的表達水平較結扎組低。

綜上所述，HA栓塞后會引起IL-1、MMP9和VEGF表達升高，損傷動脈壁正常結構，但較完全阻斷血流引起的栓塞相比，程度較輕微，并不會在栓塞的基礎上進一步加重血管結構重塑。本實驗的不足之處是僅能確定HA引起的栓塞會引起IL-1、MMP9和VEGF表達升高和動脈壁重塑，但不能確定HA是否參與了這個過程，HA是否會引起動脈壁重塑，或在栓塞時保護血管免受重塑，其機制仍需進一步研究。

[1]van den Elzen H，Schelke L，Velthuis P.Temporary hair loss after injection of hyaluronic acid filler[J].J Cosmet Dermatol，2022，21（2）：625-626.

[2]Wang J，Shen H，Liu T，et al.An Efficacy and Safety Study of Intra-arterial Recanalization of Occluded Ophthalmic Arteries in Patients with Monocular Blindness Caused by Injection of Hyaluronic Acid in Facial Tissues[J].Aesthetic Plast Surg，2021，45（4）：1573-1578.

[3]Salinas-Alvarez Y，Welsh EC，Soto-Dominguez A，et al.Hyaluronic Acid Embolism Treated with Subcutaneous High and Low Hyaluronidase Doses： Efficacy and Surrounding Tissue Effect[J].Plast Reconstr Surg，2021，148（6）：1281-1288.

[4]陳康，陳敏亮.面部注射透明質酸導致血管栓塞的防治進展[J].中華整形外科雜志，2023，39（2）：215-219.

[5]Roubille F，Busseuil D，Shi Y，et al.The interleukin-1β modulator gevokizumab reduces neointimal proliferation and improves reendothelialization in a rat carotid denudation model[J].Atheroscleros is，2014，236（2）：277-285.

[6]劉博峰，董曉輝，劉彥青，等.山豆根醇提取物對大鼠腦動脈瘤血管內皮細胞的作用機制[J].西北藥學雜志，2023，38（2）：92-98.

[7]Karaman S，Paavonsalo S，Heinolainen K，et al.Interplay of vascular endothelial growth factor receptors in organ-specific vessel maintenance[J].J Exp Med，2022，219（3）：e20210565.

[8]周劼，陳媛，宋長緒，等.透明質酸注射填充改善中面部輪廓低平的臨床研究[J].中國醫療美容，2022，12（7）：16-19.

[9]楊天琦，劉潔，陳智維，等.透明質酸在鼻根部注射致眼動脈栓塞1例并文獻回顧[J].中國醫療美容，2021，11（12）：17-19.

[10]劉小嬌，劉嬌，尤軍，等.透明質酸填充致左顳部血管栓塞后脫發一例[J].中國美容整形外科雜志，2019，30（3）：182-183.

[11]侯寶軍，未燈輝，朱守超.顳部鈍針注射透明質酸致眼動脈栓塞成功救治1例[J].中國醫療美容，2020，10（11）：44-45.

[12]Zheng ZH，Zeng X，Nie XY，et al.Interleukin-1 blockade treatment decreasing cardiovascular risk[J].Clin Cardiol，2019，42（10）：942-951.

[13]Mantione ME，Lombardi M，Baccellieri D，et al.IL-1β/ MMP9 activation in primary human vascular smooth muscle-like cells：Exploring the role of TNFα and P2X7[J]. Int J Cardiol，2019，278：202-209.

[14]孔亞茹，周小楓，熊浩銘，等.基質金屬蛋白酶MMP2和MMP9在哺乳動物卵泡發育中的作用研究進展[J].廣東農業科學，2020，47（3）：103-110.

[15]陳加榮，沈洪園，李憑躍.VEGF復合透明質酸鈉對異體BPTB重建兔前交叉韌帶再血管化的影響[J].中國骨科臨床與基礎研究雜志，2020，12（3）：149-155.

[16]Zhou Y，Zhu X，Cui H，et al.The Role of the VEGF Family in Coronary Heart Disease[J].Front Cardiovasc Med，2021，8：738325.

[17]Yue H，Febbraio M，Klenotic PA，et al.CD36 Enhances Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation and Development of Neointimal Hyperplasia[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2019，39（2）：263-275.

[18]裘文剛，陳冠亮，馬路遙，等.胃癌術后靜脈血栓栓塞患者血清MMP-9、MIF、FM水平變化及其臨床意義[J].心電與循環，2021，40（6）：603-607.

[19]Wu GT，Kam J，Bloom JD.Hyaluronic Acid Basics and Rheology[J].Facial Plast Surg Clin North Am，2022，30（3）：301-308.

[20]Weber GC，Buhren BA，Schrumpf H，et al.Clinical Applications of Hyaluronidase[J].Adv Exp Med Biol，2019，1148：255-277.

收稿日期：2023-11-17 編輯：扶田