亮氨酸通過PI3K-AKT信號通路促進牛成肌細胞的增殖

苗 舒,安濟山,王 祚,肖定福,蘭欣怡,劉 磊,沈維軍*,萬發春*

(1.湖南農業大學動物科學技術學院,長沙 410128;2.湖南農業大學動物醫學院,長沙 410128)

2022年我國牛肉進口314萬噸,高居全球第一,表明我國牛肉市場存在巨大缺口[1]。骨骼肌是肉牛軀體占比最高的組成部分,與產肉性能直接相關。動物出生后,成肌細胞的增殖、分化與融合被看作是參與骨骼肌發育的重要途徑[2]。Leu是參與動物機體多種細胞和生理過程的關鍵營養物質,同時也是骨骼肌中不可缺少的支鏈氨基酸[3]。大量研究表明,Leu對刺激蛋白質合成、抑制蛋白質降解、增強蛋白質活性和真核起始因子的有效性等過程具有重要的意義[4-5]。在骨骼肌生長發育方面,研究發現Leu可不同程度的促進C2C12[6]、鼠衛星細胞[7]、豬成肌細胞[8]以及綿羊成肌細胞[9]的增殖與分化。目前,關于Leu對牛成肌細胞影響的研究尚未見報道,其對成肌細胞增殖的調控機制尚不清楚。PI3K-AKT通路是一條關鍵的細胞內信號通路,可調控多種生物學過程。研究報道,PI3K-AKT通路在骨骼肌的生長發育中具有重要的調控作用。如王琴[10]研究發現睪酮可激活PI3K-AKT通路促進雞胚成肌細胞的增殖;付玉瑩[11]發現,WDR13調控PI3K-AKT通路促進牛肌肉衛星細胞的分化。于歡等[12]研究發現,胰島素可通過PI3K-AKT通路增強大鼠骨骼肌成肌細胞的增殖;也有研究表明,鋅可通過PI3K/AKT促進肌源性細胞的增殖和激活[13]。近年來研究表明,營養素可通過信號通路發揮調控細胞發育的作用,因此推測Leu可能通過 PI3K-AKT信號通路調控牛成肌細胞的增殖。

本試驗以牛成肌細胞為研究對象,探究外源性補充Leu對牛成肌細胞增殖的影響,同時利用RNA-Seq和生物信息學分析明確Leu對牛成肌細胞增殖的作用機理,旨在為Leu對肉牛肌肉發育的影響及其機制研究提供重要的理論基礎,同時也為Leu在畜牧生產中調控肉品質方面的作用研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗細胞來源 試驗所用細胞為湖南農業大學動物科學技術學院南方草食動物研究中心分離鑒定并保存的原代牛成肌細胞。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養液、0.25%胰蛋白酶、雙抗(PS)、I型膠原酶購自Gibco公司;不含Leu的DMEM/F12培養液購自博士德生物公司;胎牛血清(FBS)購自PAN公司;Leu購自Solarbio公司;EdU檢測試劑盒購自 Beyotime公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)、PAGE凝膠超快速配制試劑盒購自大連美侖生物公司;LY294002購自MCE公司;反轉錄和實時熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司;抗體PAX7(A12740)購自Abclonal公司;抗體P-AKT(4060)購自CST公司;抗體Tubulin(380628)購自成都正能生物公司;倒置熒光顯微鏡(型號Axio Vert.A1)購自ZEISS公司;實時熒光定量PCR儀(型號CFX96)購自BIO-RAD公司;多功能成像系統(JS-1070P)購自上海培清科技公司;RNA-Seq服務由諾禾致源生物有限公司提供。

1.1.3 Leu及完全生長培養液配制 100 mmol·L-1的Leu母液:稱取0.393 g的Leu加入到30 mL的(不含Leu)DMEM/F12培養液中,37 ℃加熱混勻,4 ℃保存備用。

完全培養基:84% DMEM/F12+15%FBS+1%PS,混勻,4 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛成肌細胞培養與鑒定 于長沙紅星屠宰場采取16月齡健康雄性利木贊牛背最長肌肌肉組織,牛成肌細胞的培養與鑒定參照王亞寧[14]和王曉剛[15]的操作方法。剛分離出的細胞于37 ℃,5% CO2培養箱中培養 2 h,此時大量的成纖維細胞貼壁,將未貼壁細胞懸液轉入新的培養瓶中培養,重復此步驟2次,即為細胞純化過程。每48 h 換液,細胞密度達80%左右進行傳代和凍存。通過對成肌增殖標志因子PAX7的免疫熒光染色鑒定成肌細胞,參考孫金魁等[16]的方法進行操作,利用倒置熒光顯微鏡拍照,檢測染色結果。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力 待細胞密度達到80%時,將細胞用0.25%胰酶消化下來,加入完全培養液重懸后,使用細胞計數板進行計數,以每孔5×103個細胞接種于96孔板中,加入100 μL完全培養基,待細胞生長達到合適的密度(約50%)后,更換含不同濃度(0、0.25、0.50、0.75和1 mmol·L-1)的Leu培養基處理細胞,每個處理5個重復,置于37 ℃,5% CO2培養箱中培養24 h后,每孔加入10 μL的CCK-8試劑,繼續培養4 h,利用酶標儀在450 nm波長下測定OD值(測定過程應避光操作)。

1.2.3 EdU染色法檢測細胞增殖 將細胞以5×103個·孔-1接種于96孔板中,設置對照組(0 mmol·L-1Leu)和最佳濃度Leu組,每組3個生物學重復,在培養箱中培養24 h后,按照EdU試劑盒說明書進行操作,在倒置熒光顯微鏡下觀測DAPI標記的細胞總數與EdU標記的陽性細胞數,并進行EdU陽性細胞率的統計分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) Trizol法提取細胞總RNA,利用RNA反轉試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA,熒光定量試劑盒對目的基因進行實時定量檢測。NCBI primer-BLAST設計目的基因的引物,所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成,qRT-PCR反應程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,循環40次。引物信息序列見表1。

表1 qRT-PCR引物信息序列Table 1 Primer information sequence of qRT-PCR

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western blot) 將細胞接種于6孔板中,每組3個生物學重復,提取各組的細胞總蛋白。采用BCA法檢測蛋白濃度,統一濃度后對蛋白進行變性。WB試驗檢測目的蛋白的相對表達量,將變性后的蛋白樣品上于10% SDS-PAGE膠,80 V電泳30 min后,調電壓至120 V,直至樣品跑到最底部,最后400 mA恒流30 min進行快速電轉。電轉結束后用5%的脫脂奶粉封閉液于搖床上封閉2 h,加入對應的一抗,4 ℃過夜孵育。次日,加入對應的二抗孵育,ECL試劑盒顯色,利用凝膠成像儀顯影拍照,并利用image j軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.2.6 轉錄組學測序分析 為探究Leu對牛成肌細胞增殖的作用機理,以最佳濃度Leu為處理組、0 mmol·L-1Leu為對照組進行RNA-Seq,每組3個生物學重復,加入Trizol刮取細胞收集于1.5 mL離心管中,低溫保存運輸,樣品交于北京諾禾致源生物有限公司進行測序分析。主要試驗過程包括:①RNA提取與檢測;②文庫構建與質檢;③上機測序;④數據質控;⑤序列比對到參考基因組;⑥篩選差異基因;⑦差異基因GO和KEGG富集分析。GO-KEGG富集分析通過clusterProfiler (3.8.1)軟件進行。

1.2.7 數據統計與分析 數據分析與作圖使用SPSS 21.0和 GraphPad 8.0軟件。熒光定量PCR以GAPDH為內參使用2-ΔΔct計算基因相對表達量;利用獨立樣本t檢驗對兩組試驗數據進行統計處理;利用單因素方差分析對多組試驗數據進行統計處理,DUNCAN檢驗進行多重比較。所有結果以”平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示。不同字母標注表示各組之間具有顯著差異(P<0.05)。

2 結 果

2.1 牛成肌細胞的鑒定

通過免疫熒光染色檢測成肌增殖標志因子PAX7蛋白的表達情況,DAPI進行細胞核染色,如圖1顯示,細胞核外周及胞漿均呈現綠色熒光,表明PAX7呈陽性表達,使用image j合并DAPI和PAX7后發現每個細胞核外周均呈現出綠色熒光,表明本試驗成功分離了牛成肌細胞,且細胞純度較高,可滿足后續試驗需求。

圖1 牛成肌細胞PAX7免疫熒光染色(200×)Fig.1 PAX7 immunofluorescence staining of bovine myoblasts (200×)

2.2 Leu對牛成肌細胞增殖的影響

由圖2可知,Leu處理后牛成肌細胞形態未發生改變,處于成肌細胞增殖期。與對照組(0 mmol·L-1Leu)相比,各處理組均可顯著提高牛成肌細胞活力(P<0.05),且細胞活力先隨著Leu濃度的增加呈上升趨勢,后隨著濃度的增加有所下降。其中,0.5 mmol·L-1Leu極顯著高于對照組(P<0.01),因此選擇0.5 mmol·L-1為牛成肌細胞增殖期的最佳濃度,進行后續試驗。0.5 mmol·L-1Leu處理牛成肌細胞24 h后,采用EdU染色法檢測牛成肌細胞的增殖狀態。如圖3所示,與對照組相比,0.5 mmol·L-1Leu組EdU陽性細胞數明顯增多,其EdU陽性細胞率顯著增加(P<0.05)。

2.3 轉錄組測序數據過濾統計

測序產生的原始數據(raw data),通過Fastp軟件過濾掉不合格的序列后得到有效數據(clean data),分別進行統計后發現符合過濾條件的reads(PF)大于97%以上,過濾后reads大于Q20、Q30的比例在97%、93%以上,6個樣品的序列數據中GC含量約為52%,表明數據質量符合進一步生物信息分析的需求(表2),其中A組表示對照組,B組表示Leu處理組。

A. Leu濃度篩選細胞光鏡圖(40×);B. CCK-8細胞活力測定圖:不同字母標注表示各組之間具有顯著差異(P<0.05),下同 A. Light microscope image of cells selected by Leu concentration (40 ×); B. Plot of CCK-8 cell viability assay: Different letter marks indicate significant differences between groups (P<0.05), the same as below圖2 Leu對牛成肌細胞活力的影響Fig.2 Effect of leucine on the viability of bovine myoblasts

A. EdU染色圖(100×);B. EdU陽性細胞率統計圖 A. EdU staining diagram(100×); B. Statistical plot of EdU-positive cell rate圖3 Leu處理牛成肌細胞后EdU增殖檢測Fig.3 EdU proliferation detection of bovine myoblasts treated with leucine

表2 測序數據質量評估Table 2 Quality assessment of sequencing data

2.4 Leu處理增殖期牛成肌細胞的差異基因分析

如圖4所示,經Leu處理增殖期牛成肌細胞24 h后,以|log2foldchange|>0、校正后P值(padj)<0.05作為閾值,共篩選出1 290個差異表達基因,其中688個基因相對上調和602個基因相對下調,對差異基因進行聚類分析,可觀察到明顯的差異表達基因分組模式。

2.5 差異表達基因的功能注釋

為了探究所篩選差異基因的生物學功能,對差異基因進行GO富集分析,按照分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)和細胞組分(cellular component,CC)進行GO分類,挑選每個GO分類中padj值最小即富集最顯著的前10個GO條目進行展示(圖5)。與對照組相比,Leu組的差異表達基因參與了多種生物過程,包括肽的代謝合成過程、酰胺的代謝合成過程等;在分子功能類別上,大多數基因功能與核糖體的結構成分、氧化還原酶活性、NADH脫氫酶活性等相關;在細胞組分范疇內,大部分的基因被富集到核糖體、細胞質、細胞器等。

A. 差異表達基因分析的火山圖:紅色點表示上調基因,綠色點表示下調基因,藍色點表示變化不顯著基因。B. 差異表達基因的聚類分析熱圖:橫坐標代表不同樣品,縱坐標代表不同樣品對比的差異表達基因;不同位置色塊代表對應位置基因的相對表達量,紅色代表高表達,綠色代表低表達 A.The volcano plot of differentially expressed genes analysis, with red dots indicating up-regulated genes, green dots indicating down-regulated genes, and blue dots indicating genes with insignificant changes. B. The heat map of the cluster analysis of differentially expressed genes: The abscissa represents different samples, and the ordinate represents the differentially expressed genes compared between different samples; The color blocks at different positions represent the relative expression levels of genes at corresponding positions, red represent high expression, green represent low expression圖4 Leu處理增殖期牛成肌細胞的差異表達基因Fig.4 Differentially expressed genes in bovine myoblasts treated with leucine during proliferative phase

圖5 Leu處理增殖期牛成肌細胞差異基因的GO富集氣泡圖Fig.5 GO enrichment bubble plots of differential genes after leucine treatment of proliferating bovine myoblasts

將篩選到的差異基因映射到KEGG數據庫中。Leu組有644個差異表達基因得到注釋,其中309個上調基因涉及47條顯著富集通路(padj<0.05),其中將前20條通路以氣泡圖進行展示(圖6)。與骨骼肌生長發育相關的通路有粘著斑、AMPK、PI3K-AKT、肌動蛋白細胞骨架調節、胰島素信號等通路,其中PI3K-AKT信號通路最為富集,包含34個上調基因。

圖6 Leu處理增殖期牛成肌細胞差異基因的KEGG富集氣泡圖Fig.6 KEGG enrichment bubble plots of differential genes in bovine myoblasts treated with leucine during proliferative phase

2.6 PI3K-AKT信號通路分析

為了檢驗RNA-Seq數據的準確性,隨機挑選PI3K-AKT信號通路中6個差異表達基因進行熒光定量PCR驗證。結果如圖7 顯示,Leu可提高牛成肌細胞增殖過程中PIK3R1、FOXO3、IRS1、RPTOR、MTOR和MET的基因表達水平,這與RNA-Seq的結果一致,表明測序結果是可靠的。為了進一步研究Leu對PI3K-AKT信號通路的調控作用,采用PI3K特異性抑制劑LY294002和Leu共同處理牛成肌細胞,24 h后收取細胞總蛋白和總RNA。采用WB檢測PI3K-AKT信號通路中P-AKT和牛成肌細胞增殖標志因子PAX7的蛋白表達水平,qRT-RCR檢測牛成肌細胞增殖標志因子PAX7、CDK1和PCNA的基因表達水平。結果如圖8所示,與對照組相比,P-AKT和PAX7的蛋白水平在Leu組顯著增加(P<0.05),當LY294002和Leu共同處理時,P-AKT和PAX7的蛋白水平比Leu單獨處理顯著降低(P<0.05);在基因表達水平上,PAX7、CDK1和PCNA的表達量經Leu處理后顯著增加(P<0.05),當LY294002和Leu共同處理時,CDK1和PCNA的表達量比Leu單獨處理顯著降低(P<0.05),而PAX7表達量無顯著變化(P>0.05)。以上結果表明,抑制PI3K-AKT信號通路后,可阻斷Leu對牛成肌細胞增殖的促進作用,這說明Leu可通過調控PI3K-AKT信號通路促進牛成肌細胞的增殖。

3 討 論

成肌細胞,又稱肌肉干細胞。哺乳動物成體骨骼肌是一種相對穩定的組織,在正常的生理狀態下很少發生細胞死亡或核裂變[17]。成肌細胞的增殖在骨骼肌生長發育中起著重要作用。目前,Leu對牛成肌細胞增殖的影響尚未見報道。本試驗利用不同濃度Leu處理增殖期牛成肌細胞后,牛成肌細胞活力顯著上升,并篩選出0.5 mmol·L-1Leu為最佳濃度,同時,經Leu處理后EdU陽性細胞率顯著提高,表明Leu可促進牛成肌細胞的增殖。

為了進一步探究Leu對牛成肌細胞增殖的作用機理,進行RNA-Seq和生物信息學分析,旨在篩選出Leu調控牛成肌細胞增殖的差異基因和關鍵信號通路。本試驗共篩選到1 290個差異表達基因,對所有差異表達基因進行GO功能注釋發現,顯著富集到59個條目,BP共23條,占比37.9%;MF共20條,占比34.5%;CC共16條,占比27.6%,這表明所篩選的差異基因在生物過程中具有重要影響,包括肽的代謝合成過程、酰胺的代謝合成過程等,這可能與Leu促進骨骼肌中蛋白質的合成有關。KEGG富集分析中,有644個差異表達基因得到注釋,其中309個上調基因涉及47條顯著富集通路,與骨骼肌生長發育相關通路有粘著斑、AMPK、PI3K-AKT、肌動蛋白細胞骨架調節、胰島素信號等通路。PI3K-AKT通路是細胞內關鍵的信號通路之一,調節細胞的多種生物學過程,包括細胞生存、代謝、分化和增殖。大量研究表明,PI3K/AKT通過調控下游靶蛋白如mTOR[18]、NF-κB[19]、P70S6K[20]的表達來調控細胞增殖。在本試驗中,PI3K-AKT通路是骨骼肌生長發育相關通路中最顯著富集的信號通路,包含34個差異表達基因。這也符合前期的推測,即Leu與PI3K-AKT通路之間可能存在調控關系。因此,重點關注PI3K-AKT信號通路。

A. PI3K-AKT信號通路富集的差異表達基因聚類圖;B. qRT-PCR驗證隨機挑選的差異表達基因 A. The cluster map of differentially expressed genes enriched in PI3K-AKT signaling pathway; B. The randomly selected differentially expressed genes verified by qRT-PCR圖7 PI3K-AKT信號通路中富集的差異表達基因Fig.7 Differentially expressed genes enriched in PI3K-AKT signaling pathway

A. 添加LY294002后P-AKT和PAX7的蛋白表達量變化;B. 添加LY294002后PAX7、CDK1和PCNA的基因表達量變化 A. The protein expression changes of P-AKT and PAX7 after adding LY294002; B. The changes of PAX7, CDK1 and PCNA genes expression after adding LY294002圖8 Leu處理增殖期牛成肌細胞對PI3K-AKT信號通路的影響Fig.8 Effect of leucine treatment on PI3K-AKT signaling pathway in proliferating bovine myoblasts

為了檢驗RNA-Seq測序數據的準確性,從PI3K-AKT信號通路中隨機挑選6個差異表達基因(PIK3R1、FOXO3、IRS1、RPTOR、MTOR和MET)進行熒光定量PCR驗證。這6個基因的表達模式與RNA-Seq的結果一致。PI3K是一種異源二聚體,由一個含SH2的調節亞基(p85)和一個催化亞基(p110)組成。PI3K的激活是由p85結合活化受體酪氨酸激酶(RTKs)誘導的,當二者的結合能力降低時會抑制PI3K-AKT信號傳導[21]。PIK3R1基因主要編碼PI3K(p85)調節亞基,同時也是正常組織中最豐富的亞型,其可調控細胞增殖過程[22]。當PIK3R1缺失或減少時會影響B細胞的發育和增殖,抑制細胞粘附,延緩胚體發育;而沉默PIK3R1可抑制Huh7細胞的增殖[23]。在肝臟中PIK3R1的缺失會引發胰島素刺激的PI3K活性顯著降低,導致肝臟糖脂平衡、肝臟大小和功能顯著改變。本試驗中,PIK3R1基因在Leu組中的表達量高于對照組,并且顯著富集到PI3K-AKT信號通路,這表明牛成肌細胞增殖與PIK3R1基因表達上調有關。FOXO3基因是叉頭盒家族(Forkhead box O,FOXO)中的一員,具有廣泛的細胞功能,包括調節細胞周期、凋亡、萎縮、DNA修復、能量代謝和抗氧化應激[24]。FOXO3是PI3K-AKT信號通路的重要下游靶點,被激活的AKT通過磷酸化FOXO3調控其從細胞核到細胞質的定位,使其失活[25]。FOXO3在骨骼肌生長發育中的作用已經被廣泛報道,它在大多數細胞中均有表達,是影響雞肌肉生長的候選因子[26]。敲低雞成肌細胞中FOXO3后,增殖標志因子PAX7基因和蛋白的表達水平均顯著下調,同時分化期的肌管融合率顯著高于未敲低組,這表明FOXO3可促進雞成肌細胞增殖,抑制肌管分化[27]。有研究表明,MyoD是FOXO3的直接靶標,FOXO3缺失小鼠中MyoD下調會導致肌肉再生缺陷,這表明FOXO3在調節成肌增殖分化中發揮著關鍵作用[28]。本試驗中,Leu促進牛成肌細胞的增殖可能與FOXO3的上調有關。IRS1又稱作胰島素受體底物1,其在哺乳動物骨骼肌中表達量最高。在細胞表面,胰島素樣生長因子(IGF1)與其受體相結合,以異構二聚體的形式磷酸化IRS1,進而激活下游的PI3K-AKT和MAPK信號通路,二者均具有促進細胞有絲分裂和生存的作用[29]。IRS1的總量或磷酸化量減少可導致細胞對IGF1或胰島素的反應性降低,并導致PI3K/AKT和MAPK途徑的激活降低[30]。IGF1/IRS1/PI3K/AKT途徑通過增加蛋白質合成和阻斷蛋白質降解誘導骨骼肌肥大[31]。張冬杰等[32]研究發現,過表達C2C12細胞IRS1基因后,成肌調節因子(Myf5、MyoD、MyoG、Myf4)和MYHC的轉錄水平發生了顯著上調,這說明IRS1可促進肌細胞的增殖與分化。MTOR和RPTOR共同編碼MTOR蛋白復合物1(MTORC1),MTORC1主要作用是磷酸化兩個下游底物核糖體蛋白S6K1和4E-BP1調控蛋白質合成,以促進骨骼肌生長。已有研究表明,Leu可通過激活mTORC1促進骨骼肌中蛋白質的合成[33]。在本試驗中,經Leu處理后,牛成肌細胞轉錄本MTOR和RPTOR表達量都顯著提高。

蛋白激酶B(AKT)是PI3K-AKT信號通路的另一個關鍵因子,其對于細胞新陳代謝、增殖、存活和生長具有重要意義[34]。為了進一步明確Leu與PI3K-AKT信號通路的調控關系,本研究先用PI3K特異性抑制劑LY294002與Leu分別單獨處理增殖期的牛成肌細胞,然后檢測成肌細胞增殖期標志因子PAX7、PCNA和CDK1的基因表達水平,以及PI3K-AKT信號通路中P-AKT和PAX7蛋白表達水平。結果顯示,抑制PI3K-AKT信號通路后,降低了PAX7、PCNA和CDK1的基因表達水平,同時P-AKT和PAX7蛋白表達水平也有所降低,這表明抑制該通路后牛成肌細胞的增殖受到抑制;添加外源性Leu后,可提高成肌增殖期標志因子的基因表達水平,同時P-AKT和PAX7蛋白表達水平也有所提升,這表明Leu可促進牛成肌細胞的增殖;當抑制劑LY294002與Leu共同處理時,與單獨Leu組相比,PAX7、PCNA、CDK1基因的表達均下調,P-AKT和PAX7蛋白表達水平降低,這表明Leu對牛成肌細胞的增殖促進作用可被LY294002阻斷。本試驗結果表明Leu通過調控PI3K-AKT信號通路促進牛成肌細胞的增殖。

4 結 論

外源性添加Leu可促進牛成肌細胞的增殖,且0.5 mmol·L-1為增殖期的最佳濃度。添加 PI3K 抑制劑 LY294002 后阻斷了亮氨酸對牛成肌細胞增殖的促進作用。以上結果表明,亮氨酸可通過PI3K-AKT信號通路促進牛成肌細胞的增殖。