不同脂肪源對克氏原螯蝦生長性能與腸道菌群的影響

王超男，黃 凱，郭睿婕，于 凱，曹鑫盛，李輝廷，莫翠琴

(1.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004；2.天津贊蘭科技有限公司，天津 300000)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，俗稱小龍蝦、淡水龍蝦，其分類屬甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)螯蝦科(Cambarus)原螯蝦屬(Procambarus)，是淡水雜食性蝦類。自二十世紀三十年代被引入中國后[1，2]，其憑借超高的繁殖力和適應力、豐富的營養品質，已成為中國最重要的經濟水產養殖產品。

甲殼類動物需要某些必要的脂質來參與其蛻皮、生長、生殖和代謝功能等生命活動[3，4]，如攝入不適宜脂肪會引起其生理、生化功能的紊亂進而導致器官的病變[5-7]。水生動物食物成分的變化可以改變其腸道微生物群[8]，李秀玲等[9]研究發現不同脂肪源對卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)腸道微生物多樣性具有顯著影響，也有研究表明不同脂肪酸組成的脂肪源會影響凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)腸道菌群的組成[10]。而腸道微生物會參與哺乳動物的脂質代謝[11-13]，對斑馬魚(Daniorerio)腸道脂肪酸的吸收和代謝具有調節作用[14]，并且不同的菌群對脂滴的形成也有不同的影響。同時腸道微生物群落對蝦類的健康至關重要[15]，在正常生理狀況下，腸道微生物之間通過相互作用維持著動態平衡，可以幫助宿主促進營養吸收，刺激免疫反應和提高疾病抵抗力。

目前，關于克氏原螯蝦適宜脂肪源的研究報道和脂肪源對克氏原螯蝦腸道菌群影響的研究較少。根據脂質對甲殼動物的重要性與腸道菌群與脂質之間交錯的關系[14-16]，本實驗通過投喂不同脂肪源的飼料，研究其對克氏原螯蝦生長性能、肝胰腺組織學和腸道菌群的影響，以期為克氏原螯蝦的飼料脂肪源優化與健康養殖提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

分別以豆油(SO)、魚油(FO)、豬油(LO)和混合油(豆油∶魚油=1∶1，MO)為脂肪源配制四種等氮等脂的實驗飼料。具體方法：按比例加入經粉碎且過 80 目篩后的主要原料，再分別加入上述脂肪源和適量水在攪拌機中充分混合，用小型絞肉機制成直徑3 mm，長度5 mm 的顆粒飼料，經風干后置于-20 ℃冰箱中備用，其配方如表1。

表1 飼料組成及營養水平Tab.1 Composition and nutrient levels of experimental diets %

1.2 實驗用蝦及飼養管理

克氏原螯蝦苗均由本實驗組在廣西大學水產養殖基地飼養、繁育獲得。在馴餌池暫養7 d后，從中挑選480尾30～40日齡、規格一致(4.00±1.00)g、健康無殘缺的克氏原螯蝦仔蝦，隨機分配至4個實驗組的養殖池(1 m× 1 m× 0.6 m)中，每個實驗組設置3個重復組，每個重復組40尾蝦，暫養馴餌池及實驗養殖池內均用不銹鋼條及尼龍繩懸掛若干二指網眼尼龍網供其攀爬，并且通過遮陽網、加熱棒及增氧機等器材穩定環境和水質狀況[溶解氧(3.52±0.46)mg/L、水溫(27.68±2.63)℃、亞硝酸鹽≤0.5 mg/L]。養殖期間分別于每日06∶00及19∶30投喂兩次，表觀飽食投喂。每日初次投喂前用吸污機去除池內糞便、殘餌并清除死蝦殘骸。每2 d換水1次，換水量為池高的1/3。每日觀察并記錄蝦死亡數目、攝食狀態等，及時記錄攝食及死亡狀況，養殖周期為60 d。

1.3 樣品采集與測量

1.3.1 樣品采集

取樣前24 h停止投喂，每平行組隨機取10尾克氏原螯蝦，進行計數、稱重，并計算各生長指標。抽取血液置于1.5 mL離心管中，4 ℃靜置過夜后離心(4 ℃，4 000 r/min，10 min)取上清，-80 ℃保存，用于血清生化指標分析；無菌條件下剖取其胃部、腸道液氮速凍后-80 ℃保存備用，用于生理生化指標的測定；同時取肝胰臟，部分拍照后放于Bouin氏固定液保存，部分液氮速凍后-80 ℃保存，分別用于組織染色分析和生化指標測定。每平行組另隨機取10尾克氏原螯蝦，于無菌環境下擰動克氏原螯蝦尾扇直接將腸道拔出置于5 mL滅菌離心管內，隨后將3個重復組樣本1∶1∶1混合后作為每大組樣品，進行腸道菌群檢測。

1.3.2 生長指標相關計算公式

存活率(SR)=Nf/Ni×100%；

特定生長率(SGR)=(lnWf-lnWi)/t×100%；

飼料系數(FCR)=W/(Wf-Wi)。

式中，Nf為實驗結束時實驗用蝦尾數；Ni為實驗開始時實驗用蝦尾數；t為實驗天數；W為實驗飼料總投喂量；Wf為實驗結束時實驗用蝦總質量；Wi為實驗開始時實驗用蝦總質量。

1.3.3 組織學切片制作與觀察

肝胰臟組織標本固定24 h,經過水洗、脫水、透明、石蠟包埋等步驟后,制作5 μm厚的連續切片,HE染色。使用軟件“Image-pro plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)”使用吸管工具手動取色,分別測量區域白色脂肪空泡像素面積(H∶0-30;S、I∶0-255),計算出組織像素面積,求出脂肪空泡率(脂肪空泡面積比例)。

脂肪空泡率=A1/A2×100%

式中，A1為脂肪空泡像素面積；A2為組織像素面積。

1.3.4 生化指標測定

將胃、肝胰臟與腸道等組織用生理鹽水按重量體積比，在冰水浴條件下制備成組織勻漿液；離心取上清后，按照各自試劑盒(南京建成生物工程研究所)中說明書所描述的方法，分別對胃部的胃蛋白酶(PPS)、腸道的淀粉酶(AMY)與肝胰臟的脂肪酶(LPS)、谷丙轉氨酶(GPT)和谷草轉氨酶(GOT)等指標進行測定。將血清樣品同樣按照南京建成生物工程研究所試劑盒中說明書分別測定總蛋白(TP)、總膽固醇(CHO)和甘油三酯(TG)等指標。

1.4 腸道菌群檢測

采用16S rDNA 法對腸道微生物組成進行測定，首先根據QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒說明書方法進行總菌群DNA提取純化，并對16S rRNA基因V3-V4區進行擴增，引物為：GTACTCCTACGGGAGGCAGCA和GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT，熱反應條件為94 ℃變性4 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s的30個循環；最后在72 ℃下延長7 min。PCR 產物使用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目的條帶大小，并用Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒純化，使用購自賽默飛公司的膠回收試劑盒對目的條帶電泳后的產物進行回收。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq 6000進行上機測序。使用軟件USEARCH v7對經過嚴格過濾處理得到最終的有效數據進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTU(Operational Taxonomic Units)。經過降噪與物種注釋分析獲得分類學信息并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成，均一化處理后使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算覆蓋率、chao指數、observed_sPecies指數、香濃指數、辛普森指數。

1.5 數據處理與統計

實驗數據均用SPSS 26.0軟件統計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)與Duncan’s多重檢驗進行比較，所有數據值均由平均值±標準差(mean±SD)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 不同飼料脂肪源對克氏原螯蝦生長指標的影響

表2結果表明，MO組存活率顯著高于其他三組，特定生長率顯著高于FO組與LO組，與SO組差異不顯著；而LO組存活率與特定生長率均顯著低于其他組；其他指標未呈現顯著性差異。綜合來看MO組終末體質量、存活率、特定生長率最高，LO組終末體質量、存活率、特定生長率最低。飼料系數則相反，LO組最高(1.50)，MO組最低(1.37)。

表2 飼料脂肪源對克氏原螯蝦生長性能的影響Tab.2 The influence of feed lipid source on growth peformance of P.clarkia

2.2 飼料脂肪源對克氏原螯蝦消化酶活性及營養代謝指標的影響

不同飼料脂肪源對克氏原螯蝦消化酶活性指標的影響如表3。僅LO組LPS顯著高于其他三組，其他三組間LPS無顯著差異；PPS與AMY則在組間差異不顯著。

表3 飼料脂肪源對克氏原螯蝦消化酶活性的影響Tab.3 Effects of dietary lipid sources on digestive enzyme activities of P.clarkia U/mg

營養代謝指標如表4，CHO、GPT、GOP均呈現LO組顯著高于其他三組的情況；TP與TG則在組間均無顯著性差異，但是也呈現LO組最高的情況。

表4 飼料脂肪源對克氏原螯蝦營養代謝指標的影響Tab.4 Effects of dietary lipid sources on nutritional and metabolic indexes of P.clarkia

表5 Alpha多樣性指數統計表Tab.5 Statistical table of Alpha diversity index

2.3 脂肪源對肝胰腺組織學的影響

四種不同脂肪源對克氏原螯蝦肝胰臟組織的影響見圖1。SO組與FO組肝胰臟結構和細胞形態差異不明顯，脂肪空泡比例分別為(51.76±2.23)%與(52.67±4.83)%，差異不顯著；MO組脂肪空泡總面積略多于SO組和FO組，但脂肪空泡率為(53.88±1.43)%，與SO組和FO組差異不顯著，且肝小管結構更為豐滿；LO組脂肪空泡總面積和單個脂肪空泡面積在四組中最大，脂肪空泡率為(66.86±3.68)%，顯著高于其他組，且肝胰臟沉積脂肪最多。

圖1 飼料不同脂肪源小龍蝦的肝胰臟組織學觀察Fig.1 Observation of the histology of hepatopancreas1.LO組：示細胞核、脂肪空泡、核固縮，倍數200，標尺=100 μm；2.SO、FO、MO組：示細胞核、脂肪空泡，倍數200，標尺=100 μm；3.N：細胞核；F：脂肪空泡；K：核固縮

2.4 飼料脂肪源對克氏原螯蝦腸道菌群的影響

2.4.1 多樣性分析

用Alpha多樣性指數分析克氏原螯蝦腸道菌群多樣性的差異，如表6所示覆蓋率均在99%，表明微生物種類基本覆蓋，測序結果可代表克氏原螯蝦腸道菌群的真實情況。其中SO組chao指數、observed_sPecies指數、香濃指數最高，其次是MO組，說明SO組物種豐富度和多樣性最高，其次是MO組。

同時基于各組OTU值繪制的韋恩圖(圖2)顯示，各組樣品共有OTU數目為150，占OTU總數的18.5%，說明不同脂肪源對克氏原螯蝦腸道菌群多樣性影響較大。LO組、FO組、SO組、MO組分別特有的OTU數目為444、224、273、298，LO組特有的OTU數顯著高于另外三組，說明LO組的腸道菌群最復雜。

圖2 各實驗組OTU數目韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the number of OTU in each group

2.4.2 門分類水平上的菌群組成

4個組在門的水平上共檢查到19個菌門，其中13門為4組共有。選取四個組在門(Phylum)水平上的共有門類最大豐度排名前7的門類，繪制物種相對豐度堆積柱形圖(圖3)。結果表明，實驗組克氏原螯蝦腸道主要菌群為：變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、RsaHf231門、軟壁菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)。但是各組間同菌門相對豐度存在顯著差異。SO組變形菌門豐度為其他三組的4倍左右；擬桿菌門豐度在LO組最大，是SO組的4倍多，FO組和MO組的2倍左右；厚壁菌門豐度SO∶FO∶LO∶MO為20∶29∶17∶30。

圖3 門水平上物種相對豐度堆積柱狀圖Fig.3 Histogram of relative abundance accumulation at Phylum level

圖4 屬水平上物種相對豐度堆積柱形圖Fig.4 The column diagram of relative abundance accumulation on Genus level

2.4.3 在屬水平上的菌群組成

通過高通量測序，測得4組克氏原螯蝦腸道菌群屬水平上的分類共有341屬，其中四組共有菌屬99屬，SO組特有屬32屬，FO組屬特有10屬，LO組屬特有23屬，MO組屬特有4屬。

各組共有優勢菌屬(豐度>5%，下同)只有擬桿菌屬(Bacteroides)，在LO組占比最大為44.40%，是SO組的6倍左右，是FO與MO組的近3倍；未知的RsaHf231與Anaerorhabdus_furcosa_group屬是FO組、LO組與MO組共有的優勢菌屬，占比分別為29.67%、12.75%、15.44%與19.27%、9.26%、17.26%。

檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)僅為SO組與FO組的優勢菌群，且SO組豐度為FO組的近5倍；Dysgonomonas僅為FO與MO組的優勢菌群，占比分別為7.28%、5.62%；FO組特有一個丹毒絲菌屬(unidentifiedErysipelotrichaceae)占6.03%；MO組特有一個Candidatus_Bacilloplasma占9.72%。

3 討論

3.1 不同脂肪源對克氏原螯蝦生長性能的影響

本實驗研究發現，飼料中添加不同脂肪源對克氏原螯蝦存活率與特定生長率均有影響。已有研究表明，飼料中添加不同脂肪源可以影響飼料中各類脂肪酸的比例，進而影響蝦類的生長和健康[4，16]。本實驗中LO組在四個實驗組中生長狀況最差，飼料系數最高，和WU等[17]研究結果相似，ZHOU等[18]對凡納濱幼蝦的研究中也發現豬油組生長性能最差。推測可能是由于豬油缺乏長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)和必需脂肪酸(EFA)，不能滿足克氏原螯蝦生長營養需要，而且其飽和脂肪酸比例過高，導致其飼料利用率較差[19]。MO組在本實驗中生長性能最好，推測是因為其中魚油的含量已經足以提供克氏原螯蝦生長所需的EPA與DHA，而其中的豆油另外提供了亞油酸(LOA)促進克氏原螯蝦的生長[20]。而且蝦類在其生長發育過程中有進行食性轉變的特點，同樣也會導致其營養需求變化[21]。本實驗結果證明將動物性與植物性脂肪源進行搭配會具有協同效應，更能滿足克氏原螯蝦生長需要，但是其最佳脂肪源配比仍有待進一步的研究。

3.2 不同脂肪源對克氏原螯蝦營養代謝的影響

消化酶影響著水生生物對營養物質的消化能力，同時也影響其自身的生長性能[22]。飼料的營養結構是影響甲殼類動物消化酶活性的重要因素，魯耀鵬等[23]的實驗研究中也指出，不同脂肪源對紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)消化酶活力均有直接影響。本實驗結果顯示(表3)，克氏原螯蝦三項消化酶指標中僅脂肪酶活性在組間差異顯著，說明豆油、魚油與豬油對蛋白酶和淀粉酶的影響有限，而脂肪酶活性可能受SFA的影響更大，而且圖1、表4表明LO組克氏原螯蝦肝胰臟組織切片脂肪空泡率顯著高于其他實驗組，營養代謝指標也均呈現LO組最高的情況，說明克氏原螯蝦對高飽和度脂肪難以消化、吸收和利用，所以LO組肝胰臟產生更多的脂肪酶用于消化，并且過度的高飽和脂肪還造成肝胰臟脂肪堆積進而引起病變和肝細胞損傷，TCHO、GPT、GOT、TG由肝細胞中進入體液循環，機體產生更多TP用以修復肝臟損傷，引起各項指標測定值上升。

3.3 不同脂肪源對克氏原螯蝦腸道菌群的影響

本實驗分析發現，在門水平上，實驗組主要腸道菌群為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、RsaHf231門、軟壁菌門、放線菌門，和其他學者對甲殼類物種的研究結果相似[25-27]，但是本實驗各組菌群結構差別明顯。在本實驗中，4組飼料除脂肪源種類不同外其他原料組成都是相同的，因此脂肪源種類是決定菌群結構的主要因素。

變形菌門是多種水產動物如大黃魚(Larimichthyscrocea)、中華絨螯蟹、凡納濱對蝦等腸道中的優勢菌群[28]，在陳一銘等[28]、謝夢琪等[29]對克氏原螯蝦腸道菌群的研究中均發現變形菌門為最大優勢菌群，而在本實驗中，只有SO組變形菌門占比最大；不過本實驗LO組、FO組、MO組中變形菌門所占比例與王飛飛等[30]的研究結果相似。目前在甲殼動物研究上，還未明確指出變形菌門在甲殼動物的作用，但在張立強等[31]對健康和患病克氏原螯蝦腸道微生物群落結構和多樣性分析中表明患病克氏原螯蝦腸道微生物中變形菌門的占比顯著上升。有研究指出：腸道中變形菌門的大量繁殖反映了生態失調或不穩定的腸道微生物群落結構[32]，且該門豐度過高易導致消化吸收紊亂[33]。此外有研究表明，當變形菌門所占比例適宜，它們看起來就會是良性的，而當在某些腸道環境下時，它們就會成為可引發炎癥反應的微生物[32]。所以變形菌門豐度過高，可能有很大的患病隱患。

擬桿菌的主要功能是幫助宿主降解碳水化合物(尤其是多糖)、蛋白質和其他物質，可以參與到膽汁酸以及類固醇的代謝中，以提高宿主的營養利用率。LO組擬桿菌門為最大優勢菌門，占比達到了53.82%，同時也是四組中擬桿菌門豐度最多的一組，推測可能與LO組總膽固醇在四組中最高有關。厚壁菌有助于膳食纖維的降解，并將纖維降解為揮發性脂肪酸以供宿主利用。而且擬桿菌與厚壁菌之間存在著一種相互促進的共生關系，它們共同促進宿主吸收或儲存能量，其比值的變化會影響機體內腸道菌群的代謝潛力[29]。而四組中LO組的生長性能最差，同時其擬桿菌門與厚壁菌門的比例與其他三組差別最大，推測厚壁菌門與擬桿菌門的比例，很有可能是影響生長性能的重要因素。軟壁菌門對魚體生長和抑制致病細菌有積極作用，四組中只有MO組軟壁菌門豐度在10%以上。

在屬水平上，四個組共有的擬桿菌屬是克氏原螯蝦的常駐菌群。研究發現，許多擬桿菌屬可影響纖維素晶體和木質纖維素的降解[34]；還有研究表明，擬桿菌屬(Bacteroides)可通過分泌三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)誘導組蛋白脫乙酰基酶3(histone deacetylase 3，HDAC3)的表達，介導腸道上皮對脂質的吸收和代謝[35]；也有研究表明擬桿菌還有助于增強機體免疫力[36]。

未知的RsaHf231菌屬和Anaerorhabdus_furcosa_group屬是除了SO組外其他三組的優勢菌群，目前在水生生物方向，還未見有關于這兩種菌屬生物學作用研究的相關報道，但在大多數水生動物腸道內都提取到Anaerorhabdus_furcosa_group屬[37]，在不同地區的健康甲殼類動物體內也同樣提取到此菌屬；而未知的RsaHf231菌屬則常見于海螺(Hermetiaillucens)、大西洋鮭(Salmosalar)和小龍蝦(P.clarkii)[26]，在其他物種中的相關報道較少；因此未知的RsaHf231屬與Anaerorhabdus_furcosa_group屬應為健康克氏原螯蝦常見菌屬[38-40]。檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)是SO組與FO組的優勢菌群，沈錦玉等[41]研究表明弗氏檸檬酸桿菌是紅螯螯蝦的致病菌，且毒力很強；肖寧等[42]的實驗確定弗氏檸檬酸桿菌是引發克氏原螯蝦暴發性疾病的病原，目前已有檸檬酸桿菌感染中華鱉(Trionyxsinensis)、棘胸蛙(Quasipaaspinosa)和青魚(Mylopharyngodonpiceus)等引發疾病的報道[43]。本實驗中檸檬酸桿菌屬是SO組的最大優勢菌屬，占比31.31%，說明SO組具有極大的患病風險。雖然檸檬酸桿菌屬在FO組也是優勢菌屬，但是占比只有6.74%。

Candidatus_Bacilloplasma是MO組優勢菌群，已在中華絨螯蟹[44]、紅螯螯蝦[45]、龍蝦[46]和斑節對蝦((P.monodan)[47]等多種甲殼動物腸道中發現，雖然該菌群的作用目前尚未闡明，但是在陳一銘等[28]的研究中其在甲殼動物腸道中的豐度在白斑綜合癥病毒感染后急劇下降，推測其對甲殼動物的健康有著重要的作用。在GONG等[48]的研究中Candidatus_Bacilloplasma也是健康克氏原螯蝦的優勢菌群且其豐度與患病蝦存在極顯著差異。