范士琦,郭 慧,張 倩,王 果,杜春瑩,薛 洋,李 云,2
(1.西南大學水產學院,漁業與水產生物技術實驗室,重慶 400715;2.淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室,重慶市水產科學重點實驗室,重慶 400715;3.重慶市水產技術推廣總站,重慶 400200)
活體水生動物被宰殺后,機體內各組織會發生一系列的物理、化學和生理反應致使其變質,機體死后變化主要分為初期生化反應、肌肉僵直、解僵、自溶和肌肉腐敗變質4個階段。此外,因魚類含有高比例的多不飽和脂肪酸,脂肪極易被氧化[1],脂肪氧化后會產生影響食用的異味,對鮐(Pneumatophorusjaponicas)、鰻(Anguillajaponica)以及鯡(Clupeaharengus)等的貨架期均有影響[2-4]。冰藏是利用泡沫箱為貯運容器,以冰袋或冰瓶作為降溫介質,將水產品放置于降溫介質中進行貯藏[5]。冰藏作為降低環境中微生物的繁殖速度來抑制產品的腐敗從而延長貨架期、保存漁獲物的一種技術手段,常用于短期貯藏、保鮮小型魚類[6]。隨著物聯網和預制菜產業的發展,越來越多的消費者選擇冷鏈物流配送方式購買居家水產品食材,對冰藏的需求將越來越廣泛。
黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)俗名黃臘丁,是我國主要淡水特色養殖魚類,2020年全國產量56.5萬噸,其肉質好,營養價值高,無鱗片,無肌間刺,深受消費者喜愛。但是黃顙魚背鰭、胸鰭具硬棘,在捕撈、運輸、暫養過程中極易互相擁擠戳傷導致感染和死亡,造成經濟損失,是黃顙魚活魚運輸鏈的短板,運輸應激也對黃顙魚肌肉物性特征產生顯著的影響,為解決這一問題,開發預制菜品,對黃顙魚宰殺后冰藏保鮮再進行銷售是較好的解決途徑。目前對黃顙魚的研究主要集中在遺傳育種、養殖培育、病理疾病、營養生長、生理生化等方面[7-10],對黃顙魚的低溫保鮮研究較少。本研究對宰殺后黃顙魚在不同環境溫度下冰藏過程中質構指標、pH、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)、高鐵肌紅蛋白(MetMb)、揮發性鹽基氮(TVB-N)、營養成分以及微生物菌群的變化進行了測定,綜合屠宰后黃顙魚冰藏過程品質參數變化明確了不同溫度下的保鮮時段,旨在為黃顙魚冰藏保鮮提供參考,為水產品保鮮、加工和質量安全提供技術支持。
鮮活黃顙魚購自重慶市北碚區歇馬市場,平均體長(16.14±2.18)cm,平均體質量(89.26±13.54)g,麻醉處理并宰殺后,去除鰓和內臟再次計重。選用三個同規格的泡沫保溫箱(40 cm×20 cm×19 cm,泡沫厚度為2.5 cm),在泡沫箱內各放入10個于-20 ℃冰箱提前冷凍48 h的生物冰袋(均重267 g),隨后將屠宰后的黃顙魚每組按約1 kg總重放入保溫箱,并在保溫箱內放入溫度記錄儀,設置每3 min自動記錄一次箱內溫度,最后密封。
選取33、27、15 ℃作為實驗環境溫度,分別將三個保溫箱放置在15、27、33 ℃溫度下進行12 h的冰藏實驗,并在對應時間點取黃顙魚側線以上、背鰭基部至臀鰭基部區域的白肌,PBS清洗后用濾紙擦干后進行指標的測定。
1.2.1 pH測定
參考GB/T 5009.45-2003[11],使用pH計檢測,每次測定之前,pH計使用標準緩沖液校正。
1.2.2 硫代巴比妥酸(TBA)測定
取1 g左右肌肉加入20%的三氯乙酸(TCA)溶液15 mL,用高速分散器以8 000 r/min轉速勻質30 s后靜置1 h,之后在4 ℃下4 000 r/min冷凍離心30 min,定性濾紙過濾未完全離心沉淀的樣品。吸取5 mL濾液,加入5 mL濃度為0.02 mol/L的硫代巴比妥水溶液,搖勻后沸水浴20 min,后用流動水冷卻5 min,在532 nm測吸光度A。按下列公式計算TBA值:
1.2.3 高鐵肌紅蛋白(MetMb)測定
取1 g魚肉置于50 mL離心管中,加入15 mL 40 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.8),使用高速分散器以8 000 r/min轉速均質2 min,在4 ℃下4 000 r/min離心20 min,未完全離心沉淀的樣品用定性濾紙過濾;取其上清液,分別在波長525、545、565、572 nm處測定吸光值(A525 nm、A545 nm、A565 nm、A572 nm)。按下列公式計算高鐵肌紅蛋白值:
高鐵肌紅蛋白=(-2.541R1+0.777R2+0.800 0R3+1.098)×100%
式中:R1=A572 nm/A525 nm,R2=A565 nm/A525 nm,R3=A545 nm/A525 nm
1.2.4 揮發性鹽基氮(TVB-N)測定
參照GB 5009.228-2016[12],根據半微量凱氏定氮原理利用自動凱氏定氮儀進行測定。
1.2.5 質構特性測定
物性質構指標包括硬度、彈性、膠黏性、咀嚼性、凝聚性、回復性,選取魚體側線以上靠近頭部的背部白肌,切成1 cm×1 cm× 0.5 cm的肌肉塊,使用TA.XT.plus型物性測試儀的平底柱形探頭P/36 R,對試樣進行2次壓縮TPA測試。每尾魚取2個平行肌肉樣品,分別在0、2、4、6、12 h進行測定,去除異常值后求平均值。
營養成分測定指標包括肌肉水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的測定。采用GB/T 6435-86[13](直接干燥法)進行肌肉水分的測定;按照GB/T 5009.5-2003[14](凱氏定氮法)測定粗蛋白含量;根據GB 5009.6-2016[15](乙醚索氏抽提法)測定粗脂肪含量;采用GB/T 6438-2007[16](高溫灰化法)測定粗灰分。
對不同溫度下冰藏保鮮0、2、4、6 h后的黃顙魚肌肉進行微生物菌群分析。用試劑盒(OMEGA,美國)從各組肌肉樣本中提取微生物菌群分析測序所需DNA。采用通用引物(表1)[17],對DNA樣本中16S RNA基因V3~V4區域進行PCR擴增,并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。將鑒定后的PCR產物進行qRT-PCR定量檢測后構建測序文庫,并在上海美吉生物醫藥科技有限公司16S~338F~806R Miseq平臺進行高通量測序。對獲得的測序數據以每個樣品中可操作的分類單元(OTU)作為分類和計算的依據進行分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence information
樣本的Alpha多樣性通過Chao、Ace、Coverage、辛普森指數、香濃指數表示,其中Chao、Ace用來評估樣本物種豐度,而辛普森指數和香濃指數用來評估樣本多樣性。
試驗數據使用EXCEL 2016進行常規計算,使用SPSS 22.0、Origin 2019進行多重比較分析。所有數據均以平均值±標準誤差(mean±SD)表示。設置差異顯著性水平P=0.05,當P<0.05時表示顯著性差異。
對獲得的微生物多樣性的測定數據,用MOTHUR軟件結合EXCEL和SPSS軟件進行數據統計和分析。數據的統計分析以每個樣品中可操作的分類單元(operational taxonomic unit,OTU)作為分類和計算的依據。
由圖1可知,黃顙魚初始溫度為23 ℃,33、27、15 ℃溫度組冰藏2 h后保鮮溫度迅速下降,分別達到(8.62±0.43)、(6.25±0.31)、(-0.63±0.03)℃,此后27 ℃組和15 ℃組的保鮮溫度在冰藏12 h后始終未超過10 ℃。而33 ℃組保鮮溫度隨著冰藏時間的延長呈上升趨勢,且在冰藏10 h后溫度超過10 ℃,并在冰藏12 h后溫度達到(17.15±0.86)℃。

圖1 不同溫度(15、27、33 ℃)下冰藏黃顙魚12 h的保鮮溫度變化Fig.1 Changes of preservation temperature of P.fulvidraco stored on ice at different temperatures(15,27 and 33 ℃)for 12 h
黃顙魚各組pH均值在6.830~6.986內波動,波動范圍小于0.2(圖2a)。本實驗中不同溫度下冰藏12 h后黃顙魚肌肉的TBA變化趨勢如圖2b所示,TBA值隨冰藏時間延長而呈上升趨勢,TBA含量越高,肌肉氧化程度就越高;同一冰藏時間下,溫度越高,TBA含量越高。且在冰藏6 h后,33 ℃組和27 ℃組TBA值增幅變快,而15 ℃組始終處于穩定增長趨勢。根據本實驗結果(圖2c),33、27和15 ℃組的黃顙魚肌肉MetMb在冰藏12 h后均顯著上升,但各溫度組MetMb含量最大值都未超過50%(分別為42.27%、40.42%和39.02%),其中33 ℃組在冰藏4 h后MetMb含量呈上升趨勢,27 ℃組和15 ℃組在冰藏6 h后才出現較大的上升幅度。由圖2d可知,本實驗中33、27、15 ℃組TVB-N含量均隨時間的延長呈上升趨勢,且各組TVB-N含量最高各為19.09、18.19和15.48 mg/100 g。

圖2 不同溫度(15、27、33 ℃)下冰藏黃顙魚12 h肌肉的pH(a)、TBA(b)、MetMb(c)、TVB-N(d)變化Fig.2 Changes of muscle pH(a),TBA(b),MetMb(c),and TVB-N(d)in P.fulvidraco stored on ice at different temperatures(15,27,33 ℃)for 12 h
本實驗中的肌肉硬度(圖3a)、彈性(圖3b)、膠黏性(圖3c)、咀嚼性(圖3d)、凝聚性(圖3e)、回復性(圖3f)均隨冰藏時間延長而下降,且同一時間下,冰藏12 h后33 ℃組各質構指標值都低于15 ℃組,冰藏4 h后,33 ℃組回復性(0.226±0.01)低于27 ℃組(0.264±0.01)和15 ℃組(0.271±0.01),具體見圖3。

圖3 不同溫度(15、27、33 ℃)下冰藏黃顙魚12 h的物性硬度(a)、彈性(b)、膠黏性(c)、咀嚼性(d)、凝聚性(e)、回復性(f)變化Fig.3 Changes of physical hardness(a),springiness(b),viscosity(c),mastication(d),cohesion(e),and recovery(f)of P.fulvidraco stored on ice at different temperatures(15,27 and 33 ℃)for 12 h
由圖4所示,與冰藏前相比,各溫度組粗脂肪(圖4a)、粗灰分(圖4b)和水分(圖4c)含量在冰藏期間均隨時間延長有所降低,粗蛋白含量(圖4d)隨時間延長先降低后升高,各溫度組肌肉中粗蛋白含量在冰藏12 h后[(79.78±3.99)%、(77.74±3.98)%、(79.51±3.99)%]均高于冰藏前[(76.92±3.85%)]。

圖4 不同溫度(15、27、33 ℃)下冰藏黃顙魚12 h肌肉基本營養成分的含量變化Fig.4 Changes in the essential nutrients content in dry muscle samples of P.fulvidraco stored on ice at >different temperatures(15,27 and 33 ℃)for 12 h
本研究對微生物的Alpha多樣性分析結果(表2)表明,各組肌肉樣本的測序覆蓋率均大于99.83%,覆蓋率高,表明本研究樣品中幾乎所有的微生物種類都被檢測到了。對數據進行拼接和篩選處理后,每個樣品選取最小序列數計算黃顙魚肌肉中細菌群落多樣性和豐度,并以97%相似水平為標準劃分OTU,得出各處理組的OTU值隨冰藏時間的延長先下降后上升。對微生物的Alpha多樣性分析結果(表2)表明,不同溫度處理組的黃顙魚肌肉在冰藏4 h內,菌群豐富指數(Ace和Chao)均隨冰藏時間的延長而下降,27 ℃組黃顙魚在冰藏6 h后Ace和Chao指數顯著下降,33、15 ℃組黃顙魚冰藏6 h后Ace和Chao豐富指數均上升,但差異不顯著。由表2可知,在同一冰藏溫度下,與冰藏前初始值相比較,冰藏6 h后33、27 ℃組黃顙魚肌肉香濃指數均有所下降,其中27 ℃組香濃指數下降顯著,并顯著低于33、15 ℃組;與香濃指數的變化趨勢相反,33、27 ℃組辛普森指數較初始值上升,顯著高于33、15 ℃組。從不同溫度組下冰藏黃顙魚肌肉的微生物物種組成(圖5)來看,黃顙魚肌肉中包含不動桿菌屬、假單胞菌屬等多種嗜冷菌(圖5)。33 ℃組肌肉不動桿菌屬豐度隨冰藏時間的延長而降低,27 ℃組、15 ℃組黃顙魚肌肉不動桿菌屬豐度在冰藏時上升。與冰藏處理前黃顙魚肌肉中微生物種類相比,33、27 ℃組的肌肉微生物種類均隨時間延長而下降,低于15 ℃組。

圖5 不同溫度(33、27、15 ℃)下冰藏黃顙魚0、2、4、6 h各樣品的微生物物種組成圖Fig.5 The microoganism species composition of P. fulvidraco stored on ice at different temperatures(33,27 and 15 ℃)for 0,2,4 and 6 h T、33、27和15 ℃分別代表對照組、33、27和15 ℃溫度處理組;0、2、4、6則表示0、2、4、6 h

表2 不同溫度(15、27、33 ℃)下冰藏黃顙魚0、2、4、6 h微生物Alpha多樣性指數Tab.2 Microoganism alpha diversity index of P.fulvidraco stored on ice at different temperatures(15,27,33 ℃)for 0,2,4 and 6 h
本研究中,雖然冰藏過程中各組溫度隨著時間延長而上升,但保鮮溫度始終低于初始溫度值,這與沈月新等[18]對淡水魚在不同環境溫度下魚體溫度變化的研究結果一致;環境溫度越高,保鮮溫度變化幅度越大,這也與王倩等[19]的研究結果一致。本實驗中,環境溫度為33 ℃組在冰藏后期溫度迅速上升,表明冰袋開始融化,導致保鮮溫度迅速升高,這將會對黃顙魚品質產生不利影響。
3.2.1 pH的變化
大多魚類的肉質是呈酸性的。魚體肌肉pH在冷藏保鮮期間會因脂肪氧化及微生物作用發生變化,其值變化可評定水產品品質和新鮮度[20],pH的變化≤0.1個單位時表明魚肉品質高,當其變化≥0.2個單位時表明魚肉開始由腐爛到變質[21]。本研究黃顙魚各組pH均值波動范圍小于0.2,表明冰藏期間未發生酸敗現象。冷藏前2 h,由于魚體處在僵直期,內源性酶及魚肉表面分解多種含氮化合物,造成許多堿性物質生成,導致pH升高,史策等[22]在研究鰱魚肉冷藏過程中理化性質的變化中也得出此結論。隨著冰藏時間的延長,肌肉pH經過2 h后開始下降,下降原因可能是在宰殺后,由于肌肉能量代謝使糖原和三磷酸腺苷分解產生了乳酸和磷酸導致pH降低,這與ZHANG等[23-24]對鯉上的研究結果一致。pH變化容易受魚體生長環境、包裝形式等因素影響。由于本實驗中處理時間稍短,所以pH值雖有下降現象,但總體變化不大,因此pH不能作為判定肌肉腐敗的主要標志,需要與其他化學指標結合分析[20]。
3.2.2 硫代巴比妥酸的變化
TBA可以與脂類食品中不飽和脂肪酸氧化降解的產物丙二醛(MDA)反應生成MDA-TBA復合物,因此TBA值已成為評價肉類和水產品脂肪氧化程度的重要指標[25]。脂肪氧化和水解過程中反應生成的低級醛、酮類物質會使食品的滋味變差、肌肉出現變色、酸敗等現象,因此水產品中脂肪水解和氧化是影響水產品凍藏期間酸敗和品質變化的重要因素[26],本實驗中同一冰藏時間下,溫度越低的組,TBA含量越低,肌肉氧化程度也越慢,表明越低的溫度下冰藏越有助于肌肉高品質的維持。且在冰藏6 h后各組TBA值的變化也說明低溫環境會抑制脂肪氧化,而肌肉脂肪酸在氧化酸敗前通常有一個潛伏階段,隨后肉質酸敗的發生是一個躍變,這也是冰藏前期TBA值沒有顯著增長的主要原因[27]。
3.2.3 高鐵肌紅蛋白的變化
水產品貯藏期間的肉色變化主要是由肌紅蛋白含量決定,肌紅蛋白主要有還原肌紅蛋白(Mb)、氧合肌紅蛋白(MbO2)、高鐵肌紅蛋白(MetMb)這三種形式。有研究[28-29]表明,MetMb含量在20%以下呈鮮紅色、30%呈紅色、50%呈褐紅色、70%以上呈褐色,因此高鐵肌紅蛋白的含量可作為評判肉新鮮程度的另一標準,本實驗結果中各溫度組MetMb含量最大值都未超過50%。本實驗中,不同溫度組MetMb含量在冰藏后上升時間不同,溫度越低的組MetMb含量上升時間越緩慢,是由于黃顙魚肌肉中含有豐富的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)多不飽和脂肪酸,在保鮮過程中氧化、水解成大量的低級醛酮類,使MetMb含量上升,肉色發生變化,但溫度越低,氧化作用越弱,這也說明較低溫度下冰藏有利于肌肉高品質的保持,楊金生等[30]在對金槍魚肉色在不同凍藏溫度下變化的研究中也得出類似結論。
3.2.4 揮發性鹽基氮的變化
水產品在貯藏過程中,肌肉會在內源酶和微生物的作用下產生氮、氨及胺類等具有強裂臭味的堿性含氮物質,統稱為TVB-N,其含量越高,臭味愈加濃烈,腐敗程度越高[31],因此TVB-N常被作為判斷水產品腐敗程度的主要指標。根據國家標準GB 2733-2015《鮮、凍動物性水產品衛生標準》規定,淡水魚蝦產品TVB-N含量上限為20 mg/100 g,且當TVB-N含量低于15 mg/100 g時在一級鮮度標準內;當TVB-N的含量大于15 mg/100 g時,水產品的新鮮等級為二級鮮度標準。本實驗中33、27、15 ℃組TVB-N含量均未超過國家規定的TVB-N含量上限標準,且15 ℃組在冰藏12 h后TVB-N含量始終處于一級鮮度標準,這也說明較低的溫度可以更好地降低黃顙魚腐敗菌數量和內源性酶活性,減緩蛋白質產生堿性含氮物質的速率,從而抑制了TVB-N含量的增加,這與申松等[32]研究的長豐鰱魚片在冷藏和微凍條件下的TVB-N變化規律相似。
3.2.5 質構指標的變化
質構特性是評價魚類肉質的重要指標,很多外在因素如宰殺過程、后期貯藏加工等處理、魚類生物學特性及肌肉部位等都會影響魚肉質構的變化[33-35]。本實驗中,冰藏4 h后33 ℃組黃顙魚肌肉彈性有明顯降低趨勢,原因可能是微生物作用、蛋白酶水解引起的結締組織結構受到破壞;組織結構受到破壞的魚肉逐漸失去組織完整性,導致質構指標均降低,這與楊金生[36]研究發現的金槍魚(Thunnusalbacares)肌肉的彈性、硬度、內聚性隨著凍藏時間的延長而下降的結果一致。陳依萍等[37]的研究也表明,4 ℃冷藏和微凍貯藏鱘魚肉隨著貯藏時間的延長,硬度、彈性也呈現不同程度的降低趨勢。同一時間下,冰藏12 h后33 ℃組各質構指標值都顯著低于15 ℃組(P<0.05),這也表明溫度越低,越有利于減緩品質的衰敗。
食物的營養組成是影響魚類營養成分的重要因素之一,尤其是水生經濟養殖種類[38]。本實驗中各溫度組水分含量降低說明隨著冰藏時間延長,黃顙魚肌肉水分正不斷流失,這與倪康達等[5]的研究結果一致。而33 ℃組粗脂肪和粗灰分含量在冰藏4 h時達到最低值,27 ℃組和15 ℃組在保鮮結束后達到最低,表明低溫減緩了脂肪的分解和肌肉中的礦物質流失,有利于維持肌肉的品質。在冰藏12 h后,33 ℃組肌肉水分含量稍高于冰藏前,這可能是隨著冰藏時間延長,保溫箱內的冰袋逐漸融化,環境溫度逐漸升高,導致環境中水分含量高,導致水分含量上升。在本研究中,各溫度組肌肉中粗蛋白含量均高于冰藏前,同樣高于馬玲巧等[39]報道的1齡黃顙魚肌肉干樣中粗蛋白質量分數(71.67%)。在岷縣高原鰍(Triplophysaminxianensis)和紅尾副鰍(Paracobitisvariegatus)的營養成分分析中[40],粗蛋白含量較高,粗脂肪含量較低,其營養結構對人體有益,這也與本實驗結果一致。
影響魚類腐敗最主要的因素是微生物活動,微生物能利用魚肉中的營養物進行繁殖,引起肌肉腐敗變質,進而影響產品品質。Chao指數、Ace指數都是由Chao提出的,實際運用中常通過計算OTU數值用于生態學中反映物種總數的算法;辛普森指數與香濃指數都用于估算樣本中微生物多樣性指數,兩者類似,在生態學中常于反映群落的生物多樣性;Coverage覆蓋率范圍為99.83%~99.93%,覆蓋率高,樣本中序列被測出的概率也越高,測序結果可反映不同環境溫度下冰藏黃顙魚肌肉的微生物多樣性情況,印證了本實驗中樣品被測數據的高度真實性。
本實驗中,各處理組的OTU值變化表明部分嗜冷菌適應了環境低溫;33、27 ℃組Chao指數、Ace指數和香濃指數在冰藏前最高,辛普森指數最低,表明33、27 ℃組在此時物種豐富度最高,可能因為冰藏前魚肉與微生物交互感染,導致微生物數量增加[41],15 ℃組在冰藏6 h后物種豐富度最高,可能由于低溫促進嗜冷菌繁殖,導致微生物數量增多。從微生物物種組成(圖5)來看,33 ℃組肌肉不動桿菌屬豐度隨冰藏時間的延長而降低,而27 ℃組、15 ℃組黃顙魚肌肉不動桿菌屬豐度在冰藏時上升,這可能是由于微生物菌群間存在競爭和抑制作用,低溫促進了優勢嗜冷菌種迅速繁殖并在競爭中占據主導地位,致使其豐度逐漸上升,這也與Alpha多樣性指數的分析結果一致。冰藏6 h后,15 ℃組肌肉菌落中不動桿菌屬(Acinetobacter)等嗜冷菌占多數,這與張皖君[42]和SALAZAR等[43]的研究結果一致。與冰藏處理前黃顙魚肌肉中微生物種類相比,33、27 ℃組的肌肉微生物種類均隨時間延長而下降,且15 ℃組中黃顙魚肌肉的微生物總物種數遠高于其余兩組,物種多樣性變化也更為復雜,這可能由于黃顙魚肌肉中的細菌多數為嗜冷菌,15 ℃組黃顙魚的保鮮溫度為-0.66~1.08 ℃,溫度較低,從而導致微生物大量繁殖,此外與樣品本身自帶的微生物種類數量也有一定關系。由表中數據可知,溫度的降低導致了部分非嗜冷或非優勢微生物菌種的緩慢增長甚至死亡,在一定程度上降低了微生物大量繁殖的風險,有利于減緩肌肉的腐敗變質,延長魚肉的保鮮期[44]。此外,在所有樣本中均未檢測到沙門氏菌和單核增生李斯特菌等有害病原體。
本實驗結果表明環境溫度33 ℃ 冰藏保鮮條件下,黃顙魚肌肉品質與營養成分等指標劣化較快,且冰藏保鮮溫度維持時長也較短,綜合來看,在本實驗條件下,33 ℃溫度下,冰藏保鮮時間最長不超過4 h。綜合各指標的變化,27 ℃溫度下冰藏保鮮時間最長不超過6 h。在12 h的冰藏期間,15 ℃組黃顙魚肌肉保鮮溫度始終低于4 ℃,達到水產品冷藏運輸溫度的標準,肌肉品質達到一級鮮度標準,冰藏保鮮時間可達12 h。