光皮木瓜特征圖譜及3種黃酮類成分含量測定研究 Δ

朱田密 ，陳樹和 ，嚴勁松 ，王新桂 ，段雨晴 ，楊孝義 （.湖北省中醫院/湖北中醫藥大學附屬醫院/湖北省中醫藥研究院藥事部，武漢 43006；.湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065）

光皮木瓜是薔薇科木瓜屬植物木瓜Chaenomeles sinensis（Thouin） Koehne 的成熟或近成熟果實，又名榠楂、木李[1―2]，因果皮干燥后仍光滑，不皺，故稱“光皮木瓜”[1]。其果實清香，味酸、澀，性平，具有和胃舒筋、祛風除濕、消痰止咳之功效[2]，可藥食兩用，易與皺皮木瓜[薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠C.speciosa（Sweet） Nakai 的果實]混淆[3]。光皮木瓜含有豐富的黃酮類、有機酸類、揮發油、萜類、生物酶以及維生素C、粗纖維等成分，具有抗氧化、抗菌消炎、抗過敏以及保護神經等多種活性[4―6]。光皮木瓜在我國有著悠久的藥用史和栽培史，其藥品標準已被湖南、湖北、陜西等地的中藥材質量標準或炮制規范收載。關于光皮木瓜的質量控制，目前僅少數省份的質量標準規定了總黃酮、總有機酸的含量。近年來，雖也有光皮木瓜中齊墩果酸、熊果酸含量測定的文獻報道和指紋圖譜研究，但未指認化學成分，或僅指認圖譜中的1～2種成分[7―9]。筆者前期經薄層色譜已鑒別出光皮木瓜中含有綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷，并且發現光皮木瓜中含有的黃酮類成分比皺皮木瓜多[10]。為此，本文采用高效液相色譜（HPLC）法建立光皮木瓜的特征圖譜及3種黃酮類成分（蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷）的含量測定方法，以期更全面地控制光皮木瓜質量。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Waters e2695型HPLC儀（美國Waters 公司）、ES 225SM-DR 型電子天平（瑞士Precisa 公司）、KQ-500VDE 型雙頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）、FW177型高速萬能粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司）、UPT-Ⅱ-10T型超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

綠原酸對照品（批號110753-202018，純度96.1%）、蘆丁對照品（批號100080-202012，純度91.6%）、金絲桃苷對照品（批號111521-201809，純度94.9%）、槲皮苷對照品（純度111538-202007，純度93.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

光皮木瓜藥材、皺皮木瓜藥材均由湖北中醫藥大學藥學院陳科力教授鑒定，分別為薔薇科木瓜屬植物木瓜C.sinensis（Thouin） Koehne的干燥果實，薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠C.speciosa（Sweet） Nakai 的干燥果實。樣品與植物標本保存于湖北省中醫藥研究院，具體來源信息見表1。

表1 光皮木瓜和皺皮木瓜樣品的來源信息

2 方法與結果

2.1 HPLC特征圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

以Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～5 min，10%A→20%A；5～28 min，20%A→30%A；28～32 min，30%A→90%A；32～36 min，90%A；36～44 min，90%A→10%A）；檢測波長為330 nm，輔以全波長掃描210～400 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備

取樣品藥材粉末（過3 號篩）約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率400 W，頻率45 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備

稱取綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷對照品8.02、9.28、8.70、9.26 mg，精密稱定，分別置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，配成質量濃度分別為308.29、340.02、330.25、346.32 μg/mL的單一對照品溶液。分別精密吸取以上4種單一對照品溶液1.0、2.0、0.2、1.3 mL，置于同一25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，再精密吸取2 mL，置于5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配成綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷質量濃度分別為4.93、10.88、1.06、7.20 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗

取編號為S2 的光皮木瓜藥材粉末，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定6次。以蘆丁為參照峰，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.33%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于2.91%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗

取編號為S2 的光皮木瓜藥材粉末，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、6、12、18 h時按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以蘆丁為參照峰，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD 均小于0.52%（n＝5），相對峰面積的RSD均小于3.52%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置18 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗

取編號為S2 的光皮木瓜藥材粉末，按照“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，再按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以蘆丁為參照峰，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.21%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于3.73%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.7 光皮木瓜特征圖譜的建立與相似度評價

分別精密稱取15 批光皮木瓜藥材（編號S1～S15）粉末1.0 g，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將15批樣品的色譜圖以AIA文件格式導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，以圖譜輪廓較為典型的S1為參照圖譜，采用多點校正法進行匹配，以平均數法生成對照指紋圖譜（R）。樣品疊加圖譜和對照指紋圖譜見圖1。將15批樣品與對照指紋圖譜進行相似度評價，結果顯示，15 批樣品共確定了11 個特征峰，相似度為0.783～0.969，表明15批樣品的相似度良好，化學成分具有一致性。

圖1 15批光皮木瓜藥材的HPLC圖譜和對照指紋圖譜（R）

2.1.8 色譜峰的指認及相對保留時間和相對峰面積的計算

在15批光皮木瓜藥材的共有峰中選擇11個峰作為特征峰，通過與混合對照品溶液圖譜（圖2）中各峰的保留時間及紫外吸收光譜進行比對，共指認出4種成分，分別是1 號峰綠原酸、2 號峰蘆丁、3 號峰金絲桃苷、8 號峰槲皮苷。其中2號峰的峰面積與保留時間適中，故以其為參照峰計算其他特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2。

表2 15批光皮木瓜特征峰相對保留時間和相對峰面積的統計結果

2.1.9 不同地區光皮木瓜藥材的差異分析

使用SPSS 23.0軟件對15批光皮木瓜藥材HPLC特征圖譜的10個特征峰[2號峰～11號峰，由于1號峰綠原酸在同一產地的不同樣品中亦可發生較大變化（如樣品S1 和S2 中，S3 和S4 中），故不納入產地差異分析]的峰面積進行聚類分析，采用組間連接法，以余弦距離為度量標準進行聚類，當余弦距離大于15時，15批樣品聚為2類：S5～S8為一類，其他為一類（圖3）。S5～S8來自湖北省建始縣和房縣，其特征是11號峰顯著，而其他批次樣品中該色譜峰較微弱，其中S3、S12～S15樣品中均未檢出該峰，故特征圖譜在一定程度上反映了產地差異。

圖3 15批光皮木瓜藥材的聚類分析樹狀圖

2.1.10 光皮木瓜與皺皮木瓜的特征圖譜比較

皺皮木瓜是光皮木瓜最常見的混淆品，二者為同科同屬近緣種，故以皺皮木瓜藥材（編號S16～S22）與光皮木瓜藥材進行對比。按照“2.1.2”項下方法制備7批皺皮木瓜的供試品溶液，再按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖4）。對比光皮木瓜對照指紋圖譜（R）與皺皮木瓜的特征圖譜發現，兩種藥材存在明顯差異：7批皺皮木瓜的HPLC 圖譜中也含有綠原酸色譜峰（1 號峰），且極為顯著，遠高于光皮木瓜，同時還含有較弱的2號峰（蘆丁）以及4 號峰；除了S20 樣品檢出微弱的3 號峰（金絲桃苷），其他6批皺皮木瓜中均未檢出3號峰；此外，7批皺皮木瓜均未檢出5～11號峰。

圖4 光皮木瓜對照指紋圖譜（R）和皺皮木瓜藥材的HPLC色譜圖譜

2.2 3種黃酮類成分的含量測定

2.2.1 色譜條件

除檢測波長為350 nm，其余色譜條件同“2.1.1”項。

2.2.2 供試品溶液的制備

供試品溶液的制備方法同“2.1.2”項。

2.2.3 對照品溶液的制備蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷混合對照品溶液的制備方法，除不加綠原酸對照品，其余同“2.1.3”項。

2.2.4 系統適用性試驗

精密吸取“2.2.3”項下混合對照品溶液和“2.2.2”項下供試品溶液各10 μL，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數以蘆丁計不低于10 000。結果見圖5。

圖5 混合對照品溶液和供試品溶液的HPLC圖

2.2.5 線性關系考察

分別精密稱取蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷對照品適量，用甲醇配成蘆丁質量濃度分別為54.40、21.76、5.44、2.18、0.87、0.44 μg/mL，金絲桃苷質量濃度分別為10.57、4.23、1.06、0.42、0.17、0.08 μg/mL，槲皮苷質量濃度分別為27.71、11.08、2.77、1.11、0.44、0.22 μg/mL 的系列混合對照品溶液。按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，以各對照品的質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線。結果見表3。

表3 3種待測成分的回歸方程與線性范圍

2.2.6 定量限與檢測限考察

精密量取“2.2.3”項下混合對照品溶液，用甲醇倍比稀釋后，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限、檢測限。結果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷的定量限分別為0.13、0.08、0.07 μg/mL；檢測限分別為0.04、0.02、0.02 μg/mL。

2.2.7 精密度試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S2），按照“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次。結果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷峰面積的RSD 分別為1.53%、4.21%、2.90%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗

取編號為S2 的光皮木瓜藥材粉末，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、6、12、18 h時按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷峰面積的RSD 分別為2.50%、4.05%、3.67%（n＝5），表明供試品溶液于室溫放置18 h內穩定性良好。

2.2.9 重復性試驗

取編號為S2 的光皮木瓜藥材粉末，按照“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，再按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算含量。結果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷含量的RSD 分別為2.66%、4.46%、4.11%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗

取編號為S2的已知含量的光皮木瓜藥材粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，分別按已知含量的1∶1加入蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷對照品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷的加樣回收率分別為89.85%～94.83%、94.63%～103.94%、94.76%～101.96%，RSD 分別為2.17%、3.46%、2.92%（n＝6）。

2.2.11 樣品含量測定

取15 批光皮木瓜藥材和7 批皺皮木瓜藥材，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算含量，每批樣品測2次。結果顯示，光皮木瓜藥材中蘆丁含量高于皺皮木瓜藥材，且皺皮木瓜藥材中均未檢出金絲桃苷（S20樣品除外）和槲皮苷。結果見表4。

表4 15 批光皮木瓜藥材和7 批皺皮木瓜藥材中3 種黃酮類成分的含量測定結果（μg/g，n＝2）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

綠原酸與黃酮類均是光皮木瓜藥材的特征性成分，特征圖譜的檢測波長選擇330 nm，能夠兼顧顯示這兩類成分。經全波長掃描發現，光皮木瓜藥材中大多數黃酮類成分的最大吸收波長位于350 nm附近，故含量測定選取檢測波長為350 nm，且所受其他色譜峰的干擾最小，能滿足含量測定的要求。

3.2 光皮木瓜特征圖譜差異的影響因素

各特征峰在不同樣品中的相對保留時間一致，但相對峰面積差異較大（表2），可能是由樣品中次生代謝產物表達量的高低不同所致，該現象在中藥材特征圖譜中較為常見。光皮木瓜藥材的特征圖譜除了與產地有一定關系（見“2.1.9”項），還受果實個體差異和批次的影響，例如S1與S2來自同一產地，二者的特征圖譜中前段色譜峰強弱不同，但中段（黃酮類）色譜峰強弱很相似；此外還可能受加工方式的影響，例如筆者對湖北省鄖陽區產的S1、S2鮮果采取了不同的加工方式（S1為鮮果剖開后直接曬干，S2為鮮果剖開后用沸水燙后曬干），結果發現，二者的特征圖譜前段顯示色譜峰強弱有差別。

3.3 光皮木瓜和皺皮木瓜藥材中黃酮類成分含量比較

本文比較了15 批光皮木瓜藥材與7 批皺皮木瓜藥材中黃酮類成分的含量，結果顯示，光皮木瓜藥材中黃酮類成分的種類和含量均較皺皮木瓜藥材多，與季榮進等[11]進行的黃酮理化鑒別結果“皺皮木瓜顯天藍色熒光，光皮木瓜顯鮮黃色熒光”一致，且與筆者前期報道結果一致[10]。

綜上所述，本研究所建立的光皮木瓜的特征圖譜和3種黃酮類成分的含量測定方法可用于光皮木瓜的質量控制及其與皺皮木瓜的鑒別。