甘草甜素對大鼠幽門螺桿菌相關性胃炎的改善作用及機制 Δ

劉譽華 ，劉 蓮 ，汪九重 ，黃 丹 ，周素芳 ，肖歡智 ，安禎祥 （1.貴州中醫藥大學第一臨床醫學院，貴陽 550001；.貴州醫科大學臨床微生物與免疫學教研室，貴陽 550001；.中國中醫科學院廣安門醫院傳染病科，北京 10005；.貴州中醫藥大學第一附屬醫院脾胃病科，貴陽 550001）

幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，HP）是一種革蘭氏陰性桿菌，全球至少有一半人口感染HP[1]。持續性HP感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要致病因素，也被認為是胃腺癌的第一類致癌因素。目前，HP 相關性胃炎的發生機制尚不清楚。西醫治療HP相關性胃炎主要以抗生素為主要手段，但由于抗生素濫用、不規范應用等原因，使得HP耐藥性呈上升趨勢，HP根除率不斷下降。因此，積極探索HP 相關性胃炎的發生機制對開發新的有效治療藥物至關重要。甘草甜素（glycyrrhizin，GL）是甘草根的主要活性成分，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤和抗氧化應激等多種藥理作用，臨床上常用于治療慢性肝炎[2]。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）分別與Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和晚期糖基化終產物受體（receptor of advanced glycation end-products，RAGE）結合，可激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表達，HMGB1/NF-κB信號通路介導的炎癥反應在HP 相關性胃炎中發揮重要作用，抑制該通路可減輕HP誘導的大鼠慢性萎縮性胃炎[3―5]。GL 已被證實可抑制HP 感染[6]，但其是否可通過調節HMGB1/NF-κB 信號通路改善HP 相關性胃炎還不甚清楚。本研究基于HMGB1/NF-κB信號通路探討了GL對大鼠HP 相關性胃炎的改善作用及作用機制，以期為臨床治療HP相關性胃炎提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LD-96A型多功能酶標儀（山東萊恩德智能科技有限公司）、5424 型離心機（艾本德中國有限公司）、CX31 型光學顯微鏡（日本Olympus公司）、Hitachi-600 型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 主要試劑與儀器

GL對照品（貨號MDK-461353，純度99%）購自武漢艾美捷科技有限公司；奧美拉唑原料藥（批號20073922）購自河南天方藥業股份有限公司；膠體果膠鉍（規格50 mg/粒，國藥準字H20083064）購自山西同達藥業有限公司；阿莫西林膠囊（規格0.25 g/粒，國藥準字H31020838）購自上海福達制藥有限公司；克拉霉素片（規格0.25 g/片，國藥準字H20058305）購自浙江震元制藥有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號G1120-100）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（貨號CA1410）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（貨號BC0020）均購自北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號分別為E-EL-H6008、E-ELR0012c、E-EL-R2856c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號3122-100T）購自上海晶風生物科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒（貨號IBIO-C583）購自江西艾博因生物科技有限公司；兔抗一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOS）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗（貨號分別為ab178945、ab19870、ab239882、ab9485、ab6721）均購自英國Abcam公司。

1.3 實驗動物

SPF 級SD 大鼠，雄性，8～10 周齡，體重180～200 g，購自陸軍軍醫大學基礎醫學院實驗動物學教研室，生產許可證號SCXK（渝）2022-0011。所有大鼠適應性喂養1 周，飼養在溫度約22 ℃、相對濕度55%～60%、12 h光暗循環的環境中，正常飲食。該實驗方案通過貴州中醫藥大學動物實驗倫理審查，批件號20220086。

1.4 菌株

HP購自美國ATCC公司，以布氏肉湯培養基配成菌懸液，調整菌液濃度為1×109cfu/mL，備用。

2 方法

2.1 建模、分組與給藥

大鼠適應性喂養1周后，自由飲用2 g/L吲哚美辛溶液30 d破壞胃黏膜屏障，第31天禁食過夜，行13C尿素呼氣試驗，記錄超基準值（delta over baseline，DOB）；然后每只大鼠灌胃1×109cfu/mL的HP菌懸液1.5 mL，每周2次，共5次；末次灌胃后大鼠正常喂養2周，再禁食、禁水12 h，行13C尿素呼氣試驗，以DOB值＞4表示HP相關性胃炎造模成功[7]。將造模成功的大鼠隨機分成模型組、陽性對照組和GL 低、中、高劑量組，每組12 只；另隨機選取12只正常大鼠作為正常對照組。GL低、中、高劑量組大鼠分別灌胃5、20、50 mg/kg GL[8]，陽性對照組大鼠按HP 標準四聯方案分別以3.6、36、180、72 mg/kg 灌胃奧美拉唑、膠體果膠鉍、阿莫西林、克拉霉素[9]，正常對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1 次，連續30 d，給藥結束后行13C尿素呼氣試驗。

2.2 大鼠胃黏膜組織病理變化觀察與評分

末次13C 尿素呼氣試驗結束后處死大鼠，分離大鼠胃黏膜組織，經固定、脫水、包埋、切片、脫蠟和水化后進行HE染色，使用顯微鏡觀察大鼠胃黏膜組織病理變化，并根據胃黏膜慢性炎癥的評分標準進行病理評分[10]。

2.3 大鼠胃黏膜組織細胞形態學觀察

取“2.2”項下大鼠胃黏膜組織，經固定、漂洗、鋨酸固定、梯度脫水、樹脂包埋、切片、鈾鉛雙染色后，使用透射電子顯微鏡觀察大鼠胃黏膜組織細胞形態并拍照。

2.4 大鼠胃黏膜組織中炎癥與氧化應激相關因子水平的檢測

將大鼠胃黏膜組織制成勻漿后，嚴格依據ELISA試劑盒說明書檢測大鼠胃黏膜組織中IL-8、IL-1β、TNF-α水平，依據ROS、MDA檢測試劑盒說明書檢測大鼠胃黏膜組織中ROS、MDA水平。

2.5 大鼠胃黏膜組織中HMGB1、NF-κB mRNA 表達的檢測

取大鼠胃黏膜組織，用Trizol試劑提取總RNA。以RNA 為模板合成cDNA 后，測定反轉錄的cDNA 濃度，適當分裝，于－20 ℃保存。擴增條件：95 ℃預變性60 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共循環40 次。HMGB1 的上游引物為5′-AGATATGGCAAAGGCTGACAAGGC-3′，下游引物為5′-GGGCGGTACTCAGAACAGAACAAG-3′，產物片段為148 bp；NF-κB 的上游引物為5′-TGTGGTGGAGGACTTGCTGAGG-3′，下游引物為5′-AGTGCTGCCTTGCTGTTCTTGAG-3′，產物片段為126 bp；GAPDH的上游引物為5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，下游引物為5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′，產物片段為110 bp。以GAPDH 為內參，按2－ΔΔCt法計算大鼠胃黏膜組織中HMGB1、NF-κB mRNA的相對表達量。

2.6 大鼠胃黏膜組織中iNOS、HMGB1、NF-κB 蛋白表達的檢測

取大鼠胃黏膜組織，提取總蛋白，定量后電泳，轉膜，室溫封閉2 h，再分別加入iNOS（稀釋比例為1∶2 000）、HMGB1（稀釋比例為1∶1 000）、p-NF-κB p65（稀釋比例為1∶2 000）、NF-κB p65（稀釋比例為1∶1 000）、GAPDH（稀釋比例為1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過夜；再加入二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育90 min，曝光，顯影。使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析，以GAPDH為內參，以目標蛋白與內參的灰度值比值評價目標蛋白的相對表達量，再以p-NF-κB p65/NF-κB p65 計算NF-κB p65磷酸化水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 GL對各組大鼠DOB值的影響

建模前，各組大鼠DOB值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。建模后，與正常對照組比較，其他各組大鼠DOB 值均顯著升高（P＜0.05）。藥物干預后，與正常對照組比較，模型組大鼠DOB值顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，GL 低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠DOB值均顯著降低（P＜0.05）；與GL低劑量組比較，GL中、高劑量組大鼠DOB 值均顯著降低（P＜0.05）；與GL中劑量組比較，GL高劑量組大鼠DOB值顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠DOB值比較（±s，n＝12）

表1 各組大鼠DOB值比較（±s，n＝12）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與GL低劑量組比較，P＜0.05；d：與GL中劑量組比較，P＜0.05。

干預后2.48±0.16 45.97±7.23a 37.84±5.62b 28.45±4.57bc 16.35±2.18bcd 14.68±1.57b組別正常對照組模型組GL低劑量組GL中劑量組GL高劑量組陽性對照組建模前0.32±0.06 0.28±0.04 0.35±0.07 0.33±0.05 0.26±0.03 0.30±0.02建模后2.36±0.13 46.53±7.21a 45.62±6.98a 47.12±7.52a 44.98±7.26a 46.28±7.35a

3.2 GL對大鼠胃黏膜組織病理變化的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠胃黏膜變薄，皺襞變淺，腺體數量明顯減少，有水腫、出血、糜爛、炎癥細胞浸潤。與模型組比較，GL 低、中劑量組大鼠胃黏膜增厚，皺襞正常，腺體數量明顯恢復，水腫、出血、糜爛減輕，有少量炎癥細胞浸潤；GL高劑量組和陽性對照組大鼠胃黏膜厚度與腺體數量基本恢復正常，無明顯炎癥細胞浸潤。結果見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理染色圖（HE染色）

正常對照組，模型組，GL低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠胃黏膜組織病理評分分別為（0.24±0.03）、（7.25±0.58）、（5.14±0.46）、（3.48±0.41）、（1.23±0.26）、（1.10±0.18）分。與正常對照組比較，模型組大鼠胃黏膜組織病理評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，GL 低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠胃黏膜組織病理評分均顯著降低（P＜0.05）。

3.3 GL對大鼠胃黏膜細胞形態學的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠胃黏膜上皮細胞結構不完整且數量減少，細胞碎片及空泡增多，細胞固縮明顯；與模型組比較，GL低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠胃黏膜上皮細胞結構逐漸完整且數量增多，損傷細胞較少，空泡減少。結果見圖2。

圖2 各組大鼠胃黏膜細胞形態學變化

3.4 GL對大鼠胃黏膜組織中IL-8、IL-1β、TNF-α水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中IL-8、IL-1β、TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，GL 低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠胃黏膜組織中IL-8、IL-1β、TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.05）。與GL 低劑量組比較，GL 中、高劑量組大鼠胃黏膜組織中IL-8、IL-1β、TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.05）。與GL中劑量組比較，GL 高劑量組大鼠胃黏膜組織中IL-8、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜組織中IL-8、IL-1β、TNF-α 水平比較（±s，n＝12，pg/mL）

表2 各組大鼠胃黏膜組織中IL-8、IL-1β、TNF-α 水平比較（±s，n＝12，pg/mL）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與GL低劑量組比較，P＜0.05；d：與GL中劑量組比較，P＜0.05。

TNF-α 53.29±6.38 295.82±16.21a 234.74±13.48b 152.81±14.07bc 71.54±9.26bcd 68.39±8.76b組別正常對照組模型組GL低劑量組GL中劑量組GL高劑量組陽性對照組IL-8 74.23±8.41 351.78±17.86a 284.62±15.39b 214.09±13.76bc 116.83±11.94bcd 98.75±10.52b IL-1β 104.52±12.14 489.73±25.38a 392.65±23.46b 305.47±19.83bc 163.49±17.98bcd 145.26±14.52b

3.5 GL對大鼠胃黏膜組織中ROS、MDA水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中ROS、MDA水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，GL 低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠胃黏膜組織中ROS、MDA 水平均顯著降低（P＜0.05）。與GL 低劑量組比較，GL中、高劑量組大鼠胃黏膜組織中ROS、MDA水平均顯著降低（P＜0.05）。與GL 中劑量組比較，GL高劑量組大鼠胃黏膜組織中ROS、MDA 水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠胃黏膜組織中ROS、MDA 水平比較（±s，n＝12）

表3 各組大鼠胃黏膜組織中ROS、MDA 水平比較（±s，n＝12）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與GL低劑量組比較，P＜0.05；d：與GL中劑量組比較，P＜0.05。

MDA/（nmol/mL）8.35±1.06 68.46±5.37a 54.81±3.65b 37.53±2.49bc 14.62±1.78bcd 12.64±1.43b組別正常對照組模型組GL低劑量組GL中劑量組GL高劑量組陽性對照組ROS/（μmol/mL）54.72±6.81 283.49±15.43a 216.83±13.26b 160.92±11.75bc 89.75±9.43bcd 75.46±10.28b

3.6 GL 對大鼠胃黏膜組織中HMGB1、NF-κB mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中HMGB1、NF-κB mRNA 相對表達量均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，GL 低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠胃黏膜組織中HMGB1、NF-κB mRNA 相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。與GL低劑量組比較，GL中、高劑量組大鼠胃黏膜組織中HMGB1、NF-κB mRNA 相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。與GL中劑量組比較，GL高劑量組大鼠胃黏膜組織中HMGB1、NF-κB mRNA相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。結果見表4。

表4 各組大鼠胃黏膜組織中HMGB1、NF-κB mRNA表達比較（±s，n＝12）

表4 各組大鼠胃黏膜組織中HMGB1、NF-κB mRNA表達比較（±s，n＝12）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與GL低劑量組比較，P＜0.05；d：與GL中劑量組比較，P＜0.05。

NF-κB mRNA 1.01±0.12 2.45±0.23a 1.92±0.18b 1.58±0.16bc 1.14±0.13bcd 0.87±0.09b組別正常對照組模型組GL低劑量組GL中劑量組GL高劑量組陽性對照組HMGB1 mRNA 1.00±0.10 1.96±0.17a 1.61±0.15b 1.32±0.12bc 0.85±0.09bcd 0.67±0.07b

3.7 GL 對大鼠胃黏膜組織中iNOS 及HMGB1/NF-κB信號通路蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中iNOS、HMGB1 蛋白相對表達量和NF-κB p65 磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，GL低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠胃黏膜組織中iNOS、HMGB1蛋白相對表達量和NF-κB p65 磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。與GL低劑量組比較，GL中、高劑量組大鼠胃黏膜組織中iNOS、HMGB1蛋白相對表達量和NF-κB p65磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。與GL中劑量組比較，GL高劑量組大鼠胃黏膜組織中iNOS、HMGB1蛋白相對表達量和NF-κB p65 磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3和表5。

圖3 各組大鼠胃黏膜組織中iNOS 及HMGB1/NF-κB信號通路蛋白表達的電泳圖

表5 各組大鼠胃黏膜組織中iNOS 及HMGB1/NF-κB信號通路蛋白表達比較（±s，n＝12）

表5 各組大鼠胃黏膜組織中iNOS 及HMGB1/NF-κB信號通路蛋白表達比較（±s，n＝12）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與GL低劑量組比較，P＜0.05；d：與GL中劑量組比較，P＜0.05。

p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.09±0.01 0.89±0.07a 0.67±0.05b 0.36±0.04bc 0.15±0.03bcd 0.12±0.02b組別正常對照組模型組GL低劑量組GL中劑量組GL高劑量組陽性對照組iNOS/GAPDH 0.35±0.04 1.78±0.16a 1.45±0.13b 1.03±0.10bc 0.64±0.07bcd 0.58±0.06b HMGB1/GAPDH 0.27±0.03 1.65±0.14a 1.24±0.11b 0.72±0.07bc 0.41±0.05bcd 0.36±0.04b

4 討論

HP 引起胃黏膜上皮細胞的炎癥和氧化應激反應，可導致胃黏膜慢性損傷，促進HP 相關性胃炎的發生。有研究發現，HP可促進胃黏膜上皮細胞中的ROS產生，并且累積的ROS能上調IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等各種細胞因子的表達，這些炎癥細胞因子又可進一步誘導ROS 形成，而加重HP 感染引起的炎癥和上皮細胞損傷[11]。HP感染后，ROS會損傷胃黏膜細胞并引起膜脂質過氧化，從而導致脂質過氧化的最終產物MDA 積累。此外，iNOS 是一種誘導性炎癥酶，是HP 引起胃炎的重要致病因子[12]。本研究結果發現，與正常對照組比較，模型組大鼠DOB值，胃黏膜組織病理評分，胃黏膜組織中IL-8、IL-1β、TNF-α、MDA、ROS 水平及iNOS 蛋白相對表達量均顯著升高，而GL 可顯著改善上述指標的變化，提示GL 可能通過抑制炎癥和氧化應激反應來減輕HP引起的胃黏膜損傷。

HMGB1 是一種普遍存在的核蛋白，在炎癥刺激下可從細胞核釋放到細胞質甚至細胞外空間，與TLR4 等受體結合，從而激活NF-κB，刺激多種炎癥細胞因子（IL-8、IL-1β、TNF-α、iNOS 等）的釋放，與炎癥性肺損傷、肺炎、敗血癥等炎癥反應介導的細菌性疾病的發生發展密切相關[12]。研究發現，HMGB1 在HP 感染期間高表達，抑制HMGB1/NF-κB信號通路可減輕HP誘導的大鼠慢性萎縮性胃炎[3―5]。HP 感染產生的ROS 也可激活NFκB等炎癥信號傳導。抑制NF-κB信號通路的活化可降低炎癥細胞因子的產生，改善HP 引起的胃損傷[13]。GL是一種天然的三萜類化合物，被認為是HMGB1 的抑制劑，通過抑制HMGB1表達，可緩解脂多糖誘導的肝臟巨噬細胞炎癥及改善HP誘導的人胃癌細胞炎性損傷[6，14]。此外還有研究發現，GL 可通過抑制HMGB1-RAGE/TLR4-NF-κB/蛋白激酶B信號通路，抑制炎癥反應，緩解顳下頜關節骨關節炎的病理變化[8]。本研究結果發現，與正常對照組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中HMGB1、NF-κB mRNA 和HMGB1 蛋白相對表達量，以及NF-κB p65磷酸化水平均顯著升高，而GL可顯著降低上述指標水平，提示GL 可能通過抑制HMGB1/NF-κB 信號通路的激活，抑制炎癥和氧化應激反應，從而減輕HP引起的胃黏膜損傷。

綜上所述，GL 可能通過抑制HMGB1/NF-κB 信號通路的激活，抑制炎癥和氧化應激反應，從而減輕HP引起的胃黏膜損傷。然而本研究尚存在一些不足之處，如僅驗證了GL 對HMGB1/NF-κB 信號通路的影響，未對其他通路、靶點進行研究。后續將進一步驗證GL對HP相關性胃炎癥狀改善作用的具體機制，旨在為HP 相關性胃炎的臨床治療提供依據。