止得咳顆粒在大鼠體內的代謝產物研究 Δ

梁 潔 ，鄭飄雪 陳輝華 黃春燕 ，梁炎麗 陸春蓮 謝晶晶 馬玉明 彭嘉文 趙立春 ，陳日蘭 （1.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 3000；.廣西高校中藥提取純化與質量分析重點實驗室，南寧 3000；3.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心華南分中心，南寧 3000；.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，南寧 3000；.欽州市檢驗檢測中心，廣西 欽州 3000；.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院藥劑科，南寧 30011）

止得咳顆粒是在廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院臨床經驗方的基礎上研制而成的中藥復方制劑，由龍脷葉、射干、桔梗、白前、黃芩、柴胡、青天葵等10味藥材配伍而成，現已獲得藥物臨床試驗批準。相關藥理學研究表明，止得咳顆粒具有止咳、化痰和利咽等功效，常用于急、慢性支氣管炎、肺炎的治療[1]。但目前止得咳顆粒的研究僅限于質量控制、提取工藝和藥效學研究[2―4]，尚未有其體內代謝產物的相關研究。通過研究中藥復方制劑代謝產物，鑒定其被吸收的活性成分，確定該復方制劑的藥效活性成分，是闡明其藥效物質基礎和作用機制的重要環節。但中藥復方成分的復雜性和體內代謝的多樣性，導致其代謝產物的鑒定具有一定難度。超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC-QExactive-MS）技術具有高靈敏度、高選擇性和高分辨率的特點，能在復雜體系中快速識別與定量分析化學成分，現已成為中藥代謝產物鑒定的重要手段?；诖耍狙芯坎捎肬PLC-Q-Exactive-MS技術分析止得咳顆粒的化學成分，并對大鼠給予止得咳顆粒后的血清、尿液和糞便進行檢測，分析其原型成分及可能的代謝產物，以期為闡明該制劑的藥效物質基礎和指導臨床安全用藥提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

Ultimate 3000型超高效液相色譜儀和Q-Exactive高分辨質譜儀均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；XW-80A 型渦旋儀購自上海滬西分析儀器廠有限公司；Milli-Q Gradient A10 型超純水純化系統購自美國Millipore 公司；5415R 型低溫高速離心機購自艾本德中國有限公司；NDK200-2N 型氮吹儀購自杭州米歐儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

止得咳顆粒由廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院自制（批號20210608）；野鳶尾黃素、黃芩素、橙皮苷、黃芩苷、檸檬酸、右旋奎尼酸、柴胡皂苷C、D-（+）-蔗糖、尿苷、L-酪氨酸、蘆薈大黃素、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、漢黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、綠原酸、咖啡酸、異鼠李素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、香葉木素、黃芩新素、喬松素、次野鳶尾黃素、漢黃芩素（純度均大于98%，批號分別為RP211021、RP220627、RP220321、RP220827、RP220527、RP200120、RP200604、RP210204、RP210525、RP200602、RP220614、RP220426、RP210827、RP221114、RP221223、RP210916、RP220610、RP211118、RP200312、RP210105、RP220113、RP210718、RP221129、RP211213、RP221130）對照品均購自成都麥德生科技有限公司；甲醇、乙腈為質譜純，甲酸、甲酸銨為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為雄性清潔級健康SD 大鼠，共24只，體重（220±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK（湘）2019-0001。本文涉及的動物實驗方案經廣西中醫藥大學倫理委員會批準，批準號DW20220726-159。

2 方法

2.1 止得咳顆粒藥液的制備

取止得咳顆粒500 g，研細，加入超純水5 000 mL，攪拌至完全溶解，即得止得咳顆粒藥液，于4 ℃保存備用。

2.2 動物分組及給藥

將24 只雄性SD 大鼠隨機分為空白組（n＝6）、給藥組（n＝18）。實驗前，所有大鼠均于SPF 級屏障環境中適應性喂養4 d，自由攝食、飲水；給藥前禁食12 h（自由飲水），給藥組大鼠按9.45 g/kg（臨床等效劑量）灌胃止得咳顆粒藥液，空白組大鼠灌胃等體積超純水，每天2次，每次灌胃間隔6～8 h，連續3 d。

2.3 生物樣品的收集與處理

末次給藥后1 h，取給藥組大鼠6 只，用戊巴比妥鈉麻醉后行腹主動脈采血，于4 ℃下以3 000 r/min離心20 min，取上清液，得血清樣品。將給藥組剩余的12只大鼠均分后置于2個代謝籠中，其中一個代謝籠用于收集12 h 內尿液，另一個用于收集12 h 內糞便。將收集的尿液以3 500 r/min 離心10 min，取上清液，以氮氣濃縮至2 mL，得尿液樣品；將收集的糞便于50 ℃烘干，碾碎，得糞便樣品。空白組大鼠同法收集血清、尿液及糞便樣品。以上樣品均置于－80 ℃冰箱中保存。

2.4 生物供試品溶液的制備

2.4.1 血清供試品溶液的制備

解凍血清樣品，吸取100 μL，加入乙腈300 μL，渦旋30 s，于－20 ℃下超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）提取20 min，于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min；取上清液300 μL以氮氣吹干，用超純水100 μL復溶，渦旋振蕩1 min，于4 ℃下以13 000 r/min 離心5 min，取全部上清液，即得。

2.4.2 尿液供試品溶液的制備

解凍尿液樣品，渦旋1 min，取500 μL 置于1.5 mL離心管中，于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min；取全部上清液，過0.22 μm水相濾膜，取濾液80 μL，即得。

2.4.3 糞便供試品溶液的制備

稱取糞便樣品10 mg，加入1%甲酸乙腈溶液1 mL，渦旋30 s，于－20 ℃下超聲提取20 min，于4 ℃下以13 000 r/min 離心5 min；取上清液800 μL 以氮氣吹干，用80%乙腈溶液（含1%甲酸）100 μL 復溶，于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min，取全部上清液，即得。

2.5 對照品溶液的制備

分別精密稱取“1.2”項下各對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，混勻，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得適宜質量濃度的單一對照品溶液。

2.6 分析條件

2.6.1 色譜條件

以Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱；正離子模式下流動相為0.1%甲酸溶液（A）和含0.1%甲酸的甲醇溶液（B），負離子模式下流動相為10 mmol/L 甲酸銨溶液（A）和含10 mmol/L 甲酸銨的95%甲醇溶液（B），進行梯度洗脫（0～1 min，90%A；1～13 min，90%A→2%A；13～18 min，2%A；18～18.5 min，2%A→90%A；18.5～20 min，90%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為2 μL。

2.6.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），選擇正、負離子模式分開檢測，一級分辨率為70 000 FWHM，二級分辨率為17 500 FWHM；離子源噴霧電壓分別為3.8、3.2 kV；毛細管溫度為300 ℃；鞘氣流速為40 Arb；霧化器溫度為350 ℃。

2.7 分析方法

取血清供試品溶液、糞便供試品溶液、尿液供試品溶液、止得咳顆粒藥液，按“2.6”項下分析條件進樣。采用MS-DIAL 軟件對實驗數據進行分析處理，將得到的數據結果與MSBank、KEGG數據庫比對，對各個色譜峰進行初步推測，得到化合物的準分子離子峰和二級碎片離子、分子式等信息，結合相關文獻及質譜裂解規律，進一步對化合物進行推測及鑒定。

3 結果

正負離子模式下得到的總離子流圖見圖1、圖2（正負離子模式下空白樣品的總離子流圖略）。通過與止得咳顆粒藥液以及空白組樣品進行對比，并結合對照品相關信息后發現，止得咳顆粒中共鑒定出31個化學成分，包含17個黃酮及其苷類化合物、7個有機酸類化合物、3個皂苷類化合物、4 個其他類化合物（表1）。大鼠的血清、尿液和糞便樣品共鑒定出16 個原型成分和11 個代謝產物。其中，血清樣品中鑒定出8 個原型成分和4 個代謝產物；尿液樣品中鑒定出10個原型成分和7個代謝產物；糞便樣品中鑒定出8 個原型成分和5 個代謝產物（表2）。

表1 止得咳顆粒中化學成分鑒定結果

表2 止得咳顆粒在大鼠血清、糞便、尿液中的主要原型成分和代謝產物

圖1 正離子模式下給藥組樣品及止得咳顆粒藥液的總離子流圖

圖2 負離子模式下給藥組樣品及止得咳顆粒藥液的總離子流圖

3.1 止得咳顆?；瘜W成分及原型成分的鑒定

3.1.1 黃酮及其苷類化合物

黃酮類化合物大部分以游離、與糖結合成苷類等形式存在，其裂解規律主要包括失去中性離子CH3、CO、CO2、H2O，糖苷鍵的斷裂及發生逆狄爾斯-阿爾德裂解反應等[5]。

化合物13 的保留時間為9.448 min，準分子離子峰m/z269.045 4[M－H]－，分子式為C15H10O5。準分子離子峰m/z269.045 4[M－H]－的鄰二羥基結構脫去H2O后生成m/z251.033 0[M－H－H2O]－，同時還失去了CO、CO2、H2O 等小分子，生成碎片離子m/z241.049 3[MH－CO]－、m/z225.054 7[M－H－CO2]－、m/z197.060 6[M－H－CO－CO2]－、m/z195.045 3[M－H－H2O－2CO]－、m/z169.065 1[M－H－2CO－CO2]－。這與文獻報道的黃芩素裂解規律基本一致[5]；此外，化合物13 的保留時間與黃芩素對照品一致，故推測其為黃芩素。

依據上述黃酮類成分的裂解規律，推測化合物2、5、7、10、11、12、14、15、16和17分別為異鼠李素、山柰酚或木犀草素、柚皮素、野鳶尾黃素、鳶尾黃素、香葉木素、黃芩新素、次野鳶尾黃素、松屬素和漢黃芩素。

黃酮類化合物大多數以苷類形式存在于自然界，而糖苷鍵的斷裂是黃酮苷類化合物的主要裂解途徑?；衔?在負離子模式下的保留時間為7.487 min，由一級質譜得到準分子離子峰m/z609.187 4[M－H]－，分子式為C28H34O15。主要碎片離子包括m/z301.069 5[M－HRha－Glc]－、m/z286.047 8[M－H－Rha－Glc－CH3]－、m/z242.056 8[M－H－Rha－Glc－CH3－CO2]－、m/z151.020 0[M－H－Rha－Glc－C9H10O2]－、m/z125.022 5[M－HRha－Glc－C10H8O3]－。這與文獻報道的橙皮苷裂解規律一致[5]，經與對照品比對，確認該化合物為橙皮苷。

依據上述黃酮苷類成分的裂解規律，推測化合物1、3、6、8和9分別為圣草酚-7-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、黃芩苷、漢黃芩苷和芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

3.1.2 有機酸類化合物

有機酸是一類廣泛存在于植物中的具有酸性的有機化合物，其裂解規律通常為失去CO、CO2、H2O等中性碎片。

化合物18 的保留時間為0.945 min，由一級質譜圖得到準分子離子峰m/z191.056 [M－H]－，分子式為C7H12O6。準分子離子峰發生裂解，失去2 個H2O 和CO后得到碎片離子m/z127.038 5[M－H－2H2O－CO]－，或失去3 個H2O 和CO2后得到碎片離子m/z93.033 0[MH－3H2O－CO2]－。結合文獻[5]，經與對照品比對，確認該化合物為右旋奎寧酸。

依據上述有機酸類成分的裂解規律，推測化合物19和24均為阿魏酸/異阿魏酸，化合物20、21、22、23分別為綠原酸、檸檬酸、壬二酸、咖啡酸。

3.1.3 皂苷類化合物

止得咳顆粒中的皂苷類化合物主要來源于柴胡，該類化合物易失去母核上連接的葡萄糖、海藻糖基、CO2、H2O等中性分子。

化合物25 的保留時間為9.987 min，準分子離子峰m/z925.515 4[M－H]－，分子式為C48H78O17。準分子離子峰結合1 個羧基后得到碎片離子m/z970.459 4[M－H+COOH]+；準分子離子峰脫去1個海藻糖基（Fuc，146 Da）后產生碎片離子m/z779.453 2[M－H－Fuc]－，再脫去葡萄糖基（Glu，162 Da）后產生碎片離子m/z617.455 4[MH－Fuc－Glu]－。這與文獻報道柴胡皂苷C的裂解規律一致[6]，經與對照品比對，鑒定該化合物為柴胡皂苷C。其可能的裂解路徑見圖3。

3.1.4 其他類化合物

化合物28 的保留時間為0.975 min，準分子離子峰m/z341.111 3[M－H]－，分子式為C12H22O11。二級質譜中存在由準分子離子峰發生裂解失去C9H16O8后產生的碎片離子m/z89.023 1[M－H－C9H16O8]－，此碎片繼續裂解失去1 個H2O 產生碎片離子m/z71.012 3[M－HC9H16O8－H2O]－。這與文獻報道的蔗糖質譜信息相同[5]，經與對照品比對，確認該化合物為蔗糖。

3.2 止得咳顆粒在大鼠體內的代謝產物鑒定

化合物M1 的保留時間為1.701 min，準分子離子峰m/z303.231 5[M－H]－，分子式為C15H12O7。二級質譜碎片離子有m/z285.043 8、m/z241.047 6、m/z169.061 5。碎片離子與山柰酚或木犀草素的特征碎片一致，預測該化合物的母核可能為山柰酚或木犀草素，且發現準分子離子峰m/z303.231 5[M－H]－比碎片離子m/z285.043 8多1 個H2O，因此推測該化合物可能為山柰酚或木犀草素水合產物[7]。

化合物M2 的保留時間為5.500 min，準分子離子峰m/z367.158 1[M－H]－，分子式為C17H20O9。二級質譜中存在碎片離子m/z193.050 3、m/z191.056 1、m/z173.045 4、m/z134.036 3，其中碎片離子m/z191.056 1、m/z134.036 3為綠原酸特征碎片，且準分子離子峰m/z368.158 1[MH]－比綠原酸m/z353.088 6[M－H]－多1 個CH2，因此預測該化合物可能為綠原酸甲基化產物[8]。

化合物M3 的保留時間為7.415 min，準分子離子峰m/z463.088 2[M+H]+，分子式為C21H18O12。二級質譜碎片離子有m/z287.053 6、m/z270.047 6、m/z169.011 8，與黃芩苷二級碎片離子相同，故預測該化合物的母核為黃芩苷；又因準分子離子峰比母核多1 個OH－，因此推測該化合物可能為黃芩苷羥基化產物[9]。

4 討論

止得咳顆粒的化學成分及代謝的原型成分主要為黃酮及其苷類化合物、有機酸類化合物等。黃酮類成分包括野鳶尾黃素、黃芩素、黃芩苷等，具有抗菌、抗炎等活性[5，10―11]；有機酸類化合物包括綠原酸、咖啡酸等，具有抗炎、止咳、平喘等功效[12―13]。這與本課題組前期研究發現止得咳顆粒具有止咳、抗炎的功效相一致[2]，可為該制劑的藥效物質基礎提供理論依據。代謝產物的研究結果顯示，本研究檢測到黃芩苷原型及3個可能的代謝產物，因此筆者推斷大鼠在給予止得咳顆粒后，黃芩苷在其體內主要發生了甲基化、羥基化和葡萄糖醛酸化，這與相關文獻報道的黃芩苷代謝途徑一致[7]；另外，本研究還檢測到鳶尾黃素原型及3個可能的代謝產物，因此筆者推斷大鼠在給予止得咳顆粒后，鳶尾黃素在其體內主要發生了甲基化、去甲基化和去甲氧基化，這與相關文獻報道的鳶尾黃素代謝途徑一致[14]。本研究還發現，在大鼠的血清、尿液和糞便中能檢測到黃芩苷、黃芩素、次野鳶尾黃素和綠原酸等原型成分，表明止得咳顆粒進入大鼠體內后，并不是完全經過代謝轉化排出體外，還有一部分以原型成分直接排出體外。

從代謝產物的結果可知，鑒定出的成分大部分來源于射干、黃芩等藥材，這可能與龍脷葉和青天葵等藥材的化學成分研究較少，以及文獻資料信息不足等有關。而且，僅從一級質譜、二級質譜和分子式等信息鑒定化學成分，對于具有相似結構的同分異構體無法區分。因此，若想明確化合物的具體結構，還需通過對照品比對，以及結合半制備液相色譜等技術進一步研究止得咳顆粒的化學成分。

綜上所述，本研究通過UPLC-Q-Exactive-MS 技術對止得咳顆粒在大鼠血清、尿液和糞便中的代謝產物進行了分析，共鑒定出16個原型成分及11個代謝產物，主要涉及甲基化、羥基化、葡萄糖醛酸化等代謝途徑。