安羅替尼通過調控NF-κB信號通路對腦膠質瘤細胞惡性表型的影響 Δ

柳 新 ，李青山 ，謝云鵬 ，張圣林 ，董 怡 （.承德醫學院附屬醫院腫瘤科，河北 承德 067000；.承德醫學院附屬醫院神經外科，河北 承德 067000）

腦膠質瘤惡性程度高、發展速度快，為臨床常見顱內惡性腫瘤，具有高復發率和高病死率的特點。由于腦膠質瘤的位置特殊，早期癥狀不明顯，故大多數患者在確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術治療時機，加之手術后復發率和轉移率較高，放化療毒副作用極大，嚴重影響了患者的生存質量[1]。可見，探究有效且安全的藥物對于腦膠質瘤患者的臨床治療十分必要。

安羅替尼作為一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，對多種生長因子受體激酶具有抑制作用，且能通過抑制相關轉移信號通路來發揮抗腫瘤作用[2]。研究指出，腫瘤細胞的遷移、侵襲與上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）關系密切，當EMT 發生后，腫瘤細胞更具侵襲力，可進一步入侵周圍組織、血管及淋巴管等，從而發生遠處轉移[3]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路是經典的信號轉導通路，能參與調控腫瘤細胞遷移、侵襲、EMT、血管生成等過程[4―5]。可見，阻斷NF-κB 信號通路可作為改善腫瘤細胞惡性表型的重要途徑。基于此，本研究擬探討安羅替尼調控NF-κB信號通路對人腦膠質瘤細胞T98G 黏附、遷移、侵襲及EMT樣進程的影響，旨在為該藥治療腦膠質瘤提供理論依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括MCO18AIC 型CO2培養箱（日本SANYO 公司）、Multiskan FC 型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、WMS-1033 型倒置熒光顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司）、FluorChem HD2型凝膠成像系統（美國ProteinSimple公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

安羅替尼對照品（貨號S8726，純度≥98%）購自美國Selleck Chemicals 公司；5-氟尿嘧啶對照品（陽性對照，貨號S17073-5g，純度≥98%）、NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082 對照品（批號J07HS173399，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；NF-κB通路激活劑prostratin 對照品（批號0000112801，純度≥98%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；DMEM-H培養基購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA 裂解液、CCK-8 試劑盒均購自日本Dojindo公司；重組人纖維連接蛋白（recombinant human fibronectin，rFN）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；鼠源NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）、上皮鈣黏著蛋白（E-cadherin）、神經鈣黏著蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG 二抗（批號分別為10021394、10021309、20000374、10010628、10017978、10016772、20000374、20000425）均購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 細胞

人腦膠質瘤細胞T98G（編號338721）購自商城北納創聯生物科技有限公司。

2 方法

2.1 人腦膠質瘤T98G細胞培養

取T98G 細胞，復蘇后接種于DMEM-H 培養基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素）中，于37 ℃、5%CO2條件下培養（培養條件下同），當細胞貼壁至80%～90%時進行傳代，取第3代對數生長期細胞用于后續實驗。

2.2 安羅替尼對T98G細胞惡性表型影響的考察

2.2.1 細胞增殖活力

取對數生長期細胞，以2×105個/mL接種至96孔板中，每孔100 μL。將細胞分為對照組、安羅替尼不同濃度、陽性對照組，每組設置3個復孔。對照組細胞不進行干預；安羅替尼不同濃度組細胞分別用5、10、20 μmol/L的安羅替尼[6]進行干預；陽性對照組細胞用50 mg/L 的5-氟尿嘧啶[7]進行干預；同時，設置不加細胞的調零孔作為空白組。培養24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，孵育2 h后，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，并按下式計算細胞增殖活力：細胞增殖活力＝（OD實驗組－OD空白組）/（OD對照組－OD空白組）。

2.2.2 細胞黏附能力

將20 μg/mL 的rFN（以不含胎牛血清的DMEM-H培養基稀釋）鋪于96 孔板中，風干后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌20 min×3次，備用。取對數生長期細胞，以2×105個/mL接種至6孔板中，每孔50 μL。按“2.2.1”項下方法分組、處理。培養24 h后，收集各組細胞，用胰蛋白酶消化并制成單細胞懸液（1×104個/mL）。取上述單細胞懸液100 μL，接種至上述鋪有rFN 的96 孔板中，于37 ℃培養1 h；以PBS 洗滌3 次，以甲醇固定10 min 后，用結晶紫染液染色15 min；再以PBS洗滌3次，于顯微鏡下觀察細胞黏附情況并記錄黏附細胞（呈紫色）數。

2.2.3 細胞遷移和侵襲能力

取對數生長期細胞，以2×105個/mL 接種至6 孔板中，每孔300 μL。按“2.2.1”項下方法分組、處理。待細胞融合至90%時，用200 μL 移液器槍頭在每孔底部中央劃一直線。分別于培養0、24 h 時用顯微鏡觀察并拍照，記錄對應的劃痕面積（S0h、S24h），并按下式計算細胞遷移率：細胞遷移率＝（S0h－S24h）/S0h×100%。

取對數生長期細胞，以不含胎牛血清的DMEM-H培養基制成單細胞懸液（1×105個/mL），取上述單細胞懸液0.25 mL，置于Transwell小室（需用基質膠處理5 h）上層；取含10%胎牛血清的DMEM-H 培養基0.45 mL，置于Transwell 小室下層。上室細胞按“2.2.1”項下方法分組、處理。培養24 h后，棄去上清液，穿膜細胞用PBS清洗3次，以4%甲醇固定30 min后晾干；用0.1%結晶紫染液染色10 min，用PBS清洗3次，晾干。使用顯微鏡觀察、拍照（每孔隨機選擇5 個不同區域），并使用Image J圖像分析軟件記錄侵襲細胞（呈紫色）數。

2.2.4 細胞EMT相關蛋白的表達情況

取對數生長期細胞，以2×105個/mL 接種至6 孔板中，每孔300 μL。按“2.2.1”項下方法分組、處理。培養24 h 后，收集各組細胞，提取其蛋白后，進行定量、變性處理。取變性蛋白適量，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉膜，封閉2 h；以TBST緩沖液洗膜，加入E-cadherin、N-cadherin、vimentin、FN、β-actin 一抗（稀釋比例分別為1∶2 000、1∶10 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶ 2 000），4 ℃下孵育過夜；以TBST 緩沖液洗膜，加入相應IgG二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫下孵育2 h；以TBST緩沖液洗膜，加入顯影液，使用凝膠成像系統成像并采用Image J 軟件進行分析，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

2.3 安羅替尼對T98G細胞惡性表型影響機制的驗證

2.3.1 細胞增殖活力

取對數生長期細胞，以2×105個/mL接種至96孔板中，每孔100 μL。將細胞分為對照組、安羅替尼組、抑制劑組和激活劑組，每組設置3個復孔。對照組細胞不進行干預；安羅替尼組細胞分別用10 μmol/L 的安羅替尼（濃度參考“2.2”項下各實驗結果設置）進行干預；抑制劑組細胞用10 μmol/L 的安羅替尼+5 μmol/L 的NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082[8]進行干預；激活劑組細胞用10 μmol/L 的安羅替尼+1 μmol/L 的 NF-κB 通路激活劑prostratin[9]進行干預；同時，設置不加細胞的調零孔作為空白組。培養24 h后，按“2.2.1”項下方法檢測各組細胞的增殖活力。

2.3.2 細胞黏附能力

取對數生長期細胞，以2×105個/mL 接種至6 孔板中，每孔50 μL。按“2.3.1”項下方法分組、處理，再按“2.2.2”項下方法檢測各組黏附細胞數。

2.3.3 細胞遷移和侵襲能力

取對數生長期細胞，以2×105個/mL接種至6孔板中，每孔300 μL。按“2.3.1”項下方法分組、處理，再按“2.2.3”項下方法檢測各組細胞遷移率和侵襲細胞數。

2.3.4 細胞EMT及NF-κB通路相關蛋白表達情況

取對數生長期細胞，以2×105個/mL 接種至6 孔板中，每孔300 μL。按“2.3.1”項下方法分組、處理，再按“2.2.4”項下方法檢測各組細胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin、FN、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白（NF-κB p65、p-NF-κB p65的稀釋比例分別為1∶5 000、 1∶2 000）的相對表達量。

2.4 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析。計量資料均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 安羅替尼對T98G細胞惡性表型的影響

3.1.1 細胞增殖活力

與對照組（1.00±0.07）比較，10、20 μmol/L 安羅替尼組和陽性對照組細胞的增殖活力（0.76±0.08、0.53±0.05、0.51±0.03）均顯著降低（P＜0.05）；與陽性對照組（0.51±0.03）比較，5、10 μmol/L安羅替尼組細胞的增殖活力（0.90±0.04、0.76±0.08）均顯著升高（P＜0.05），而20 μmol/L 安羅替尼組細胞的增殖活力（0.53±0.05）則與陽性對照組相當（P＞0.05）。

3.1.2 細胞黏附能力

與對照組（239.67±10.26）比較，5、10、20 μmol/L 安羅替尼組和陽性對照組的黏附細胞數（179.67±15.31、143.67±10.02、96.00±5.29、94.00±4.58）均顯著減少（P＜0.05），且有濃度依賴趨勢；與陽性對照組比較，5、10 μmol/L 安羅替尼組的黏附細胞數均顯著增加（P＜0.05），而20 μmol/L安羅替尼組的黏附細胞數則與陽性對照組相當（P＞0.05）。結果見圖1。

圖1 不同濃度安羅替尼對細胞黏附能力的影響

3.1.3 細胞遷移和侵襲能力

與對照組[細胞遷移率為（43.67±2.08）%、侵襲細胞數為42.67±3.79]比較，5、10、20 μmol/L 安羅替尼組和陽性對照組的細胞遷移率[（35.33±2.08）%、（26.33±2.08）%、（19.00±2.00）%、（18.33±1.53）%]和侵襲細胞數（32.00±2.65、27.67±1.53、15.67±1.53、15.67±2.08）均顯著降低（P＜0.05），且有濃度依賴趨勢；與陽性對照組比較，5、10 μmol/L安羅替尼組的細胞遷移率和侵襲細胞數均顯著升高（P＜0.05），而20 μmol/L安羅替尼組的上述指標則與陽性對照組相當（P＞0.05）。結果見圖2、圖3。

圖2 不同濃度安羅替尼對細胞遷移能力的影響

圖3 不同濃度安羅替尼對細胞侵襲能力的影響

3.1.4 細胞EMT相關蛋白的表達情況

與對照組比較，各藥物組細胞中E-cadherin 蛋白的表達均顯著上調，N-cadherin、vimentin、FN 蛋白的表達均顯著下調（P＜0.05），且有濃度依賴趨勢；與陽性對照組比較，5、10 μmol/L安羅替尼組細胞中E-cadherin蛋白的表達均顯著下調（P＜0.05），N-cadherin、vimentin、FN蛋白的表達均顯著上調（P＜0.05）；而20 μmol/L安羅替尼組的上述蛋白表達則與陽性對照組相當（P＞0.05）。結果見圖4、表1。

表1 不同濃度安羅替尼對細胞EMT 相關蛋白相對表達量的影響（±s，n＝3）

表1 不同濃度安羅替尼對細胞EMT 相關蛋白相對表達量的影響（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與陽性對照組比較，P＜0.05。

組別對照組5 μmol/L安羅替尼組10 μmol/L安羅替尼組20 μmol/L安羅替尼組陽性對照組FN 1.41±0.03 1.11±0.06ab 0.84±0.04ab 0.30±0.02a 0.26±0.02a E-cadherin 0.25±0.02 0.40±0.03ab 0.70±0.03ab 0.95±0.03a 1.00±0.03a N-cadherin 0.95±0.02 0.70±0.01ab 0.40±0.02ab 0.16±0.02a 0.13±0.01a vimentin 2.02±0.06 1.90±0.03ab 0.91±0.05ab 0.20±0.01a 0.15±0.02a

圖4 不同濃度安羅替尼對細胞EMT 相關蛋白表達影響的電泳圖

3.2 安羅替尼對T98G細胞惡性表型影響的機制

3.2.1 細胞增殖活力

與對照組（1.00±0.08）比較，安羅替尼組細胞的增殖活力（0.76±0.07）顯著降低（P＜0.05）；與安羅替尼組比較，抑制劑組細胞的增殖活力（0.48±0.02）顯著降低（P＜0.05），而激活劑組細胞的增殖活力（1.01±0.08）則顯著升高（P＜0.05）。

3.2.2 細胞黏附能力

與對照組（243.00±7.21）比較，安羅替尼組的黏附細胞數（143.67±11.59）顯著降低（P＜0.05）；與安羅替尼組比較，抑制劑組的黏附細胞數（73.67±10.50）顯著降低（P＜0.05），而激活劑組的黏附細胞數（228.67±13.65）則顯著升高（P＜0.05）。結果見圖5。

圖5 機制驗證中各組細胞的黏附能力比較

3.2.3 細胞遷移和侵襲能力

與對照組[細胞遷移率為（43.67±2.08）%、侵襲細胞數為41.33±3.51]比較，安羅替尼組的細胞遷移率[（24.00±1.00）%]和侵襲細胞數（26.67±1.53）均顯著降低（P＜0.05）；與安羅替尼組比較，抑制劑組的細胞遷移率[（15.67±1.15）%]和侵襲細胞數（13.33±2.52）均顯著降低（P＜0.05），而激活劑組的細胞遷移率[（45.33±1.53）%]和侵襲細胞數（40.00±2.65）則顯著升高（P＜0.05）。結果見圖6、圖7。

圖6 機制驗證中各組細胞的遷移能力比較

圖7 機制驗證中各組細胞的侵襲能力比較

3.2.4 細胞EMT和NF-κB通路相關蛋白的表達情況

與對照組比較，安羅替尼組細胞中E-cadherin蛋白的表達顯著上調，N-cadherin、vimentin、FN、p-NF-κB p65蛋白的表達均顯著下調（P＜0.05）；與安羅替尼組比較，抑制劑組細胞中E-cadherin 蛋白的表達顯著上調（P＜0.05），N-cadherin、vimentin、FN、p-NF-κB p65 蛋白的表達均顯著下調，而激活劑組細胞中上述蛋白的變化則相反（P＜0.05）。結果見圖8、表2。

表2 機制驗證中各組細胞中EMT 和NF-κB 通路相關蛋白相對表達量比較（±s，n＝3）

表2 機制驗證中各組細胞中EMT 和NF-κB 通路相關蛋白相對表達量比較（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與10 μmol/L安羅替尼組比較，P＜0.05。

組別對照組安羅替尼組抑制劑組激活劑組E-cadherin 0.40±0.03 0.60±0.02a 0.95±0.02b 0.40±0.03b N-cadherin 1.41±0.04 0.95±0.02a 0.20±0.01b 1.20±0.02b vimentin 2.30±0.11 1.01±0.07a 0.40±0.03b 2.30±0.06b FN 0.95±0.02 0.77±0.08a 0.25±0.03b 1.15±0.03b NF-κB p65 0.96±0.04 0.96±0.04 0.96±0.05 0.95±0.04 p-NF-κB p65 0.36±0.03 0.27±0.03a 0.19±0.01b 0.43±0.02b

圖8 機制驗證中各組細胞中EMT 和NF-κB 通路相關蛋白表達的電泳圖

4 討論

腦膠質瘤屬于臨床常見的具有高死亡率、高發病率特點的中樞神經系統腫瘤。雖然醫學治療水平在不斷提高，但腦膠質瘤病灶很難通過手術徹底清除，患者極易復發，且一旦出現轉移則難以進行有效治療。腦膠質瘤細胞有豐富的新生血管，在其侵襲、轉移過程中，腫瘤細胞可從原發病灶脫離、降解，隨即入侵淋巴管或血管，并經淋巴或血液循環轉移至遠端形成新的病灶，呈現出高度侵襲性[1]，因此探尋有效抑制腦膠質瘤細胞轉移及侵襲的藥物具有重要意義。

作為新型口服酪氨酸酶抑制劑，安羅替尼可通過抑制腫瘤血管形成而發揮抗腫瘤作用，現已獲批用于肺癌、軟組織肉瘤、甲狀腺髓樣癌等多種適應證，并可使晚期或轉移性肝細胞癌、食管鱗癌患者在治療中獲益。研究表明，安羅替尼能抑制肺癌細胞生長和瘤體血管生成，且對人肝內膽管上皮腫瘤細胞HCCC-9810 具有殺傷作用[10]；另有研究指出，安羅替尼聯合替莫唑胺化療可延緩腦膠質瘤患者的疾病進展[11]。本研究結果顯示，10、20 μmol/L 安羅替尼組和陽性對照組細胞的增殖活力均顯著低于對照組，提示其可抑制腦膠質瘤細胞的增殖；同時，20 μmol/L安羅替尼組細胞的增殖活力與陽性對照組比較差異無統計學意義，提示此劑量的安羅替尼對腦膠質瘤細胞增殖活力的抑制作用與50 mg/L的5-氟尿嘧啶相當，與陳彥民等[12]的研究結果基本一致。

腫瘤細胞的遷移、侵襲與EMT關系密切，其可借助EMT樣進程形成有遷移能力的間充質細胞，從而誘導細胞向其他組織和器官轉移[13]。有研究證實，EMT 在腎癌、肺癌、乳腺癌細胞原位侵襲和遠端轉移中發揮了重要作用[14]。作為具有高度侵襲性的惡性腫瘤，腦膠質瘤的發生與細胞間質性改變關系密切[3]。由于EMT 的影響，纖維細胞快速增多，其所含的細胞外基質也不斷增多，從而導致了腦膠質瘤的持續惡化發展[15]。本研究結果顯示，不同濃度安羅替尼組和陽性對照組細胞黏附、遷移、侵襲能力均較對照組顯著增強，且N-cadherin、vimentin、FN 蛋白的表達均較對照組顯著下調，E-cadherin蛋白的表達均較對照組顯著上調；5、10 μmol/L安羅替尼組的上述指標改善程度均不及陽性對照組，而20 μmol/L安羅替尼組與陽性對照組比較差異均無統計學意義，表明20 μmol/L安羅替尼對腦膠質瘤細胞遷移、侵襲的抑制作用與陽性對照藥相當。研究指出，發生EMT 樣進程后，腫瘤細胞的遷移和侵襲能力增強，主要表現為E-cadherin、N-cadherin、vimentin等細胞上皮間質分化標志蛋白表達的顯著變化[16]。本研究結果提示，安羅替尼具有抑制腦膠質瘤細胞EMT樣進程的能力，并可抑制其黏附、遷移和侵襲，與Nan等[17]的研究結果基本一致。

近年研究表明，多種腫瘤的發生發展和NF-κB信號通路的異常激活有關[18]。NF-κB 作為信號通路的中樞，在多種腫瘤細胞EMT 樣進程中發揮了重要作用，且抑制腫瘤細胞EMT 樣進程能夠明顯抑制其侵襲、轉移[18]。為驗證NF-κB 信號通路的作用，本研究在10 μmol/L 安羅替尼的基礎上分別聯用通路抑制劑BAY 11-7082 和激活劑prostratin 進行驗證，結果顯示，與安羅替尼組比較，抑制劑組細胞的增殖活力，黏附、遷移、侵襲能力及N-cadherin、vimentin、FN、p-NF-κB p65 蛋白的相對表達量均顯著降低，E-cadherin蛋白的相對表達量顯著升高，而激活劑組上述指標的變化趨勢則相反。以上結果提示，安羅替尼可通過抑制NF-κB信號通路來抑制細胞的EMT樣進程，進而抑制腦膠質瘤細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲，說明安羅替尼的抗膠質瘤作用與抑制NF-κB信號通路有關。

綜上所述，安羅替尼可抑制人腦膠質瘤T98G 細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲，上述作用可能與抑制NF-κB信號通路進而抑制細胞EMT樣進程有關。但本研究只針對NF-κB信號通路進行了研究，該藥能否通過其他信號通路發揮抗膠質瘤作用尚需進一步探討。