犬靜脈滴注丙氨酰谷氨酰胺注射液的安全性研究

周宇晴，王俊麗，郭凡溪，陳寶昌，武夢蓉，馬瑞霞，王夢云，趙欣雨，李重陽，張馮奕弛，吾買爾江·牙合甫，余祖功

(南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

我國寵物行業處于快速發展階段，寵物養殖量與日俱增。寵物創傷、外科手術，尤其是消化道手術病例繁多，如胃擴張、胃扭轉、消化道異物、梗阻等不僅損傷胃腸道屏障和功能，還須手術治療，術后尤其需要補充腸外營養[1-2]。谷氨酰胺不僅能促進胃腸黏膜上皮成分已糖胺及葡萄糖胺的生化合成，有效逆轉黏膜萎縮和維持胃腸道屏障功能[3]，還可為手術、燒傷、危重癥等應激狀態或其他高分解代謝狀態的患者補充腸外營養[4]；還具有保護胰腺、肝臟等器官的功能[5]。然而，谷氨酰胺的溶解度和水溶液穩定性制約了谷氨酰胺注射給藥的應用。為避免上述問題，將谷氨酰胺和丙氨酸偶聯成丙氨酰谷氨酰胺(alanyl-glutamine，Ala-Gln)二肽，其溶解度能達到568 g/L，水溶液能耐高溫滅菌，穩定性優于谷氨酰胺，經靜脈輸注后能迅速分解為谷氨酰胺和丙氨酸，半衰期僅2.4～3.8 min[6]。因此Ala-Gln注射液通過腸外補充谷氨酰胺，在寵物臨床市場中具有廣闊的應用前景。

盡管Ala-Gln注射液具有多重藥理作用，醫學臨床應用廣泛，但在使用過程中發現有患者出現寒顫、嘔吐、肝損害等不良反應。目前，國內尚未有針對Ala-Gln注射液的靶動物安全性試驗報道，本試驗參考《寵物用藥物對靶動物安全性試驗指導原則》[7]、《畜禽用藥物靶動物安全性試驗指導原則》[8]的要求，考察犬靜脈滴注Ala-Gln注射液的安全性，為Ala-Gln注射液未來應用于寵物臨床提供安全性數據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

Ala-Gln注射液，規格：10 mL∶2.0 g(批號：20220201)，由南京農業大學實驗室研發，于河北遠征藥業有限公司中試生產。0.9%氯化鈉注射液(批號：220711A01，210305A02，221102A01)由黑龍江齊泰動物保健品有限公司提供。

1.2 試驗動物及飼養管理

24只健康比格犬(1～2歲)，雌雄各半，體重7～12 kg，其中12只(6只公犬，6只母犬)購自南京柴門生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK(蘇)2021-0008；其余12只(6只公犬，6只母犬)購自江蘇亞東實驗動物研究院有限公司，生產許可證號：SCXK(蘇)2016-0009。犬飼養于南京農業大學動物醫學院實驗動物中心，單籠飼養，試驗期間每天定時定量飼喂不添加任何藥物的試驗犬維持飼料，自由飲水。動物房內設空調，房間溫度保持在25～28 ℃。

1.3 試驗分組及處理

根據Ala-Gln注射液在醫學臨床推薦的每日最大給藥劑量(0.4 g/kg)下開展靶動物犬的安全性研究。將24只成年健康比格犬隨機分為4組，每組6只，設1倍劑量組(0.4 g/kg)、3倍劑量組(1.2 g/kg)、5倍劑量組(2.0 g/kg)及空白對照組(0.9%氯化鈉注射液)。Ala-Gln注射液用5倍體積的0.9%氯化鈉注射液稀釋并混勻后使用，空白對照組給予與5倍劑量組相同體積的0.9%氯化鈉注射液。靜脈滴注給藥，滴注速度為20～30滴/min，每日1次，連用14 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般臨床觀察

試驗期間觀察受試犬的臨床表現，如飲食飲水、體溫、脈搏、呼吸、排尿排糞、精神狀態等，于給藥前、給藥7 d和14 d、停藥后6 d稱量體重。

1.4.2 血液學檢查

所有受試犬分別于給藥前、給藥7 d和14 d、停藥后6 d，使用EDTA-K2抗凝的一次性真空采血管采集抗凝血進行血液生理指標檢測。

1.4.3 血液生化檢查

所有受試犬分別于給藥前、給藥7 d和14 d、停藥后6 d，使用促凝的一次性真空采血管采血并分離血清，進行血液生化指標檢測。

1.4.4 尿液檢查

所有受試犬分別于給藥前、給藥7 d和14 d、停藥后6 d，收集中段尿液，進行尿常規指標檢測。

1.4.5 組織病理學檢查

于停藥后1 d解剖5倍劑量組和空白對照組的半數犬只，停藥后7 d解剖5倍劑量組和空白對照組的剩余犬，并進行系統的剖檢學檢查，對心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺等器官稱重，計算臟器指數；另取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺、胃、腸等組織，置于10%的福爾馬林溶液固定，制作組織切片，進行HE染色，光學顯微鏡下進行組織病理學檢查。

1.5 數據統計與分析

利用GraphPad軟件進行Two-way Anova Tukey分析，數值用“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 一般臨床表現

試驗期間，所有受試犬均無死亡。第1天給藥時，5倍劑量組中2只犬在輸注30 min內出現寒顫，發現后立即關停輸液器，約15 min左右恢復正常；犬休息30 min后，降低滴注速度以15滴/min的滴速繼續輸注，未再出現該情況。該劑量組其余犬及其他劑量組犬只并未出現任何不良反應。試驗期間，所有犬精神狀態良好，攝食、飲水、排尿、排便均正常，被毛光亮，口、眼、鼻、耳均未見異常分泌物，呼吸頻率正常，體溫、脈搏均在正常范圍內。各試驗組犬的體重變化見表1，結果顯示，組內不同時間點對比后體重無顯著差異(P>0.05)。

表1 安全性試驗犬的體重變化 kg

2.2 血液學檢查

血液生理指標檢測結果見表2，各項指標均在參考范圍內波動。為考察波動是否與給藥劑量和給藥時間相關，對數據的差異性進行了顯著性分析。結果顯示，1倍和5倍劑量組的紅細胞分布密度標準差均值在給藥前顯著低于空白對照組(P<0.05)，此差異為不同組間的犬在給藥前的個別指標差異，非用藥所致，不具有臨床意義。

表2 靜脈滴注Ala-Gln注射液對犬血液生理指標的影響

2.3 血液生化檢查

血液生化指標檢測結果見表3，各項指標均在參考范圍內波動。統計分析顯示，停藥6 d時，3倍和5倍劑量組天冬氨酸氨基轉移酶(AST)顯著低于空白對照組(P<0.05)，而在輸液期未出現此差異，且指標均在正常范圍內，說明與用藥無關。

表3 靜脈滴注Ala-Gln注射液對犬血液生化指標的影響

2.4 尿液檢查

尿常規指標檢測結果見表4。結果顯示，受試犬的尿膽原、尿蛋白、酮體、膽紅素、葡萄糖均呈陰性，尿液pH值和尿比重均在正常范圍內。在給藥7 d時，3倍劑量組的pH值與1倍劑量組之間存在顯著差異(P<0.05)，但與空白對照組相比無明顯差異(P>0.05)，且所有犬pH值均在正常范圍內，可見這一明顯變化未達到病理程度，不具臨床意義。

表4 靜脈滴注Ala-Gln注射液對犬尿常規指標的影響

2.5 臟器指數

剖檢后的臟器指數結果見表5，5倍劑量組與空白對照組相比各臟器指數均無顯著差異(P>0.05)，說明靶動物犬按5倍劑量(2.0 g/kg)輸注Ala-Gln注射液，1次/d，連用14 d對內臟器官無影響。

表5 臟器指數 %

2.6 病理學變化

解剖空白對照組和5倍劑量組的犬只時，均未見明顯的由眼病理變化。心肌、心室內膜和瓣膜無異常；肝臟呈暗紅色，質地軟脆，表面和切面無出血、充血、淤血；脾臟色澤暗紅，質地軟而脆，包膜表面光滑，切開脾臟后無充血、淤血、結節或腫物形成；肺表面呈淡粉色，質柔軟光滑；雙腎大小正常，剝離包膜后，觀察與腎實質無粘連；胰腺細、長，色澤淡白，質地柔軟；胃黏膜顏色正常，無出血、損傷和潰瘍，胃內容物無異常；十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸的腸系膜及其淋巴結均無異常，腸壁黏膜無脫落、出血。組織病理學檢查結果見圖1、圖2。由圖可知，5倍劑量組與空白對照組的內臟器官均未有組織病理學變化。

圖1 犬心臟、肝臟、脾臟組織學變化(400×)

圖2 犬肺臟、腎臟、胰腺組織學變化(400×)

3 討論

寵物術后第1階段(48 h內)，液體治療和維護胃腸道功能非常重要。術后第2階段(3 d后)病患的代謝速率、氮排泄和氧氣消耗增加。從1階段過渡到2階段時，需要為動物提供足夠的能量。然而，當消化道手術或其他手術中消化道出血過多、嚴重便秘、或任何其他胃腸道阻塞、或嘔吐嚴重時，靜脈輸注腸外補充營養更為重要[9]。將Ala-Gln注射液引入寵物臨床，對于加快寵物術后恢復，降低死亡率，縮短住院時間有重要意義[10]。安全是藥物應用的前提，因此本試驗以犬為靶動物，考察了其靜脈滴注Ala-Gln注射液的安全性。

Ala-Gln毒性極低，安全性高。日本研究者發現，Ala-Gln以2 000 mg/kg體重的劑量灌胃給藥后，對SD大鼠沒有急性毒性；之后又對大鼠開展了13周的Ala-Gln亞慢性毒性研究，結果顯示，與對照組相比，受試組大鼠的血液生理和生化指標中AST、TC等顯著升高，但都在正常范圍內，這些變化沒有顯示出劑量-反應關系，無毒理學意義[11]。我國醫學臨床上已上市的多個同類產品說明書中指出：嚴重肝、腎功能不全者禁用本品，故在試驗過程中著重觀察肝、腎功能相關指標。與肝功能有關的指標有：ALBⅡ、ALT、AST和ALP。除AST在停藥6 d時，3倍劑量組和5倍劑量組顯著低于空白對照組外，其余指標的各劑量組與空白對照組相比均未發生顯著變化。而AST在輸液期未出現此差異，且其余指標的各劑量組在停藥6 d時與給藥前相比不存在顯著差異，說明此差異與用藥無關。與腎有關的指標有：CREA、UREA，結果顯示各劑量組組內和組間對比，不存在顯著差異。觀察5倍劑量組犬的肝臟、腎臟組織切片也未發生顯著病理變化，提示Ala-Gln注射液以1倍(0.4 g/kg)至5倍劑量(2.0 g/kg)應用于犬可能對其肝臟、腎臟無顯著影響。

有文獻指出，本品在輸注速度過快時會出現寒顫、惡心、嘔吐等不良癥狀[12]。周燕萍等[13]在胃腸道術后患者的應用Ala-Gln期間觀察到，個別患者過快輸注Ala-Gln時，出現寒戰、惡心癥狀，減慢輸液速度后癥狀很快消失。本試驗2只犬在輸注過程中出現寒顫，短暫休息后降低速度繼續輸注，犬恢復正常，并正常完成了14 d的給藥試驗。2只犬體型相對較小(體重分別為6.62 kg和6.76 kg)，試驗在冬天開展，推測寒顫可能與藥液溫度稍涼、輸注速度較快有關，建議在滴注過程中應控制滴注速度并給予動物額外的保暖，一旦出現寒顫，應立即減慢輸液速度或停止輸液，以確保動物輸液過程的安全和舒適度。