新型雙組分交聯(lián)封閉聚合物水凝膠促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合的研究

金晶 何屹 鄔凌峰 李家曄 沈斌 高金來

創(chuàng)面管理是醫(yī)療系統(tǒng)管理的重要組成部分[1]。術(shù)后創(chuàng)面感染會(huì)導(dǎo)致疼痛、愈合時(shí)間延長，甚至引發(fā)全身感染[2]。目前迫切需要開發(fā)理想敷料，以減少創(chuàng)面疼痛，加快創(chuàng)面愈合速度。在無任何敷料的情況下，一旦結(jié)痂覆蓋創(chuàng)面會(huì)降低上皮化速度；但如果使用濕敷料就不易形成結(jié)痂，有利于創(chuàng)面快速愈合[3-4]。傳統(tǒng)的紗布敷料不能保持創(chuàng)面濕潤，纖維組織易與肉芽組織融合，導(dǎo)致更換敷料時(shí)疼痛感明顯，并可能造成新的組織損傷[5-7]。目前開發(fā)了一種新型雙組分交聯(lián)聚合物封閉水凝膠，先在需要封閉的創(chuàng)面覆蓋一層植物纖維素衍生物水溶液，再噴涂一層氧化淀粉水溶液，原位快速（3 s）形成不流動(dòng)的生物水凝膠，將術(shù)后創(chuàng)面有效封閉起來，從而減少滲出，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本研究通過構(gòu)建大鼠創(chuàng)面模型，就新型雙組分交聯(lián)封閉聚合物水凝膠對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合的作用作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠18 只，購自上海Legen 生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（浙）2019-0002]，體重（200±20）g。大鼠飼養(yǎng)于嘉興學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房[使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2020-0007]，室溫20～25 ℃，濕度40%～70%，不限制飲水、進(jìn)食。本研究經(jīng)嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)文號(hào)：JUMC2022-171）。

1.2 試劑和儀器 新型雙組分交聯(lián)聚合物封閉水凝膠（批號(hào)：20200618）購自易敏（浙江）生物醫(yī)藥科技有限公司，硫酸慶大霉素（批號(hào)：N23030761）購自辰欣藥業(yè)股份有限公司，水合氯醛（批號(hào)：20220320）購自青島宇龍海藻有限公司，HE 染色試劑盒（批號(hào)：G1120）購自北京索萊寶科技有限公司，qRT-PCR 試劑盒（批號(hào)：A46012）購自美國Thermo Fisher 有限公司。qRTPCR 儀（型號(hào)：Stepone plus 7500）購自美國ABI 公司，熒光顯微鏡（型號(hào)：BX53）購自日本OLYMPUS 公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠創(chuàng)面模型構(gòu)建 按0.3 mL/100 g劑量取10%水合氯醛麻醉大鼠，剃除大鼠背部毛皮并消毒皮膚，用打孔器在背部皮膚打孔（直徑8 mm，深度2 mm）。

1.3.2 大鼠分組與處理 按隨機(jī)數(shù)字表法將建模后的SD 大鼠分為水凝膠組、硫酸慶大霉素組、對(duì)照組，每組6 只。其中水凝膠組每天在創(chuàng)面處涂抹植物纖維素衍生物水溶液25 μL，同時(shí)噴涂氧化淀粉水溶液25 μL，1 次/d；硫酸慶大霉素組每天在創(chuàng)面處涂抹硫酸慶大霉素50 μL 作為陽性對(duì)照，1 次/d；對(duì)照組不作任何處理。藥物干預(yù)第10 天10%水合氯醛麻醉大鼠，以大鼠的背部創(chuàng)面中心為原點(diǎn)，取直徑10 mm、深度達(dá)真皮層的創(chuàng)面組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，包括對(duì)創(chuàng)面組織進(jìn)行HE染色并觀察組織形態(tài)，以及采用qRT-PCR 法檢測(cè)創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用CO2窒息法對(duì)所有大鼠進(jìn)行無痛安樂死處理。

1.3.3 大鼠創(chuàng)面面積測(cè)量 每天記錄創(chuàng)面愈合情況，采用相機(jī)取固定高度和角度并以直尺作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照保存，使用Image Pro Plus 軟件計(jì)算創(chuàng)面面積。

1.3.4 大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)檢查及肉芽組織面積測(cè)量 采用HE 染色。取藥物干預(yù)10 d 后的創(chuàng)面組織于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，石蠟包埋，切片（厚度5 μm）。取肉芽組織面積最大的切片，按照HE 染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，在光鏡下觀察并拍照，使用圖像分析軟件測(cè)量創(chuàng)面肉芽組織面積。

1.3.5 大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。取藥物干預(yù)10 d后的創(chuàng)面組織30 mg，加入1 mL Trizol 后使用組織研磨器在冰浴中將組織樣本研磨成勻漿，加入適量氯仿離心后吸取RNA 層。將其轉(zhuǎn)移至另一個(gè)EP 管中，加入等體積的異丙醇并混勻，4℃下12 000 r/min離心10 min后RNA 沉于管底。使用1 mL 75%乙醇洗滌后，使用DEPC 水重懸，取1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為SYBR Green Mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 1 μL，并用Nuclease-Free 補(bǔ)足體積至20 μL，引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠創(chuàng)面面積變化比較 從藥物干預(yù)第4 天起，水凝膠組和硫酸慶大霉素組大鼠創(chuàng)面面積均明顯小于對(duì)照組（均P＜0.05），而水凝膠組與硫酸慶大霉素組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖1（插頁）。

圖1 3 組大鼠創(chuàng)面面積變化比較（A：創(chuàng)面愈合情況，×2；B：創(chuàng)面面積變化，與對(duì)照組比較，aP＜0.05）

2.2 3 組大鼠創(chuàng)面肉芽組織面積比較 水凝膠組藥物干預(yù)10 d 后創(chuàng)面明顯愈合，肉芽組織區(qū)域較少，真皮組織區(qū)域較多，見圖2A（插頁）。水凝膠組、硫酸慶大霉素組創(chuàng)面肉芽組織面積均明顯小于對(duì)照組（均P＜0.05），而水凝膠組與硫酸慶大霉素組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2B（插頁）。

圖2 3 組大鼠創(chuàng)面肉芽組織面積比較（A：HE 染色結(jié)果，×4；B：肉芽組織面積比較，與對(duì)照組比較，aP＜0.05）

2.3 3 組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 水凝膠組、硫酸慶大霉素組創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組（均P＜0.05），TGF-β mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；而水凝膠組與硫酸慶大霉素組創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖3。

圖3 3 組大鼠創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（A：IL-6；B：TNF-α；C：TGF-β）

3 討論

皮膚是人體與外部環(huán)境之間最重要的屏障，也是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。它通過減少微生物的黏附和侵襲[8]，在防止微生物的滲透和預(yù)防感染方面起著重要作用。然而，當(dāng)這個(gè)屏障被打破時(shí)，機(jī)體易被微生物感染。創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要經(jīng)歷凝血期、炎癥期、增殖期和重建期等4個(gè)階段[9-11]。在凝血期，血小板聚集起到止血的作用；在炎癥期，各種生長因子和生物活性物質(zhì)啟動(dòng)組織修復(fù)；在增殖期，纖維細(xì)胞增殖并遷移到創(chuàng)面，與內(nèi)皮細(xì)胞一同生長并形成血管；在重建期，角質(zhì)形成細(xì)胞通過合成細(xì)胞外基質(zhì)并參與細(xì)胞間信號(hào)調(diào)控，從而促進(jìn)基底膜形成。然而，任何一個(gè)時(shí)期都可能影響創(chuàng)面遷延不愈。本研究通過構(gòu)建大鼠創(chuàng)面模型，就新型雙組分交聯(lián)封閉聚合物水凝膠對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合的作用作一探討，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

新型雙組分交聯(lián)封閉聚合物水凝膠是一種新型液體敷料，生物水凝膠原位快速形成并發(fā)揮保護(hù)作用，具體機(jī)制為帶有大量氨基的梳狀高分子植物纖維素衍生物與帶有大量醛基的星狀高分子氧化淀粉通過席夫堿反應(yīng)交聯(lián)形成水凝膠，以星狀高分子、梳狀高分子為基的生物水凝膠能加速成膠反應(yīng)；而噴涂在底層的植物纖維素衍生物與黏膜具有較強(qiáng)的靜電吸引作用，該作用力來自于植物纖維素衍生物分子與水分子、組織上含氫基團(tuán)（如氨基、羧基等）強(qiáng)的氫鍵作用以及植物纖維素衍生物高分子上大量羧基和氨基與黏膜組織表層細(xì)胞、蛋白、細(xì)胞間骨架上帶正電性基團(tuán)、負(fù)電性基團(tuán)之間的靜電吸引作用，上述這些作用賦予水凝膠穩(wěn)固黏著創(chuàng)面的能力，從而達(dá)到封閉創(chuàng)面的效果，進(jìn)而減少滲出，抑制創(chuàng)面組織炎癥因子（IL-6、TNF-α）的分泌，增加TGF-β 因子分泌，誘導(dǎo)纖維細(xì)胞增殖，最終促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，水凝膠組和硫酸慶大霉素組從藥物干預(yù)第4 天起創(chuàng)面面積和肉芽組織面積均明顯縮小，創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，TGF-β mRNA 相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而水凝膠組與硫酸慶大霉素組創(chuàng)面肉芽組織面積以及組織中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以上結(jié)果提示水凝膠與慶大霉素在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面顯示出相似的療效。隨著抗生素耐藥性問題的日益突出，非抗生素創(chuàng)面治療方案，如水凝膠的出現(xiàn)為患者提供了更多選擇，有助于減少抗生素耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。而水凝膠作為新型創(chuàng)面治療材料，具有獨(dú)特的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有封閉創(chuàng)面、減少滲出的同時(shí)又能保持透氣、防水的特點(diǎn)，為創(chuàng)面愈合提供良好的修復(fù)環(huán)境。此外，水凝膠在燒傷和慢性創(chuàng)面治療中的應(yīng)用價(jià)值也值得進(jìn)一步探究。未來研究方向也可關(guān)注改進(jìn)水凝膠的配方，以提高其治療效果，并在更廣泛的創(chuàng)面類型上進(jìn)行有效性測(cè)試。

綜上所述，新型雙組分交聯(lián)封閉聚合物水凝可加速大鼠創(chuàng)面愈合，減少炎癥反應(yīng)。