甲氨蝶呤對(duì)器官毒性的作用機(jī)制研究進(jìn)展

陳 浩,尹連紅,彭金詠

(大連醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬第一醫(yī)院、2 藥學(xué)院,遼寧 大連 116044)

甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)為抗葉酸類藥物,可抑制細(xì)胞增生及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,因而廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病以及惡性腫瘤,是目前最重要的控制性抗風(fēng)濕藥物和廣泛應(yīng)用的抗代謝類腫瘤藥之一。MTX屬于細(xì)胞周期特異性藥物,主要作用于細(xì)胞周期的S期。MTX通過(guò)以下兩種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[1],其與二氫葉酸還原酶有高度親和力,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸還原酶活性阻止二氫葉酸還原為四氫葉酸,減少5,10-甲酰四氫葉酸的產(chǎn)生以干擾DNA的合成;MTX也可以阻止嘌呤核苷酸的合成,從而干擾蛋白質(zhì)的合成。當(dāng)MTX大劑量應(yīng)用時(shí),透過(guò)血腦、血睪等屏障的藥量較高,故能有效地治療血運(yùn)不佳的實(shí)體腫瘤,如急性淋巴細(xì)胞白血病、非霍奇金淋巴瘤等。但是隨著使用劑量的增加,其不良反應(yīng)的程度也相應(yīng)增加,例如口腔及消化道黏膜損傷、肝腎功能損傷等。本文旨在綜述MTX對(duì)各器官毒性的作用機(jī)制,為今后藥理毒理學(xué)理論研究以及臨床上中毒后的個(gè)體化治療提供參考。

MTX是一種非選擇性葉酸拮抗藥,在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí),也會(huì)抑制正常細(xì)胞的生長(zhǎng),產(chǎn)生不良反應(yīng)。MTX的濃度與其殺傷程度密切相關(guān),而殺傷程度與其引起的不良反應(yīng)直接相關(guān)。大劑量的MTX可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞,減弱或解除腫瘤細(xì)胞引起的免疫抑制,提高機(jī)體免疫功能,但大劑量MTX可在機(jī)體蓄積,增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。劑量越大,患者胃腸道反應(yīng)、肝功能損傷、黏膜損傷、骨髓抑制等不良反應(yīng)的發(fā)生率增加。小劑量的MTX(≤30 mg/周)用于風(fēng)濕的治療,長(zhǎng)期使用也會(huì)發(fā)生不良反應(yīng),如肝功能異常、骨髓抑制等(Tab 1)。

1 消化道

1.1 MTX致消化道損害的臨床表現(xiàn)惡心、嘔吐、食欲不振是MTX最常見(jiàn)的消化道毒性反應(yīng),在用藥后的1～2 d反應(yīng)最為劇烈。此外,部分病例還表現(xiàn)出口腔黏膜炎和腹瀉,并可出現(xiàn)肛門(mén)、直腸黏膜炎以及出血等癥狀,少數(shù)病例會(huì)繼發(fā)嚴(yán)重的感染,甚至危及生命。

1.2 病理、生化改變MTX損害消化道后,會(huì)出現(xiàn)腸上皮細(xì)胞絨毛的融合和萎縮、刷狀緣和表面腸細(xì)胞的破壞、有絲分裂減少、隱窩消失、隱窩細(xì)胞破壞或扭曲、隱窩膿腫形成、杯狀細(xì)胞排空增加以及炎癥細(xì)胞(多核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)廣泛浸潤(rùn)。MTX能引起大鼠腸黏膜炎的組織形態(tài)學(xué)改變以及血管擴(kuò)張和黏膜充血水腫;對(duì)消化道功能方面的影響包括腸黏膜屏障受損、通透性增加,腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性。在分子水平上,腸黏膜蛋白質(zhì)、DNA及RNA含量明顯下降。Kushwaha等[2]通過(guò)使用單細(xì)胞凝膠電泳測(cè)定技術(shù)發(fā)現(xiàn)MTX能誘導(dǎo)小鼠多個(gè)器官的DNA及RNA含量顯著下降。因此,MTX被認(rèn)為能通過(guò)直接抑制上皮細(xì)胞DNA的合成或加速小腸隱窩細(xì)胞的凋亡從而誘發(fā)急性小腸黏膜炎。

1.3 MTX致消化道損害的機(jī)制

1.3.1半胱天冬酶 在體內(nèi),MTX誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞凋亡、腸道黏膜潰瘍,造成營(yíng)養(yǎng)不良和腸道黏膜屏障破壞,從而增加腸道相關(guān)膿毒癥的風(fēng)險(xiǎn)。MTX對(duì)快速增殖的細(xì)胞,包括正常的腸道上皮細(xì)胞具有很高毒性,如MTX可誘導(dǎo)RIE-1細(xì)胞凋亡,減少細(xì)胞數(shù)量。Papaconstantinou等[3]建立MTX誘導(dǎo)的腸道細(xì)胞凋亡的體外模型,并發(fā)現(xiàn)MTX處理RIE-1細(xì)胞使其線粒體腫脹和膜碎裂,從受損的線粒體中釋放細(xì)胞色素C誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素C作為一個(gè)位于線粒體膜上的電子傳遞鏈中的蛋白質(zhì)成員,被釋放到細(xì)胞質(zhì)中與凋亡蛋白激活因子(Apaf-1)結(jié)合并激活半胱天冬酶caspase-9,從而激活半胱天冬酶caspase-2和3導(dǎo)致DNA片段、細(xì)胞核凝結(jié)以及細(xì)胞骨架和結(jié)構(gòu)蛋白的破壞。這表明這些特異性半胱天冬酶可能介導(dǎo)了MTX對(duì)腸上皮細(xì)胞的凋亡作用。Papaconstantinou等進(jìn)一步研究確定了被MTX激活的特異性半胱天冬酶,并發(fā)現(xiàn)一種通用的半胱天冬酶抑制劑,即Z-VAD-FMK,可以有效抑制MTX誘導(dǎo)的RIE-1細(xì)胞凋亡。

Tab 1 The adverse effects produced by different doses of MTX

綜上所述,半胱天冬酶在MTX誘導(dǎo)的RIE-1細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用,是減輕其腸道相關(guān)毒性的潛在治療靶點(diǎn)。

1.3.2二氫葉酸還原酶 MTX致腸黏膜炎的另一種機(jī)制是通過(guò)抑制腸黏膜層的二氫葉酸還原酶抑制DNA合成,鏡下表現(xiàn)為腸黏膜隱窩變淺、絨毛萎縮。MTX使腸黏膜層細(xì)胞有絲分裂在隱窩中停止,使覆蓋絨毛的上皮細(xì)胞減少。微絨毛與脂肪吸收有關(guān),因此脂肪只在MTX處理的大鼠的腸道刷狀邊界相對(duì)少數(shù)正常留存的腸道細(xì)胞中被吸收。Williams[4]觀測(cè)到鈍化的絨毛可以將其表面積減少到正常值的20%,這表明了小腸的微絨毛吸收能力顯著降低。這些改變可能造成消化不良從而引起食欲不振以及體質(zhì)量減輕。

1.3.3寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 (PEPT1) 載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)藥物和營(yíng)養(yǎng)素的吸收方面發(fā)揮著重要作用。PEPT1是載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中一種主要存在于小腸上皮細(xì)胞的質(zhì)子依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要轉(zhuǎn)運(yùn)食物中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的二肽、三肽。許多研究人員已經(jīng)證明小腸的病理變化會(huì)改變藥物吸收,而MTX會(huì)誘導(dǎo)腸道藥物被動(dòng)吸收,以及葡萄糖和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主動(dòng)吸收,可能是通過(guò)干擾PEPT1實(shí)現(xiàn)的[5-6]。

氨基-β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢氨芐(cefalexin, CEX)是一種親水性離子化合物,主要通過(guò)活性轉(zhuǎn)運(yùn)體PEPT1從小腸吸收,而代謝很少。Naruhashi等[7]通過(guò)CEX來(lái)評(píng)估MTX損傷的小腸的吸收功能。CEX總量的變化是活性轉(zhuǎn)運(yùn)功能的一個(gè)指標(biāo),并且通過(guò)MTX誘導(dǎo)的腸黏膜組織病理學(xué)變化可以很好地反映出來(lái)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MTX會(huì)影響蛋白質(zhì)在體內(nèi)的消化吸收過(guò)程,導(dǎo)致惡心、體質(zhì)量下降、腹瀉等臨床癥狀,并可能造成由免疫力低下引發(fā)的感染。

1.3.4水、電解質(zhì) MTX引起的腸道損傷的特點(diǎn)包括鈉、鉀分泌增加以及黏膜吸收表面積顯著減少。電解質(zhì)通量紊亂和腸道屏障破壞在很大程度上導(dǎo)致了化療患者的胃腸道癥狀(即厭食、惡心、嘔吐、腹瀉),以及化療對(duì)患者有害的營(yíng)養(yǎng)影響。Carneiro-Filho等[5]證明了MTX誘導(dǎo)了腸道電解質(zhì)和水通量的紊亂。對(duì)照組Wistar大鼠用MTX治療3 d以誘發(fā)黏膜炎,鈉的吸收和鉀的分泌明顯增加,這些變化與動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉相關(guān)。

1.3.5溶酶體 多項(xiàng)研究結(jié)果顯示,MTX處理后的大鼠十二指腸和血漿中瓜氨酸濃度明顯偏低[6,8]。在MTX處理的大鼠中,腸細(xì)胞合成的這種非蛋白氨基酸的濃度偏低可以反映腸細(xì)胞數(shù)量的減少,并可能表明吸收功能的降低[9]。這意味著,MTX治療誘導(dǎo)的黏膜萎縮與瓜氨酸下降相關(guān),而非該藥物的厭食癥作用;而且十二指腸和血漿中氨基酸譜的紊亂與蛋白質(zhì)的水解有關(guān)。

在大多數(shù)細(xì)胞中,蛋白質(zhì)水解由3個(gè)主要酶系統(tǒng)的活動(dòng)產(chǎn)生:溶酶體、Ca2+激活和蛋白酶體途徑。組織蛋白酶D(cathepsin D, Cath-D)介導(dǎo)的蛋白水解被認(rèn)為是溶酶體活性的標(biāo)志,而在小腸結(jié)腸炎的急性期,MTX治療特異性增強(qiáng)了Cath-D蛋白水解。Leblond等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Cath-D蛋白水解途徑的改變,尤其是溶酶體中Cath-D活性增強(qiáng)和蛋白酶體活性減弱。在實(shí)驗(yàn)中,MTX處理增加了Cath-D的mRNA表達(dá)和活性。其活性的顯著增加可能反映了其他溶酶體組織蛋白酶的激活增強(qiáng),因?yàn)榻M織蛋白酶D激活了其他組織蛋白酶,例如組織蛋白酶B或L。黏膜萎縮和腸道通透性與Cath-D活性相關(guān),這表明了溶酶體途徑在MTX誘導(dǎo)的損傷中有潛在作用,而且MTX治療后空腸中激活的主要蛋白水解途徑是組織蛋白酶D系統(tǒng)。

2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)

2.1 MTX致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的臨床表現(xiàn)大劑量MTX在通過(guò)靜脈或鞘內(nèi)注射后出現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性,這是MTX的嚴(yán)重不良反應(yīng)之一,根據(jù)劑量、輸液速度、患者自身情況等差異可分別引起急性、亞急性和慢性中毒。急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性通常在給藥后數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生,患者可出現(xiàn)類似化膿性腦膜炎的癥狀,如嗜睡、頭痛、惡心嘔吐,這些癥狀一般是一過(guò)性的[11-12]。亞急性和慢性中樞毒性可在給藥后數(shù)日或數(shù)周發(fā)生,其中患者在亞急性中毒時(shí)可能出現(xiàn)類似腦卒中的癥狀,如半球綜合征、失語(yǔ)、構(gòu)音障礙、吞咽困難和復(fù)視等。在慢性中毒過(guò)程中,MTX的特異性綜合征是壞死性脫髓鞘白質(zhì)腦病,表現(xiàn)為精神錯(cuò)亂、嗜睡或易激惹、語(yǔ)言障礙等[13],嚴(yán)重病例會(huì)出現(xiàn)癱瘓、昏迷甚至死亡,有些患者尤其是兒童可獲得部分恢復(fù)或病情趨于穩(wěn)定。

2.2 病理、生化改變MTX急性神經(jīng)中毒時(shí)腦脊液檢查可見(jiàn)腦脊液細(xì)胞增多、蛋白含量增加、顱內(nèi)壓增高。而亞急性以及慢性神經(jīng)中毒主要累及深部腦白質(zhì)尤其是腦室周圍和半卵圓中心,從而引起白質(zhì)腦病,其鏡下表現(xiàn)為脫髓鞘、軸突損傷等特征性改變。

2.3 MTX致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的機(jī)制

2.3.1同型半胱氨酸(Hcy) MTX誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性(MTX-Ntox)的機(jī)制有很多,但其中一個(gè)潛在生化途徑涉及葉酸依賴的Hcy的再甲基化,MTX治療可增加血漿和腦脊液中的Hcy[14]。Quinn等[15]實(shí)驗(yàn)表明,未暴露于MTX的個(gè)體的腦脊液Hcy濃度較低,這與之前的少數(shù)報(bào)道一致[16],而MTX可顯著提高腦脊液中Hcy濃度,并且這種作用可能持續(xù)至少1周。在腦脊液中,MTX會(huì)耗盡細(xì)胞內(nèi)還原葉酸的濃度,從而阻止Hcy向蛋氨酸的再甲基化,這可能在MTX-Ntox的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

Hcy代謝的一個(gè)相關(guān)方面也可能是MTX神經(jīng)毒性的發(fā)病機(jī)制中的重要組成部分。興奮性氨基酸(EAAs),如Hcy和半胱氨酸亞磺酸(CSA)以及相關(guān)化合物同型半胱氨酸磺酸(HCSA)和半胱氨酸(CA),可能分別從Hcy和CA中氧化衍生出來(lái)。這些化合物被認(rèn)為是神經(jīng)遞質(zhì),是NMDA受體的內(nèi)源性激動(dòng)劑,是谷氨酸受體的一種亞型。EAAs被認(rèn)為在癲癇發(fā)作的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。并且可能是典型同型半胱氨酸尿癥中癲癇發(fā)作的原因。此外,EAAs的過(guò)度表達(dá)可能通過(guò)谷氨酸受體過(guò)度激活導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡。這種損傷機(jī)制被稱為興奮性毒性,它被認(rèn)為是許多慢性神經(jīng)退行性疾病和急性神經(jīng)病變的共同途徑。

Hcy的增加也會(huì)導(dǎo)致毒性代謝物S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的病理增加。SAH已被證明是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的有效產(chǎn)物抑制劑,具有合成5-羥色胺和多巴胺以及維持髓鞘形成所需蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)甲基作用[17]。SAH可能通過(guò)干擾正常內(nèi)皮細(xì)胞中RAS的甲基化,阻斷其向細(xì)胞膜的移位和RAS功能來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.3.2半胱天冬酶 曾有病例[18]的研究結(jié)果支持氧化磷脂酰膽堿(OxPC)作為急性神經(jīng)毒性中氧化應(yīng)激的潛在生物標(biāo)志。Miketova等[19]在被診斷為低、標(biāo)準(zhǔn)或高風(fēng)險(xiǎn)急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)的21名兒童的腦脊液(CSF)樣本中測(cè)量出了CNS細(xì)胞膜中最常見(jiàn)的磷脂——磷脂酰膽堿(PC)的氧化和未被氧化成分。其中高危兒童在最密集的治療階段(鞏固期)都接受了最高劑量的MTX治療。結(jié)果表明,對(duì)ALL的化療增加了氧化PC的比例,增加了氧化應(yīng)激是治療誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷機(jī)制的可能性。

Taylor等[18]所報(bào)告的3個(gè)病例中最一致的生物標(biāo)志物變化是急性毒性期間caspase-3、7的增加,毒性作用后F2異前列烷水平的增加,以及稍晚發(fā)生的氧化磷脂的增加。在急性毒性作用之前和期間,F2異前列烷和caspase-3、7的進(jìn)行性增加表明MTX誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和凋亡的相關(guān)增加。由于PC和PI構(gòu)成細(xì)胞膜,這種氧化PC和PI水平增加的輕微延遲可能反映了氧化應(yīng)激和凋亡誘導(dǎo)的作用。

2.3.3腺苷 MTX的神經(jīng)毒性也可能與MTX誘導(dǎo)的腺苷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的釋放和積累有關(guān)。MTX及其聚谷氨酸酯的直接抑制作用或繼發(fā)于DHFR抑制的MTX多谷氨酸累積間接抑制5-氨基咪唑4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR)轉(zhuǎn)化酶引起導(dǎo)致5-氨基咪唑4-甲酰胺核糖核苷酸在細(xì)胞內(nèi)積累,這增加了腺苷的釋放和積累。這些腺苷通過(guò)作用于穹窿周圍外側(cè)下丘腦的A1受體,調(diào)節(jié)覺(jué)醒和嗜睡。這解釋了一些患者在攝入MTX后出現(xiàn)的乏力和嗜睡現(xiàn)象。

3 肝臟

3.1 MTX 致肝臟損害的臨床表現(xiàn)長(zhǎng)期大量MTX治療會(huì)引起血清氨基轉(zhuǎn)移酶升高,從而誘發(fā)或加重脂肪肝、肝纖維化甚至肝硬化等疾病。臨床上MTX誘發(fā)肝損傷的發(fā)生率接近70%,并成為MTX臨床治療中給藥中斷的主要原因。有研究表明MTX在肝臟中抑制RNA和DNA合成并產(chǎn)生細(xì)胞停滯從而引起肝損傷的這種機(jī)制是直接毒性[20]。還有學(xué)者認(rèn)為MTX導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制可能是通過(guò)選擇性干擾肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞代謝的某一環(huán)節(jié),影響肝臟蛋白質(zhì)的合成[21]。通過(guò)近年來(lái)研究分析總結(jié)后發(fā)現(xiàn)MTX致肝損傷機(jī)制主要包括葉酸途徑、氧化應(yīng)激途徑、腺苷途徑和Hcy途徑。

3.2 病理、生化改變MTX患者肝活檢的組織學(xué)變化包括脂肪變性、星狀細(xì)胞肥大和肝纖維化。

3.3 MTX致肝臟損害的機(jī)制

對(duì)于事業(yè)單位而言，把好人員進(jìn)口關(guān)十分關(guān)鍵，必須不斷完善公開(kāi)招聘、崗位競(jìng)聘制度，規(guī)范的招聘程序，根據(jù)“用進(jìn)廢退”規(guī)律可知，人力資源可以通過(guò)使用實(shí)現(xiàn)增進(jìn)，閑置只會(huì)讓人力資源一步步喪失資本存量，同時(shí)只有在人力資源開(kāi)發(fā)中引入競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，方可令員工在競(jìng)爭(zhēng)中不斷發(fā)展，讓有能力、有才華的人脫穎而出。

3.3.1葉酸途徑 MTX作為一種二氫葉酸還原酶抑制劑,能夠通過(guò)抑制二氫葉酸還原為四氫葉酸來(lái)減少DNA合成,從而抑制細(xì)胞增殖造成肝損傷。同時(shí),位于肝竇周隙(Disse隙)中有一種能儲(chǔ)存維生素A的脂肪細(xì)胞被稱為肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)。當(dāng)被MTX誘發(fā)的慢性肝損傷激活時(shí),它們會(huì)形成骨髓成纖維細(xì)胞,分泌膠原蛋白和其他基質(zhì)蛋白,如纖維連接蛋白。這一過(guò)程分為啟動(dòng)和持續(xù)兩個(gè)階段。在啟動(dòng)階段,當(dāng)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受到損傷時(shí),鄰近的肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞等通過(guò)旁分泌作用可分泌如腫瘤壞死因子(TNF-α)等多種細(xì)胞因子,作用于HSC并使之出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MFB)樣表型轉(zhuǎn)化,激活并引起細(xì)胞增殖、ECM合成增加等。在持續(xù)階段中,細(xì)胞因子維持HSC的激活狀態(tài)并形成纖維。在這一階段,HSC的活化受自分泌和旁分泌的雙重調(diào)節(jié)。激活的HSC有兩個(gè)去向:(1)由激活態(tài)變回靜止態(tài)。(2)發(fā)生細(xì)胞凋亡而死亡。此過(guò)程可能解釋了MTX誘發(fā)肝纖維化以及肝硬化的原因。

3.3.2氧化應(yīng)激途徑 氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài),是與體內(nèi)自由基和其他分子化學(xué)反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞損壞。此時(shí)在機(jī)體的有氧代謝過(guò)程中,線粒體產(chǎn)生的ROS自由基處于高水平狀態(tài)。研究結(jié)果表明,MTX通過(guò)增加肝組織中的脂質(zhì)過(guò)氧化和降低抗氧化酶的水平而引起氧化組織損傷。其中MTX產(chǎn)生ROS的一種機(jī)制涉及四氫生物蝶呤,它是許多酶的重要輔助因子,也是內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的配體,可通過(guò)氧化的二氫生物蝶呤轉(zhuǎn)化。四氫生物喋呤促進(jìn)一氧化氮的生成,而二氫生物喋呤解偶聯(lián)eNOS,導(dǎo)致產(chǎn)生超氧化物[22]。MTX誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)量的ROS后,會(huì)通過(guò)如下通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡:

(1)Fas通路:ROS通過(guò)Fas/FasL激活半胱天冬酶中的caspase-8,促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放,導(dǎo)致caspase-9和3的激活,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

(2)P53/MPTP通路:過(guò)量的ROS可以調(diào)控P53/線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(P53 /MPTP)通路。轉(zhuǎn)錄因子P53家族受DNA損傷的活化后能夠誘導(dǎo)Bax(一種Bcl-2基因家族中細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因)的轉(zhuǎn)錄,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

(3)NF-κB通路:ROS可促進(jìn)蛋白激酶C (PKC)的激活,通過(guò)降解IKBs(NF-κB抑制蛋白)的方式活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與相應(yīng)DNA結(jié)合,促進(jìn)目的基因轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

(4)JNK通路:JNK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一員,參與多種應(yīng)激反應(yīng)。細(xì)胞因子刺激和環(huán)境應(yīng)激均會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的JNK。在特異性刺激后,JNK可以被MAPK家族中的2種蛋白激酶MKK4和MKK7激活,并使細(xì)胞質(zhì)中的Bax二聚體或者Bax磷酸化,從而向線粒體移位,誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜釋放細(xì)胞色素C,激活caspase-9和caspase-3;也可以使抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl磷酸化,這些都誘導(dǎo)了凋亡發(fā)生。

3.3.3腺苷途徑 MTX進(jìn)入機(jī)體后部分經(jīng)肝細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)化為多谷氨酸鹽集聚在肝臟等組織器官中。MTX多谷氨酸鹽能阻斷將AICAR轉(zhuǎn)化為5-甲酰胺基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(FAICAR)的ATIC[23]。已知AICAR可以抑制腺苷脫氨酶,從而防止腺苷分解為肌苷。因此當(dāng)AICAR水平升高時(shí),細(xì)胞內(nèi)腺苷水平也升高。腺苷是一種旁分泌信號(hào)分子,可以結(jié)合4種不同的G蛋白偶聯(lián)受體,分別為腺苷受體A1、腺苷受體A2a、腺苷受體A2b和腺苷受體A3。其中,A1和A2a受體對(duì)腺苷具有高親和力,而A2b和A3受體則相反。目前認(rèn)為通過(guò)腺苷信號(hào)傳導(dǎo)觀察到的大部分臨床效應(yīng)是通過(guò)A2a受體。Chan等[23]研究表明腺苷A2a受體刺激肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生膠原。

3.3.4Hcy途徑 MTX也可以通過(guò)干擾Hcy產(chǎn)生甲硫氨酸的能力來(lái)引起肝纖維化。過(guò)量的Hcy誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,促進(jìn)肝臟中脂肪的積累。Hcy還能激活HSC和促炎細(xì)胞因子,導(dǎo)致肝纖維化[11,24]。

4 腎臟

4.2 病理、生化改變持續(xù)注射一定劑量MTX后的12 h內(nèi),在腎皮質(zhì)觀察到出現(xiàn)大面積嚴(yán)重的腎小球和腎小管腎炎,如纖維組織嚴(yán)重浸潤(rùn)、腎小球輪廓破壞或壞死、腎小囊或間隙消失。在上皮層褶皺中可以看到腎小管壞死,小管周圍可見(jiàn)纖維沉積,髓質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)輕度腎小管水腫和擴(kuò)張。

4.3 MTX致腎臟損傷的機(jī)制

4.3.1過(guò)敏反應(yīng) 高濃度MTX可使血清白蛋白變性,使其成為具有免疫原性的載體蛋白。同時(shí),兩者可因MTX的半抗原性而結(jié)合,并在結(jié)合后使人體產(chǎn)生針對(duì)MTX-白蛋白復(fù)合物的抗體[25],從而引起超敏反應(yīng),通常表現(xiàn)為間質(zhì)性腎炎。間質(zhì)性腎炎所導(dǎo)致的腎小管功能障礙可出現(xiàn)低比重及低滲透壓尿、腎小管性蛋白尿和水、電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂等。

4.3.2氧化應(yīng)激 谷胱甘肽(GSH)是一種重要的細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化劑,對(duì)ROS具有保護(hù)作用。在正常條件下,谷胱甘肽還原酶利用還原型輔酶(NADPH)維持細(xì)胞內(nèi)GSH的還原狀態(tài)。MTX可抑制細(xì)胞溶質(zhì)煙堿依賴腺苷二磷酸(NADP)的脫氫酶類和NADP蘋(píng)果酸酶(NADP-ME),從而降低細(xì)胞內(nèi)NADPH的可用性。MTX使GSH水平的顯著降低導(dǎo)致抗氧化酶防御系統(tǒng)的有效性降低,使細(xì)胞對(duì)ROS敏感。而且有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在大鼠模型中長(zhǎng)時(shí)間低劑量MTX給藥會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腎損傷和腎MTX蓄積,且比短時(shí)間給藥更加嚴(yán)重[26]。

4.3.3MTX代謝產(chǎn)物積聚抑制正常代謝 MTX在體內(nèi)有部分通過(guò)胃腸道細(xì)菌代謝,而更多經(jīng)肝細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)化為谷氨酸鹽。超過(guò)90%的MTX以原形被腎臟清除,而少量MTX及其代謝產(chǎn)物能夠貯存于腎臟和肝臟等組織中長(zhǎng)達(dá)數(shù)月。經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)及腎小管分泌而形成的代謝產(chǎn)物7-羥基MTX溶解度較低,易形成結(jié)晶。尤其在酸性環(huán)境中,此時(shí)代謝產(chǎn)物7-羥基MTX和丹皮酸的溶解度比MTX低6～10倍。該藥及其代謝產(chǎn)物的濃度超過(guò)2×103mol·L-1時(shí)在酸性尿中(pH<5.5)沉積,尿液的pH從6.0增加到7.0會(huì)使其溶解度增加5到8倍,而在pH>7時(shí)其溶解度可增加10倍。在高劑量MTX治療時(shí),尿液中MTX及其代謝產(chǎn)物濃度容易超飽和,從而產(chǎn)生結(jié)晶堵塞腎小管,長(zhǎng)時(shí)間堵塞腎小管誘發(fā)腎功能障礙從而導(dǎo)致MTX消除延遲,由此引起的持續(xù)升高的血漿MTX濃度可能造成急性左心室衰竭和MTX其他毒性的顯著增強(qiáng)。而結(jié)晶破壞崩解產(chǎn)生大量尿酸經(jīng)腎臟排泄,在腎小管沉積引起腎小管功能損害,臨床上表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、尿少、氮質(zhì)血癥、尿毒癥等。

雖然體內(nèi)的細(xì)胞死亡會(huì)導(dǎo)致間質(zhì)炎癥,然而臨床研究顯示只有少量或沒(méi)有腎小管毒性和炎癥反應(yīng)的跡象。因此可以推測(cè),容量調(diào)節(jié)機(jī)制在影響MTX誘導(dǎo)的細(xì)胞腫脹后大量細(xì)胞死亡方面更重要。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期暴露于MTX后細(xì)胞死亡顯著增加,這表明如果MTX消除延遲,患者腎損害的風(fēng)險(xiǎn)增加。

4.3.5基因多態(tài)性 研究發(fā)現(xiàn)MTX的腎臟毒性與亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的基因多態(tài)性有關(guān),而且在臨床上相同劑量MTX治療不同個(gè)體時(shí)不良反應(yīng)輕重不同。MTHFR是人體葉酸代謝中的一個(gè)重要的酶,是葉酸代謝的核心。它能夠通過(guò)催化5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)換成5-甲基四氫葉酸鹽從而為Hcy提供甲基形成甲硫氨酸。MTX通過(guò)阻斷MTHFR將5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸來(lái)抑制DNA復(fù)制。而MTHFR具有兩種常見(jiàn)的功能多態(tài)性:C677T和A1298C。Suthandiram等[28]對(duì)馬來(lái)西亞71例接受MTX治療的成人血液惡性腫瘤患者的MTHFR C677T和A1298C基因多態(tài)性與MTX不良反應(yīng)相關(guān)性進(jìn)行的研究結(jié)果顯示,MHFR C677T和ABCB1 C3435T多態(tài)性似乎與更高的MTX血漿濃度相關(guān)(P<0.05)。C677T基因型被認(rèn)為與MTX腎臟毒性或骨髓抑制相關(guān),目前并無(wú)定論。

5 肺

5.1 MTX致肺損傷的臨床表現(xiàn)MTX能引起包括肺實(shí)質(zhì)炎癥、肺間質(zhì)炎癥、氣道高反應(yīng)、肺癌等多種肺損傷。臨床表現(xiàn)包括急性發(fā)作性呼吸困難;呼吸急促頻率>28次/min,伴干咳;發(fā)熱>38.0 ℃,大多數(shù)患者查體可聞及肺底部啰音[29]。

5.2 病理、生化改變肺部影像學(xué)表現(xiàn)常為彌漫性斑片狀雙側(cè)磨玻璃影,病理檢查提示彌漫性肺泡損傷和局灶性肺纖維化。

5.3MTX致肺損傷的機(jī)制

5.3.1直接細(xì)胞毒性 MTX可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷和凋亡,導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管屏障基底膜的完整性喪失。隨后肌成纖維細(xì)胞積聚、增殖,膠原沉積。

5.3.2細(xì)胞因子和p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路 p38 MAPK信號(hào)通路能被炎性細(xì)胞因子和環(huán)境應(yīng)激激活,從而引起自身免疫性疾病。在三種主要的MAPK途徑中,p38和JNK途徑與慢性炎癥有關(guān)。促炎和抗炎細(xì)胞因子是肺部炎癥中的重要介質(zhì)。其中抗炎細(xì)胞因子包括IL-4、IL-10和TGF-β,而IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6等是促炎因子。

MTX作為一種臨床免疫抑制劑,其免疫調(diào)節(jié)作用基于促炎和抗炎細(xì)胞因子水平之間的平衡,其中部分作用是能夠抑制純化T細(xì)胞中細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的產(chǎn)生。而且在Kim等[30]的研究中,MTX激活I(lǐng)L-1β的表達(dá),并依次誘導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)蛋白的磷酸化,包括TAK1、MKK3/MKK6、p38 MAPK、MAPK k2和HSP27。此外,HSP27激活可增加IL-8分泌,導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)。

綜上,MTX刺激了p38 MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)的成分(TAK1 → MKK3/MKK6 → p38 MAPK → MAPKK2 → HSP27)并促進(jìn)IL-1β和IL-8的釋放。此外,p38 MAPK介導(dǎo)的抗炎細(xì)胞因子IL-4途徑的抑制可能在MTX誘導(dǎo)的肺部炎癥中發(fā)揮作用。

6 討論

由于MTX對(duì)各器官毒性機(jī)制有所差異,而且個(gè)體差異性較大,因此可在臨床上將MTX與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用,以減少副作用的發(fā)生。例如在治療過(guò)程中密切監(jiān)測(cè)其血藥濃度,根據(jù)其變化及時(shí)調(diào)整四氫葉酸鈣(CF)解救方案,以期達(dá)到治療有效性的同時(shí)保證用藥安全性。同時(shí)也要視情況進(jìn)行充分的水化堿化治療、保肝治療、必要時(shí)給予輸注成分血制品以及感染發(fā)生時(shí)積極應(yīng)用抗生素治療。現(xiàn)有多項(xiàng)研究表明多種中藥成分對(duì)MTX不良反應(yīng)具有一定的治療效果。因此,完善MTX毒性作用機(jī)制的總結(jié),為其未來(lái)在臨床的合理用藥及與不同藥物的聯(lián)用提供新的思路與方向。