小細胞肺癌耐藥細胞的建立及生物學特性和多藥耐藥性鑒定

韓勇青,王正元,戴秀芬,王子冉,李 靜,2,戚 欣

(1. 中國海洋大學醫藥學院, 海洋藥物教育部重點實驗室, 山東 青島 266003;2. 青島海洋科學與技術國家實驗室-海洋藥物與生物制品實驗室, 山東 青島 266237)

小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)是一種高度轉移和頑固性的癌癥,具有進展迅速、早期轉移,易復發等特征[1]。目前,SCLC臨床治療以化療為主,一線標準治療為EP方案:順鉑(cisplatin, CDDP)或卡鉑和依托泊苷(etoposide, VP-16)聯合使用或IP方案(鉑類藥物與伊立替康聯合使用)。大多數患者雖然在一線標準治療方案后,產生較高的響應率,然而,高達75%的局部晚期SCLC患者和90%以上的轉移性疾病患者在2年內表現出進展性疾病,并最終產生化療耐藥[2]。二線拓撲異構酶I抑制劑治療的應答率顯著降低,總體低于20%[3],SCLC患者的中位生存期在診斷后僅為7～12個月。

耐藥性仍然是SCLC有效和準確治療的挑戰[4-5],然而SCLC確切的耐藥機制仍不清楚,因此建立與臨床治療相一致的SCLC耐藥細胞對于研究SCLC的耐藥機制及藥物治療具有重要意義。在本研究中,我們模擬SCLC的臨床一線治療方案,通過體內長期給藥誘導耐藥,進而獲得耐藥細胞,對其生物學特征及多藥耐藥性進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料NCI-H446細胞購自中國科學院上海細胞庫;胎牛血清,Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640購自美國Gibco公司;CDDP、VP-16購自美國TargetMol;阿霉素(doxorubicin, DOX)、 7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin, SN38) 購自美國MedChemExpress;細胞計數試劑盒-8 (Cell Counting Kit-8, CCK-8)購自中國翌圣生物科技(上海)股份有限公司;GAPDH、P-gp、ABCG2購自中國杭州華安生物技術有限公司;動物實驗所用BALB/C nu-nu小鼠購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,均為雄性,4周齡,體質量為14 g～16 g,實驗動物合格證號:SCXK(魯)2022 0006。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 NCI-H446/NC和NCI-H446/EP在添加10%胎牛血清、100 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養基中,37 ℃,5% CO2,飽和濕度的培養箱中培養。

1.2.2動物飼養 BALB/C-nude小鼠全程于 EVC鼠籠中飼養,每日12 h照明,恒定溫度 24±2 ℃,恒定濕度 40%～60%。

1.2.3SCLC耐藥細胞株的建立 擴增培養SCLC NCI-H446細胞,以3×106個/只皮下接種至BALB/C-nude 雄性裸鼠右前肢腋下,瘤體積長至約100 mm3時開始給予藥物處理。成瘤裸鼠隨機分為NCI-H446/EP給藥組(腹腔注射CDDP 3 mg·kg-1,一周1次;腹腔注射VP-16 4 mg·kg-1,一周3次),溶媒對照組(腹腔注射等體積溶劑,由10% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80、45%生理鹽水組成),每組5只。持續給藥,每周3次測量腫瘤體積和小鼠體質量,給藥組瘤體積長至1 000 mm3時處死裸鼠,剝取皮下腫瘤組織,研磨提取細胞,接種至培養瓶中,37 ℃,5% CO2條件下靜置30 min,收集上層未貼壁細胞繼續培養,經多次分離后獲得親本腫瘤細胞和耐藥腫瘤細胞,分別命名為NCI-H446/NC、NCI-H446/EP,擴增培養用于后續實驗研究。

1.2.4細胞形態觀察 NCI-H446/NC、NCI-H446/EP細胞,倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.2.5SRB法檢測細胞活力 收獲指數生長期的NCI-H446/NC、NCI-H446/EP細胞,以5×103/孔的數量種于96孔板中。加入相應藥物作用72 h后,用預冷的10%的TCA對細胞進行固定1 h以上,0.4% SRB染液避光染色15～30 min。1%的冰醋酸溶液沖洗后室溫晾干。Tris-base溶液加入后充分振蕩混勻,515 nm波長,讀取96孔板A515值。計算50%細胞存活的藥物濃度(IC50),耐藥指數(re-sistaneeindex, RI)(NCI-H446/EP細胞的IC50與NCI-H446/NC細胞的IC50比值)。

1.2.6CCK-8法檢測生長曲線與倍增時間(Td) 將NCI-H446/NC、NCI-H446/EP細胞分別接種于96孔板中,每孔1 000個細胞,37 ℃,5% CO2培養箱中培養0、24、48、72、96 h后,采用CCK-8法檢測A值,繪制細胞生長曲線。計算細胞倍增時間(doubling time,Td):Td = Δt× lg2/(lgAt - lgA0),其中N0是開始的A值,Nt是結束的A值,Δt是從A0到At的時間。

1.2.7流式細胞術檢測細胞周期 收集生長對數期的NCI-H446/NC和NCI-H446/EP細胞,PBS清洗后,加入預冷的75%冷乙醇,-20 ℃固定過夜,冷PBS清洗,加入50 g·L-1碘化丙啶和1.0 g·L-1RNase-A ,4 ℃避光孵育30 min,流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.2.8RT-PCR檢測MDR1基因表達 收獲對數生長期NCI-H446/NC、NCI-H446/EP細胞,用TRIzol試劑盒分離提取細胞中總RNA。互補DNA (cDNA)通過5 μg總RNA的逆轉錄獲得,保證細胞間cDNA含量一致。每個cDNA樣本用ExTaq進行擴增。使用Tab 1中的正向和反向引物對指示基因進行PCR反應。循環條件:94 ℃變性5 min,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,總PCR循環30次,最終在72 ℃延伸10 min。每個擴增的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳測定。PCR結果在分子成像儀ChemiDoc XRS系統下觀察并拍照記錄。

Tab 1 Primers used for RT-PCR analysis

1.2.9Western blot檢測耐藥蛋白及耐藥相關分子表達 收集細胞,PBS清洗,加入Loading buffer于冰上裂解細胞。細胞裂解液經電泳后轉印至硝酸纖維素膜上,1×蛋白封閉液中室溫下封閉15 min,加入相應的一抗4 ℃下孵育過夜。清洗后,用辣根過氧化物酶偶聯二抗室溫孵育1 h,電化學發光顯影。使用ImageJ軟件統計灰度值。以靶蛋白/磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的比值來顯示靶蛋白的相對表達量。

1.2.10耐藥細胞株體內耐藥性 將NCI-H446/EP細胞以3×106個/只接種至Balb/c-nude裸鼠腋下,在腫瘤體積達到100 mm3時隨機分為 NCI-H446/EP給藥組(腹腔注射,CDDP,3 mg·kg-1,一周1次;腹腔注射,VP-16,4 mg·kg-1,一周3次),對照組(等體積溶劑:10% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80、45%生理鹽水),每組5只。每周3次測量腫瘤體積,記錄小鼠體質量。對照組腫瘤體積達到1 000 mm3時,結束實驗,處死小鼠,剝取瘤組織稱質量。

2 結果

2.1 NCI-H446 裸鼠移植瘤產生體內耐藥將SCLC NCI-H446皮下接種至裸鼠體內,構建人源性組織異種移植(patient-derivedxenografts, PDX)模型,按照SCLC臨床EP治療方案給予治療,給藥3周內,腫瘤對化療藥物敏感,瘤體積明顯減小。第4周后,腫瘤開始逐漸恢復生長,生長速度加快,呈現與對照組相同的生長趨勢(Fig 1),提示藥物敏感性降低。給藥組瘤體積長至1 000 mm3時處死裸鼠,剝取皮下腫瘤組織,研磨獲得細胞懸液,經多次分離后獲得腫瘤細胞,命名為NCI-H446/EP,擴增培養用于后續實驗研究。

Fig 1 Establishment of chemoresistant SCLC xenograft

2.2 細胞形態倒置顯微鏡下觀察NCI-H446/NC細胞大小均勻,呈鋪路石樣,胞漿核仁清晰。NCI-H446/EP細胞相較親本細胞,體積大小不一,形狀扁平,多有突起,細胞核和細胞質明顯增大,核仁多(Fig 2)。

Fig 2 Morphology of NCI-H446/NC and NCI-H446/EPcells in exponential growth phase

2.3 NCI-H446/EP耐藥指數(RI)SRB法檢測CDDP、VP-16以及肺癌常用化療藥物SN-38和DOX對NCI-H446/NC、NCI-H446/EP的細胞毒性,計算IC50值和RI(Tab 2)。結果表明,NCI-H446/EP對CDDP、VP-16產生了較強的耐藥性,同時對SN-38、DOX也產生了交叉耐藥性。

2.4 細胞生長曲線與倍增時間(Td)采用CCK-8法檢測NCI-H446/NC、NCI-H446/EP細胞活性,以培養時間為x軸,以OD450值為y軸。繪制細胞生長曲線(Fig 3)。計算NCI-H446/NC和NCI-H446/EP細胞的Td分別為31.71±0.75 h和42.67±0.05 h,NCI-H446/EP細胞生長速度明顯低于其親本細胞(P<0.01)。

Tab 2 Drug sensitivity of NCI-H446/NC and

Fig 3 Growth curves of NCI-H446/NC and

2.5 流式細胞術分析細胞周期流式細胞術檢測NCI-H446/NC、NCI-H446/EP細胞周期分布。如Fig 4所示,與NCI-H446/NC細胞相比,NCI-H446/EP細胞G0/G1期比例增加,G2/M期細胞減少。

2.6 多藥耐藥基因和蛋白的表達RT-PCR檢測表明,多藥耐藥細胞NCI-H446/EP中MDR1的mRNA水平明顯高于NCI-H446/NC細胞(Fig 5、6)。Western blot結果表明,ABC轉運蛋白家族P-gp在NCI-H446/EP細胞高表達,與RT-PCR結果一致,而ABCG2表達沒有明顯升高。

2.7 動物體內耐藥性為評價所構建耐藥細胞在動物體內是否也具有耐藥性,進一步構建了NCI-H446/EP體內移植瘤模型,給予EP方案治療。給藥兩周內,給藥組小鼠腫瘤體積、腫瘤質量與對照組相比均無差異(P>0.05),此外,給藥組小鼠體質量與對照組相比也無差異(P>0.05)(Fig 7),說明H446/EP體內移植瘤對CDDP、VP-16具有耐藥性,進而驗證耐藥細胞構建成功。

3 討論

近30年來,SCLC的治療進展緩慢,鮮有突破,面臨“藥荒”的尷尬局面。近年來一些靶向治療或免疫療法應用于SCLC[6],雖然取得了一些進展,但是SCLC的治療選擇和總體生存率在近三十年來幾乎保持不變。目前認為MDR是導致SCLC對化療產生耐藥的主要原因[7-8],但是SCLC的確切耐藥機制尚不明確,因此,耐藥細胞模型的建立對于耐藥機制及抗耐藥治療策略的研究具有重要意義。傳統耐藥細胞模型多采用體外大劑量反復間歇誘導聯合逐級增加劑量法,但無法達到體內外百分百轉化,細胞可能在動物體內無法成瘤,或者體內耐藥性差,與臨床用藥不完全相符,不能模擬實際的體內耐藥產生過程。為更真實模擬臨床實際,本研究采用臨床標準治療方案給予小鼠CDDP和VP-16處理,經多次給藥誘導SCLC產生耐藥,再分離獲得耐藥細胞NCI-H446/EP。該方法獲得的耐藥細胞對CDDP、VP-16、SN-38、DOX均有一定的程度的耐藥。將該細胞接種至裸鼠體內,所形成的的皮下移植瘤也對CDDP、VP-16產生耐藥性。該細胞系與親本細胞相比體積變大,形狀扁平,多有突起,具有間充質細胞的特征,這與獲得性耐藥背景下誘導的譜系可塑性一致[9]。此外,所獲得的NCI-H446/EP增殖速度變慢,細胞周期分布比例發生明細變化,符合具有多藥耐藥特征。

Fig 4 Cell cycle distribution and statistical

Fig 5 RT-PCR analysis of NCI-H446/NC and NCI-H446/EP cells

Fig 6 Diffe rential expression of drug-resistant proteins

Fig 7 Tumor growth kinetics of SCLC chemoresistant xenograft models in response to E/P

有研究表明,MRP1和 P-gp是兩種ABC外排轉運蛋白,與多藥耐藥(MDR)密切相關[10-11]。本研究中,耐藥細胞NCI-H446/EP的MDR1在mRNA和蛋白水平均明顯高于親本細胞,同時,耐藥細胞P-gp表達也明顯升高。其中,P-gp作為一種跨膜蛋白,導致化療藥物從癌細胞中的外排增加,化療藥物療效降低,無法正常抑制耐藥細胞生長。

總之,本研究建立了NCI-H446/EP耐藥SCLC細胞系,在體內體外均具有多藥耐藥性,為后續深入探究SCLC耐藥機制以及抗SCLC藥物研發提供了實驗模型。