白毛夏枯草水提取物對胃癌細胞增殖、凋亡的影響

潘慶華 魏文斌 曾莉蓉 朱淑云 譚遠忠

(恩施土家族苗族自治州中心醫院脾胃病科,湖北 恩施 445000)

胃癌是起源于胃黏膜的惡性腫瘤,是全球第四常見的惡性腫瘤,同時也是全球癌癥相關死亡的第三大原因〔1,2〕。世界范圍內胃癌患者總生存率約為25%,確診時處于疾病晚期、出現轉移、高腫瘤內異質性和化療耐藥性等均可導致患者總體預后不佳〔3,4〕。手術聯合放化療是胃癌的主要治療手段,處于ⅠA和ⅠB期的患者術后5年生存率為60%～80%,但胃癌早期缺乏特異性癥狀,多數患者確診時已處于胃癌晚期,可能存在遠處轉移,導致治療效果不佳,預后較差〔5〕。隨著治療方法的進步、新輔助治療和靶向藥物的應用,胃癌患者預后得到了一定的改善,但患者總生存率仍不理想,臨床上仍缺乏較為理想的胃癌治療藥物,亟需尋找針對胃癌具有良好療效的治療藥物〔6〕。研究表明,中藥治療胃癌可減輕毒副作用,提高治療效果,緩解化療后的不良反應,還可健脾祛邪,扶正補虛,有助于抑制胃癌患者術后復發轉移,改善患者生存狀況〔7〕。白毛夏枯草又名筋骨草,主要化學成分包括皂苷、黃酮、植物甾酮、環烯醚萜、生物堿等,可用于治療支氣管炎、急慢性咽炎、扁桃體炎、肺炎、跌打損傷等。藥理研究表明,白毛夏枯草具有調節免疫抗腫瘤、抗纖維化、抗菌、抗炎等多種生物學活性〔8,9〕。研究顯示,白毛夏枯草水提取物可通過抑制肝癌細胞增生及肝癌血管增殖、誘導肝癌細胞凋亡、加速肝癌細胞分化發揮抗腫瘤作用〔10〕。目前尚未見白毛夏枯草抑制胃癌發生發展的相關報道,因此本研究旨在觀察白毛夏枯草水提取物對胃癌BGC823細胞增殖、凋亡的影響,為胃癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器 人胃癌細胞株BGC823購自中國科學院細胞庫,CCK-8試劑盒(貨號:40203ES60)、膜聯蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:40302ES20)均購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司,兔抗人基質金屬蛋白酶(MMP)-2單克隆抗體(貨號:ab92536)、兔抗人MMP-9單克隆抗體(貨號:ab76003)、兔抗人凋亡蛋白B淋巴細胞瘤(Bcl)-2單克隆抗體(貨號:ab32124)、兔抗人Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體(貨號:ab32503)、兔抗人髓細胞白血病因子(Mcl)-1單克隆抗體(貨號:ab32087)、兔抗人剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3單克隆抗體(貨號:ab32042)及兔抗人GAPDH多克隆抗體(貨號:ab9485)均購自艾博抗(上海)貿易有限公司。流式細胞儀(型號:Attune NxT)、酶標儀(型號:FC)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2白毛夏枯草水提取物的制備 干燥白毛夏枯草全草5 g,采用蒸餾水進行萃取,100 ℃加熱6 h后過濾,濃縮至1 g生藥/ml,過濾除菌后,4 ℃冰箱保存備用。

1.3細胞培養 采用含青鏈霉素雙抗混合液及10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養胃癌BGC823細胞,培養條件為95%飽和濕度、5%CO2、37 ℃,每天換液,待細胞融合度至80%以上時,采用0.25%胰蛋白酶消化,根據實驗需要傳代。以下實驗均采用對數生長期細胞。

1.4CCK-8法檢測各組細胞活性 將BGC823細胞以4×104個/ml接種于96孔板,恒溫培養箱中(5%CO2、37 ℃)培養24 h后,設置對照組、實驗組。對照組不加白毛夏枯草水提取物,實驗組分別給藥不同濃度白毛夏枯草水提取物,使其終濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml(分別為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml組),培養48 h,每組設6個復孔。向各孔加入10 μl CCK-8及100 μl培養基,培養2 h(5%CO2、37 ℃)。酶標儀測量各孔490 nm處吸光值,計算增殖抑制率=(1-實驗組/對照組)×100%。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集經不同濃度白毛夏枯草水提取物處理24 h的BGC823細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次,棄上清,加入Annexin Ⅴ結合緩沖液制備成細胞終濃度為1×106個/ml的細胞懸液并取其中100 μl,加入Annexin Ⅴ-FITC結合物5 μl,避光、室溫孵育30 min,加入PI溶液5 μl,避光、室溫孵育10 min,于流式細胞儀中檢測各組BGC823細胞凋亡率。重復3次,取均值。

1.6Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 細胞遷移:將各組BGC823細胞調整為1×104個/ml的細胞懸液,取100 μl加入Transwell小室上室,下室加500 μl含250 g/L胎牛血清的培養液,培養24 h(37 ℃、5%CO2)后,4%多聚甲醛固定15 min,0.5%結晶紫染色。細胞侵襲:于Transwel小室上室(鋪40 μl基質膠)中加入500 μl細胞重懸液,下室加500 μl含250 g/L胎牛血清的培養液,37 ℃、5%CO2培養24 h,取出上室,多聚甲醛固定下室細胞15 min,0.5%結晶紫染色。隨機選擇5個視野,高倍鏡下觀察各組BGC823細胞遷移、侵襲情況,記錄穿膜細胞數,分別記為細胞遷移數、細胞侵襲數。

1.7Western印跡法檢測MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、Mcl-1及Cleaved Caspase-3蛋白表達 收集各組BGC823細胞,提取細胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。各組分別取50 μg蛋白,行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜后,脫脂奶粉(50 g/L)封閉1 h,TBST洗膜,加入相應一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,加入二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜,加入電化學發光(ECL)顯色液顯影,檢測BGC823細胞中MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、Mcl-1及Cleaved Caspase-3蛋白表達,結果以與內參的比值表示,GAPDH為內參。

1.8統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1白毛夏枯草水提取物對BGC823細胞增殖的影響 BGC823細胞增殖抑制率隨白毛夏枯草水提取物濃度的增加顯著升高,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 白毛夏枯草水提取物對BGC823細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

2.2白毛夏枯草水提取物對BGC823細胞凋亡的影響 BGC823細胞凋亡率隨白毛夏枯草水提取物濃度的增加顯著升高,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 白毛夏枯草水提取物對BGC823細胞凋亡的影響

2.3白毛夏枯草水提取物對BGC823細胞遷移的影響 BGC823細胞遷移數隨白毛夏枯草水提取物濃度的升高而顯著減少,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 白毛夏枯草水提取物對BGC823細胞遷移、侵襲的影響(結晶紫染色,×200)

2.4白毛夏枯草水提取物對BGC823細胞侵襲的影響 BGC823細胞侵襲數隨白毛夏枯草水提取物濃度的升高而顯著減少,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1、圖2。

2.5白毛夏枯草水提取物對BGC823細胞MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、Mcl-1及Cleaved Caspase-3蛋白表達影響 隨著白毛夏枯草水提取物濃度升高,BGC823細胞MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Mcl-1蛋白水平依次降低,Bax及Cleaved Caspase-3蛋白水平依次升高,呈顯著濃度依賴性(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 白毛夏枯草水提取物對BGC823細胞MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、Mcl-1及Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響

3 討 論

白毛夏枯草可在多種疾病中發揮不同作用。研究發現,筋骨草可改善小鼠的氣道炎癥,治療效果隨劑量增多而提高,可能通過調控腸道菌群、增加擬桿菌數量,促進白細胞介素-10的釋放發揮治療作用〔11〕。Zhang等〔12〕研究表明,白毛夏枯草的活性成分能減輕金黃色葡萄球菌引起的肺病理形態學損傷,保護肺血氣屏障,提高金黃色葡萄球菌感染小鼠的存活率,可能通過抑制核因子(NF)-κB信號通路發揮上述作用。Sawada等〔13〕研究發現,白毛夏枯草提取物可減少兔軟骨中的破骨細胞數量,刺激軟骨基質再生,可與氨基葡萄糖協同改善軟骨損傷。姜瓊等〔14〕分析不同白毛夏枯草提取物對肝癌細胞的作用,結果顯示,水提取物、乙酸乙酯萃取物及醇提物均可抑制肝癌細胞增殖,可能通過抑制Bcl-2表達、促進Bax水平發揮抑癌作用。本研究結果顯示,白毛夏枯草水提取物可抑制BGC823細胞增殖,誘導BGC823細胞凋亡,并抑制BGC823細胞遷移、侵襲能力,且上述作用隨著白毛夏枯草水提取物濃度的增加而增強,與文獻〔5,14〕的研究結果相似,提示白毛夏枯草水提取物可在胃癌中發揮抗腫瘤作用。

MMPs家族可降解細胞外基質中的蛋白成分,影響腫瘤細胞轉移和侵襲,MMP-2、MMP-9是MMPs家族重要的蛋白水解酶,二者在腫瘤新生血管形成、降解基底膜、腫瘤細胞轉移和侵襲過程中發揮作用〔15〕。Bcl-2、Bax及Mcl-1均為Bcl-2家族蛋白,Bcl-2為抗凋亡基因,Bax及Mcl-1為促凋亡基因,三者均在細胞凋亡過程中發揮重要作用〔16〕。Caspase3為Caspase家族成員,是凋亡過程中的效應蛋白,處在Caspase級聯反應下游,正常情況下Caspase3無活性,Caspase3可被多種刺激信號激活,導致胞核、胞質及細胞骨架的重要蛋白降解失活,細胞凋亡進入不可逆的階段〔17〕。本研究結果顯示,隨著白毛夏枯草水提取物濃度的增加,BGC823細胞Bax及Cleaved Caspase-3蛋白水平依次升高,MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Mcl-1蛋白水平依次下降,均呈濃度依賴性,提示白毛夏枯草水提取物可能通過抑制細胞遷移和侵襲,誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤作用。

綜上,白毛夏枯草水提取物可能通過增加Bax、Cleaved Caspase-3水平,降低MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Mcl-1水平,進而抑制胃癌細胞增殖、遷移及侵襲能力,促進胃癌細胞凋亡,發揮抗胃癌作用。